QUANTA Lite TM Chromatin ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada

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1 QUANTA Lite TM Chromatin ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica O QUANTA Lite TM Chromatin é um ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção semi-quantitativa de anticorpos anti cromatina no soro humano. A presença de anticorpos anti cromatina pode ser utilizada em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes de laboratório para ajudar no diagnóstico de lúpus induzido por medicamentos (DIL) e Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE). Resumo e Explicação do teste A cromatina é naturalmente encontrada no núcleo das células. É composta por DNA nativo enrolado em volta do (H2A-H2B-H3-H4) 2 octâmero de histona, com histona H1 e algumas proteínas não-histona associadas. Os autoanticorpos anti cromatina foram testados por várias técnicas incluindo o teste LE celular 1, imunoprecipitação 2, imunofluorescência de histonas reconstituídas após extracção das células por ácido 3, e ELISA. 4,5 Estes anticorpos foram detectados predominantemente em indivíduos com SLE, 3,6,7,8 DIL, 9,10 e ocasionalmente em indivíduos com outras doença. 11 Os anticorpos anti cromatina também são conhecidos como anti-nucleosoma 5,8,11, anti-(h2a-h2b) DNA 9,13, anti-dnp 3,4, e factor LE-célular 1,11. Uma das principais utilizações deste teste é ajudar a diagnosticar o DIL. Os anticorpos anti histonas e anti cromatina foram detectados em doentes com lúpus induzido por procainamida. 9,12,13 No entanto, os anticorpos anti-histona também foram detectados em doentes que estão a tomar procainamida mas são assintomáticos para os sintomas proprios de lúpus. 9,13 Ao contrário, os anticorpos anti cromatina foram detectados com muito menor frequência e em menor título nestes doentes assintomáticos. 9,13 Adicionalmente, os doentes com lúpus induzido por medicamentos como a quinidina, penicilamina, metildopa e acebutalol apresentam anticorpos anti-cromatina e não anticorpos anti-histona. 9,10 Assim, de acordo com estes relatórios publicados, a anti-cromatina é mais sensível e mais específica para o lúpus induzido por medicamentos do que a anti-histona. Curiosamente, os anticorpos anti-cromatina foram detectados em indivíduos que tomaram procainamida algum tempo antes dos sintomas de lúpus se terem desenvolvido. 13 Vários estudos que utilizam o cromatina ELISA descobriram que cerca de 50% a 90% dos doentes SLE têm anticorpos anti-cromatina. 6,7,8 Esta é a mesma percentagem dos doentes com resultados positivos para LE celular. 14 Em geral, existem mais doentes SLE com resultados positivos para os anticorpos anti-cromatina do que para os anticorpos anti-histona ou anti-dna. 6,7,8,11,14 A presença de anticorpos anti-cromatina também está ligada à proteinúria em doentes SLE. 1 Os anticorpos cromatina são direccionados para epítopos constituídos pelo complexo histona-dna nativo, DNA nativo e as regiões de histonas expostas na cromatina. 7,9,11 Assim, os anticorpos anti-ndna são um subconjunto da anti-cromatina. No entanto, alguns anticorpos anti-histona são direccionados contra epítopos em histonas desnaturadas que não estão expostas na cromatina. 11 Princípio do método Cromatina altamente purificada de timo de novilho constituída por DNA envolvido em volta do núcleo do octâmero de histona (H2A-H2B-H3-H4) 2 é revestida nos poços de uma placa de micropoços. As histona H1 e as proteínas não-histona foram retiradas da cromatina durante o processo de purificação. Os controlos pré-diluídos e o soro diluído dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos Cromatina presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG anti-humano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controlo. Reagentes 1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno revestidos com antigénios de Cromatina purificados (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos anti Cromatina, pré-diluído, 1,2 ml 3. Positivo Baixo ELISA Cromatina, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti Cromatina, pré-diluído, 1,2 ml 4. Positivo Alto ELISA Cromatina, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti Cromatina, pré-diluído, 1,2 ml 5. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor-de-rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 6. Solução de Lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 7. Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humana, 1 frasco de cor azul com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 1

