NOVA Gel TM Scl-70 S Para Diagnóstico In Vitro
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- Raul Sales Viveiros
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1 NOVA Gel TM Scl-70 S Para Diagnóstico In Vitro Aplicação Diagnóstica NOVA Gel TM Scl-70 é um sistema de teste de difusão dupla para o rastreio e determinação semiquantitativa de auto-anticorpos para Scl-70, um antigénio nuclear extraível (ENA), em soro humano. A presença de anticorpos para Scl-70 pode ser usada em conjunto com outros testes serológicos e descobertas clínicas para ajudar no diagnóstico de escleroderma. Resumo e Explicação do teste O termo "Anticorpos antinucleares" (ANA) descreve uma diversidade de auto-anticorpos que reagem com constituintes do núcleo de células, incluindo DNA, RNA e várias proteínas e ribonucleoproteínas. 1 Estes auto-anticorpos ocorrem com elevada frequência em doentes com doenças do tecido conjuntivo ou reumáticas, especialmente SLE. Virtualmente todos os doentes de SLE são ANA positivos. Esta sensibilidade do diagnóstico conduziu à incorporação dos testes de ANA nos Critérios Revistos de 1982 para a Classificação do Lúpus Eritematoso Sistémico por uma subcomissão da Associação de Artrite e Reumatismo. 2 Enquanto o teste ANA é um teste de rastreio excelente para SLE (um resultado negativo exclui virtualmente o SLE activo 3 ) não é de modo algum um teste específico. A tendência actual para diagnosticar e gerir doenças do tecido conjuntivo é combinar um teste de rastreio sensível de ANA com testes de seguimento mais específicos tais como dsdna e/ou ENA. Os testes de ENA são especialmente importantes visto que eles fornecem tanto informações de diagnóstico como de prognóstico. Os anticorpos para Scl-70 são um marcador específico para escleroderma, 2,4 tanto quanto os anticorpos para Sm e DNA nativo são auto-anticorpos marcadores específicos para SLE. O anticorpo Scl-70 é encontrado em 20-60% do doentes com escleroderma. 2,4,5,6 A vasta gama na frequência relatada de anticorpo Scl-70 pode ser devida a diferenças na sensibilidade do ensaio. 7 Quando os doentes com escleroderma são divididos naqueles com a variante mais benigna do Síndroma de CREST e a mais grave escleroderma sistémica difusa ou progressiva, os anticorpos Scl-70 são considerados ser mais predominantes em doentes com escleroderma difusa (>70%) comparados com o grupo de doença mais benigna. 6,8 Princípio do Procedimento O teste de dupla difusão, descrito por Ouchterlony, 9 permite que uma solução de antigénio se difunda passivamente através de uma matriz de suporte de gel em direcção a uma amostra e/ou controlo contendo anticorpo. Os poços, com forma especial, fixados na matriz de gel, funcionam como reservatórios a partir dos quais as soluções de antigénio e de anticorpo difundem em direcção uma da outra. No ponto de equivalência antigénio-anticorpo, forma-se no gel uma linha visível de precipitação. O estado imunológico de um doente pode então ser determinado através da observação de padrões de linhas de precipitação adjacentes formadas no gel por uma amostra controlo, de especificidade conhecida, e por um soro desconhecido de um doente. A técnica de dupla difusão pode ser usada com uma preparação purificada de Scl-70, uma amostra controlo de auto-anticorpos Scl-70 conhecida e um soro de um doente suspeito de conter autoanticorpos Scl-70 para mostrar identidade imunológica, não identidade ou identidade parcial. A confirmação de actividade de auto-anticorpos Scl-70 no soro do doente pode ser feita se a sua linha de precipitação combinar caracteristicamente com a linha formada por uma amostra controlo conhecida. 1
2 O procedimento correcto de teste de dupla difusão requer o ensaio de razões de concentração de antigénio/anticorpo múltiplos, de forma a impedir o excesso de antigénio ou de anticorpo. A formação de uma linha de precipitação incorrecta ou ilusória pode ocorrer devido ao excesso de antigénio ou de anticorpo. Para evitar isto, as diluições do soro do doente deverão ser ensaiadas em comparação com a mesma preparação de antigénio. As placas NOVA Gel S foram concebidas para facilmente executar este requisito. Os poços hexagonais grandes são dimensionados para conter a concentração de 1:1 ou do soro não diluido do doente ou dos controlos. Os poços rectangulares pequenos, devido ao seu design, fazem automaticamente uma diluição aproximada de 1:4 da amostra não diluida do doente. Composição do Dispositivo 1. Placas de gel de rastreio NOVA Gel S com 7 poços cada, contendo estabilizadores e 0,09% de azida de sódio 2. 0,4 ml de antigénio Scl-70 (de timo de vitelo), liofilizado em tampão, contendo estabilizadores e 0,09% de azida de sódio 3. 1,4 ml de controlo Scl-70, soro humano contendo auto-anticorpos para Scl-70 em tampão contendo 0,09% de azida de sódio Advertências 1. Todo o material de origem humana usado na preparação de controlos para este produto foi testado e considerado negativo para anticorpos anti HIV, HBsAg, e HCV pelos métodos aprovados pela FDA. No entanto, nenhum teste pode garantir segurança total em relação à ausência de HIV, HBV, HCV ou de outros agentes infecciosos. Assim, o Controlo Sm e o Controlo RNP deverão ser manuseados como material potencialmente infeccioso A Azida de Sódio é usada como um conservante. A Azida de Sódio é um veneno e pode ser tóxica se for ingerida ou absorvida através da pele ou dos olhos. A azida de sódio pode reagir com chumbo ou com canalizações de chumbo para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Lave as bacias, se forem usadas para despejar reagentes, com grandes volumes de água para impedir a formação de azida. 3. Use equipamento de protecção pessoal apropriado enquanto trabalhar com os reagentes fornecidos. 4. Os reagentes derramados deverão ser limpos imediatamente. Cumpra todos os regulamentos ambientais federais, estatais e locais quando descartar detritos. Precauções 1. Este produto é para Uso de Diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo, por componentes diferentes dos fornecidos neste sistema pode conduzir a resultados inconsistentes. 3. É recomendado que água estéril destilada ou desionizada seja usada para re-hidratar o antigénio. 4. Uma variedade de factores influencia o desempenho do ensaio. Estes incluem a temperatura de início dos reagentes, prevenir o enchimento excessivo dos poços com reagentes ou amostras dos doentes e a qualidade da água usada para re-hidratar o antigénio. Deverá ser prestada uma atenção cuidadosa à consistência para obter resultados precisos e reprodutíveis. 5. É recomendado um cumprimento rigoroso do protocolo. 2
3 Condições de Armazenamento Armazene todos os reagentes a 2-8 C. Não congele. Os reagentes ficam estáveis até à data de validade quando armazenados e manuseados conforme indicado. Após re-hidratado, o antigénio é estável durante 2 semanas a 2-8 C. Se for desejado, alíquotas de 100 μl de antigénio podem ser preparadas e armazenadas a < -70 o C. O antigénio armazenado nesta forma é estável durante pelo menos 1 ano. Colheita de Amostras Este procedimento deverá ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras podem afectar negativamente os resultados. Amostras com contaminação microbiana, tratadas termicamente ou contendo partículas visíveis não deverão ser usadas. As amostras de soro com hemólise macroscópica ou altamente lipémica deverão ser evitadas. Após colheita, o soro deverá ser separado do coágulo. O Documento H18-A2 da NCCLS recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Armazene as amostras à temperatura ambiente durante um período não superior a 8 horas. 2) Se o ensaio não estiver concluido dentro de 8 horas, guarde a amostra a 2-8 C. 3) Se o ensaio não for efectuado em 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congele a -20 C ou a temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem misturadas após descongelação e antes do teste. Procedimento Material fornecido 8 placas de rastreio NOVA Gel "S" 2 0,4 ml de antigénio Scl-70, liofilizado 1 1,4 ml de controlo Scl-70 Material Necessário Não Fornecido Micropipetas de μl de volume Pontas descartáveis para micropipetas Solução salina 0,85% Água destilada ou desionizada (preferencialmente estéril) Fonte de luz ou caixa de visualização de gel Método Antes de começar 1. Re-hidratar o Antigénio Scl-70 Abra cuidadosamente um frasco de antigénio e adicione 0,4 ml de água destilada ou desionizada para o antigénio liofilizado. A água estéril destilada ou desionizada é recomendada para um desempenho óptimo do produto. Deixe que o antigénio re-hidratado descanse durante 5 minutos, depois agite para misturar completamente antes de usar. 3
4 2. Encher a Placa de Gel Encha a placa de gel com antigénios e controlos (aproximadamente 80 μl por poço grande) conforme ilustrado abaixo. Cada amostra de um doente deve ser colocada tanto num poço hexagonal maior (aproximadamente 80 μl) como num poço rectangular mais pequeno (aproximadamente 20 μl) conforme o esquema. Os volumes exactos de enchimento não são críticos; no entanto, NÃO ENCHA EXCESSIVAMENTE OS POÇOS. Os poços de controlo podem ser enchidos directamente com frascos de pressão de plástico ou micropipetas. Se usar os frascos de pressão, coloque a ponta distribuidora no poço e aperte suavemente até o nível de líquido se aproximar do cimo do poço. Cubra a placa imediatamente após encher. Nota: O volume mais pequeno do poço rectangular reduz a concentração local do anticorpo do doente SEM NECESSITAR DE UM PASSO DE DILUIÇÃO DE AMOSTRA. A diluição efectiva do poço pequeno é de aproximadamente 1:4. Isto diminui a hipótese de um resultado falso negativo devido ao excesso de anticorpo. 