2 8. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 9. Solução de Paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo Baixo de cromatina ELISA, o Positivo Alto de cromatina ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O Conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O Cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 6. A Solução de Paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a aspiração insuficiente dos líquidos dos poços ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de Conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do Conjugado HRP para evitar estas ocorrências. 9. A contaminação química do Conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação do Conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras dos micropoços revestidas com antigénios que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8º C. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C. Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados. 2

3 Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A2 da NCCLS recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. Procedimento Material fornecido 1 Placa de micropoços (12-1 x 8 poços), com suporte 1 1,2 ml Controlo Negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Baixo, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Alto, pré-diluído 1 50 ml Diluente da amostra HRP 1 25 ml Solução de lavagem HRP, 40x concentrado 1 10 ml Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humana 1 10 ml Cromogénio TMB 1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M Material adicional necessário mas não fornecido Micropipetas de 5, 100, e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para Solução de lavagem HRP diluída Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda) Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de Solução de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantémse estável durante uma semana a 2-8º C. 3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de diluente da amostra HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR o Positivo Baixo, o Positivo Alto e o Controlo Negativo ELISA. 4. A determinação da presença ou ausência de Cromatina utilizando unidades arbitrárias requer o uso de dois poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra de doente. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. Técnica 1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água. 2. Adicione 100 µl do Positivo Baixo, do Positivo Alto, do Controlo Negativo ELISA pré-diluídos e das amostras diluídas dos doentes aos poços. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra. 3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione µl de solução de lavagem HRP diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na adição das amostras. 4. Adicione 100 μl do Conjugado HRP IgG a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no passo Lavagem: Repita o passo Adicione 100 µl do Cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente. 3

4 7. Adicione 100 µl de Solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da Solução de paragem HRP, tal como efectuado para o Cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços. 8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm. Controlo de qualidade 1. O Positivo Baixo, o Positivo Alto e o Controlo Negativo ELISA devem ser processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. 2. Uma vez que o Positivo Baixo, o Positivo Alto e o Controlo Negativo ELISA se encontram pré-diluídos, estes não controlam o procedimento associado à diluição das amostras. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20ºC. 4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do Positivo Alto pré-diluído deve ser superior à absorvância do Positivo Baixo pré-diluído, que deve ser superior à absorvância do Controlo Negativo ELISA pré-diluído. b. O Positivo Alto de pré-diluído deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto que o Controlo Negativo ELISA pré-diluído não pode ter uma absorvância superior a 0,2. c. A absorvância do Positivo Baixo deve ser mais do dobro da absorvância do Controlo Negativo ELISA, ou superior a 0,25. d. O Controlo Negativo ELISA e o Positivo Alto servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O Positivo Alto não consegue assegurar a precisão no ponto de decisão do ensaio. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A da NCCLS para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas. Cálculo dos resultados Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica média (DO) para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode então ser calculada dividindo a DO média da amostra pela DO média do Positivo Baixo. O resultado é multiplicado pelo número de unidades atribuído ao Positivo Baixo de que se encontra no rótulo. Densidade óptica da amostra Valor da amostra = x Positivo Baixo de (unidades) DO do Positivo Baixo (unidades) A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num correspondente aumento ou diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de anticorpos não duplica a reactividade). Se for necessária uma quantificação mais exacta dos anticorpos do doente, será necessário efectuar diluições em série das amostras do doente, e a última diluição com resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o título de anticorpos do doente. Interpretação dos resultados O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças nas populações de doentes. Os valores abaixo indicados são apenas valores sugeridos. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, com base nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. A amostra pode ser então classificada como negativa, moderadamente positiva ou fortemente positiva conforme indicado na tabela em baixo. Unidades Negativa <20 Moderadamente positiva Fortemente positiva >60 1. Um resultado positivo indica a presença de anticorpos anti Cromatina e sugere a possibilidade de diagnóstico de Lúpus induzido por medicamentos (DIL) ou Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE). 2. Um resultado negativo indica a ausência de anticorpos anti Cromatina ou níveis abaixo do ponto de decisão do ensaio. 4

5 3. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório devem incluir a declaração: Os seguintes resultados foram obtidos com o dispositivo INOVA QUANTA Lite TM. Valores de Cromatina obtidos através de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis de IgG descritos não pode ser correlacionada com um título final. Limitações do método 1. A presença de imunocomplexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente pode causar um aumento do nível de ligação não-específica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio. 2. Nem todos os doentes com Lúpus induzido por medicamentos (DIL) ou Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE) têm resultados positivos para Cromatina. 3. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos. 4. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro. Valores esperados Intervalo de valores normais Foram testadas duzentas e dez amostras de voluntários saudáveis. A população normal era de aproximadamente 68% mulheres com uma idade média de 38. As idades situam-se entre os 18 e 75 anos. Para além disso, foram feitos testes a 29 doentes cardíacos que não estavam a tomar procainamida, coincidentes em idade e sexo com os doentes que estavam a tomar procainamida. Duzentas e oito de 210 amostras deram resultados negativos no QUANTA Lite, ou especificidade de 99%. As duas amostras normais positivas apresentaram 24 e 22 unidades de actividade. O ponto de decisão é < 20 unidades. Noventa por cento do painel normal tinha 10 Unidades ou menos. Todos os doentes cardíacos tiveram resultados negativos. Sensibilidade e Especificidade Relativa Comparação com o Histona ELISA No Histona ELISA, as histonas individuais desnaturadas (i.e. H1, H2A, H2B, H3 e H4) revestem a placa ELISA. No, a cromatina sem-h1 (ou seja, o octâmero de histona nativa (H2A-H2B-H3-H4) 2 envolvida com 145 pares base de DNA) reveste a placa ELISA. Uma comparação detalhada dos ELISA histona e cromatina é feita na referência 11. De forma breve, os dois antigénios partilham alguns epítopos importantes. Em particular, as caudas sensíveis a tripsina das histonas, que estão expostas na cromatina e nas histonas desnaturadas, são reactivas com os anticorpos dos doentes com SLE e DIL. No entanto, os epítopos constituídos pelo dímero H2A-H2B nativo ou pelo complexo DNA (H2A-H2B) estão presentes na cromatina mas não nas histonas desnaturadas. Os anticorpos dos doentes com SLE e DIL reconhecem estes epítopos. Pelo contrário, alguns epítopos que estão expostos nas histonas desnaturadas são ocultados na cromatina. Estes epítopos são detectados nos doentes que estão a tomar procainamida, mas são assintomáticos para o lúpus induzido por medicamentos, tornando mais dificil a utilização do Histona ELISA do que o Cromatina ELISA para o diagnóstico do DIL. A presença de DNA na cromatina faz com que os anticorpos de doentes com SLE reconheçam a cromatina mais rapidamente do que as histonas. No entanto, uma vez que o anti-dna é raro em indivíduos sem SLE, virtualmente não existem falsos positivos com cromatina causados pela reactividade anti-dna. Tal como comprovado nas duas tabelas abaixo, o é mais sensível e específica do que o Histona ELISA na diferenciação de doentes sintomáticos dos assintomáticos a tomar procainamida. Para doentes com sintomas semelhantes ao lúpus, o identifica 20 de 26 resultados positivos enquanto que o Histona ELISA apenas identifica 19 resultados positivos. Algumas destas amostras mostraram uma maior reactividade ao do que ao Histona ELISA. Com doentes a tomar procainamida, mas assintomáticos para sintomas semelhantes ao lúpus, apenas 17 de 67 deram resultados positivos no e apenas 4 foram fortemente reactivos. No entanto, 34 foram resultados positivos com o Histona ELISA e 21 destes foram fortemente reactivos. Assim sendo, os anticorpos anti cromatina conseguem diferenciar melhor entre os grupos sintomáticos e assintomáticos do que os anticorpos anti-histona. 9,10,13 Comparação de doentes sintomáticos (n=26) que tomam procainamida no INOVA e no INOVA Histona ELISA. Doentes Sintomáticos n=26 Negativo Moderado Forte Histona ELISA Negativo Moderado Forte