3. Incubação Deixe que a(s) placa(s) coberta(s) faça(m) incubação à temperatura ambiente numa superfície estável, plana durante 24 horas. Inspeccione a(s) placa(s) e anote quaisquer linhas de precipitação que se formem entre a amostra do doente e o antigénio. Examine a relação desta linha com qualquer linha de precipitação do controlo. Reinspeccione a(s) placa(s) novamente às 48 horas para verificar a existência de quaisquer linhas desenvolvidas recentemente antes da interpretação final dos resultados. Controlo de Qualidade Os Controlo Scl-70 deverão ser corridos em todas as placas para assegurar que todos os reagentes e procedimentos foram efectuados correctamente. Outros soros de controlo adequados adicionais podem ser preparados aliquotando amostras de soro humano combinado e armazenando a < -70 o C. De forma a que os resultados do teste sejam considerados válidos, uma linha de precipitação deve estar visível entre os Controlo Scl-70 e os poços de antigénio de Scl-70. Interpretação de Resultados Para uma observação óptima das linhas de precipitação são recomendados os seguintes procedimentos: 1. Remova a tampa da placa. 2. Segure a placa numa posição que minimize o reflexo na superfície do gel. 3. Ilumine a placa do gel lateralmente (i.e. paralela à superfície do gel). Nota: Certifique-se de que a fonte de luz está protegida da vista directa. 4. As linhas de precipitação vêem-se melhor quando existe contraste com um fundo escuro e vistas de um ângulo. 5. Um amplificador pode ajudar na observação de linhas ténues ou para distinguir a não identidade de amostras. 4
5 Reacção Negativa. Uma amostra é considerada negativa se não se formarem linhas de precipitação visíveis entre os poços do doente e o poço do antigénio após 48 horas. Interpretação de Especificidade. Na dupla difusão, a especificidade é determinada anotando a relação das linhas de precipitação da amostra com as linhas de controlo conhecidas. Podem ocorrer as seguintes possibilidades com o teste NOVA Gel TM Scl-70: Fig. 1: Não Identidade Fig. 2: Identidade Scl-70 A linha de precipitacção do doente 1 atravessa ou apresenta não identidade com ambos os controlo Scl-70. Isto indica que o doente reage com um antigénio ENA diferente do Scl-70. A linha de precipitação do doente 1 combina ou apresenta identidade com a linha de controlo Scl-70. Neste caso o doente tem auto-anticorpos para Scl-70. Limitações do Procedimento 1. As linhas de precipitação múltiplas podem tornar a interpretação dos resultados difícil. Nestes casos, recomenda-se que faça um novo teste da amostra numa diluição de 1:2 ou de 1:4 em solução salina, colocando cada diluição num poço hexagonal e num poço rectangular mais pequeno. Isto resulta numa diluição de 1:8 ou de 1:16 respectivamente no poço rectangular mais pequeno. A diluição da amostra pode eliminar as linhas mais fracas ou separar as linhas de forma a que a interpretação seja mais fácil. 2. Embora não seja provável com este teste devido à geometria única do poço, o prozoneamento é uma possibilidade. O prozoneamento ocorre quando uma enorme quantidade de auto-anticorpos do doente está presente em relação ao antigénio (excesso de anticorpo), fazendo com que a linha de precipitação se forme na face do poço de antigénio. Nestes casos, são recomendados novos testes de possíveis amostras positivas numa diluição de 1:2 ou de 1:4 em solução salina para impedir uma interpretação falsa negativa do teste. 3. Se for usada água não estéril ou contaminada para re-hidratar o antigénio, o antigénio pode sofrer degradação imediata ou progressiva. Neste caso pode resultar uma linha de precipitação muito leve ou nenhuma linha. 4. Os resultados deste ensaio deverão ser usados em conjunto com descobertas clínicas e outros testes serológicos. 5. As características de desempenho do ensaio não foram estabelecidas para matrizes diferentes das do soro. 5
6 Valores Esperados O teste de dupla difusão NOVA Gel TM Scl-70 foi usado para avaliar doentes com várias doenças do tecido conjuntivo bem como 200 dadores aleatórios de sangue. Os resultados são os seguintes: Grupo de Doente Número Número Positivo Teste NOVA Gel ENA Scl-70 Positivo SLE Lúpus Induzido por Medicamento 24 0 Artrite Reumatóide 40 0 Escleroderma Dermatomiosite 14 0 Síndroma de Sjogren 14 0 Normais
7 Referências 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan E, et. al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Catoggio LJ, et al. Serological Markers in progressive systemic sclerosis. Clinical Correlations, Annals of the Rheumatic Diseases 42:23-27, Takehara K, Moroi Y, Ishibasi Y. Antinuclear antibodies in the relatives of patients with systemic sclerosis. Br J Dermatol 112:23, Jarzabek-Chorzelska M, Blaszczyk M, Jablonska S, Chorzelski T, Kumar V, Beutner E. Scl-70 antibody-a specific marker of systemic sclerosis. Br J Dermatol 115: , Kumar V et al. A standardized method of detecting antibodies to extractable nuclear antigens (RNP and Sm) by gel precipitation. J Clin Lab Immunol 15: , Stein V, et al. Clinical Correlations and Prognosis Based on Serum Autoantibodies in Patients with Systemic Sclerosis. Arthritis and Rheumatism 31:2, Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service PRT November 2009 Revision 12 7
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