6 Comparação de doentes assintomáticos que tomam procainamida no INOVA Cromatina ELISA e no INOVA Histona ELISA. Doentes assintomáticos n=67 Negativo Moderado Forte Histona ELISA Negativo Moderado Forte O também é mais sensível do que o Histona ELISA para detectar doentes com SLE. Uma percentagem mais elevada foi positiva no e muitos deles mostraram uma forte reactividade. Estes resultados eram esperados, com base em estudos publicados. 6,7,8 Os dados são resumidos na tabela abaixo. Comparação de doentes com SLE no INOVA e no INOVA Histona ELISA. SLE n=45 Negativo Moderado Forte Histona ELISA Negativo Moderado Forte A combinação dos dados das tabelas acima com resultados do painel normal e os controlos cardíacos dão origem à sensibilidade relativa e à especificidade do em comparação com o Histona ELISA. Total de Amostras Negativo Positivo Histona ELISA Negativo Positivo 28* 67 Sensibilidade relativa = 70%. Especificidade relativa = 98%. *Das 28 amostras positivas no Histona ELISA, mas negativas no, 18 são doentes assintomáticos a tomar procainamida, 8 são voluntários saudáveis e 1 é uma amostra de controlo cardíaco. Sensibilidade e Especificidade Clínica Cromatina Positivo Grupo de doentes Número total # % Voluntários saudáveis % lúpus sintomático induzido por procainamida % Doentes assintomáticos a tomar procainamida % Idade e sexo correspondente aos dos doentes cardíacos % SLE % Com base no estudo acima, a sensibilidade clínica do para DIL e SLE é de 72% e a especificidade clínica é de 94%. Estes números estão em conformidade com os número da literatura. 11 Precisão e Reprodutibilidade Dentro do teste Foram testadas cinco amostras dezoito vezes cada, numa placa ELISA. Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Média 61 U 49 U 91 U 75 U 133 U DP 2,9 U 2,7 U 4,1 U 5,2 U 5,1 U CV 4,8% 5,6% 4,5% 7,0% 3,9% Para avaliar a precisão do teste perto do ponto de decisão do cromatina ELISA, foram testadas 5 amostras 14 vezes cada, numa placa ELISA. Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Média 22 U 26 U 30 U 22 U 21 U DP 0,9 U 1,4 U 1,4 U 0,9 U 0,9 U CV 4,3% 5,3% 4,5% 3,9% 4,4% Entre testes Foram testadas cinco amostras positivas, uma por dia em 5 dias diferentes. Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Média 67 U 57 U 110 U 84 U 167 U DP 4,3 U 4,1 U 8,6 U 4,7 U 10,2 U CV 6,4% 7,1% 7,8% 5,6% 6,1% 6

7 Referências 1. Lachman PJ: An attempt to characterize the lupus erythematosus cell antigen. Immunology 4: , Robitaille P, et al.: Relationship between deoxyribonucleo-protein and deoxyribonucleic acid antibodies in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 52: , Fritzler MJ and Tan EM: Antibodies to histones in drug-induced and idiopathic lupus. J Clin Invest 62: , Halbert SP, et al.: Studies on autoantibodies to deoxyribonucleic acid and deoxyribonucleoprotein with enzyme immunoassay (ELISA). J Lab Clin Med 97: , Burlingame RW and Rubin RL: Subnucleosome structures as substrates in enzyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods 134: , Karsh J, et al.: Anti-DNA, anti-deoxyribonucleoprotein and rheumatoid factor in patients with systemic lupus erythematosus, Sjogren s syndrome and rheumatoid arthritis. Int Arch Allergy Appl Immunol 68: 60-69, Burlingame RW, et al.: The central role of chromatin in the autoimmune responses to histones and DNA in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 94: , Chabre H, et al.: Presence of nucleosome-restricted antibodies in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 38: , Burlingame RW and Rubin RL: Drug-induced anti-histone autoantibodies display two patterns of reactivity with substructures of chromatin. J Clin Invest 88: , Rubin RL, et al.: Autoantibodies associated with lupus induced by diverse drugs target a similar epitope in the (H2A-H2B)-DNA complex. J Clin Invest 90: , Burlingame RW: The clinical utility of antihistone antibodies: Autoantibodies reactive with chromatin in systemic lupus erythematosus and drug-induced lupus. Clin Lab Med 17: , Rubin RL: Autoantibody specificity in drug-induced lupus and neutrophil-mediated metabolism of lupus-inducing drugs. Clin Biochem 25: , Rubin RL, et al.: IgG but not other classes of anti[(h2a-h2)-dna] is an early sign of procainamideinduced lupus. J Immunol 154: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service PRT September 2009 Revision 5 7