QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada

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1 QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica O QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen é um teste imunoenzimático (ELISA) para a detecção semiquantitativa de anticorpos do tipo IgA e IgG dirigidos contra péptidos sintéticos e desamidados, derivados da gliadina (DGP) e da transglutaminase tecidular humana (h-ttg) no soro humano. A presença destes anticorpos pode ser utilizada em conjunto com os resultados clínicos e de outros testes de laboratório para ajudar no diagnóstico da doença celíaca com IgA suficiente e IgA deficiente. Resumo e Explicação do teste A doença celíaca ou enteropatia sensível ao glúten é uma situação crónica cujas caracteristicas principais incluem inflamação e achatamento histológico característico da mucosa intestinal, dando origem a uma síndroma de mal-absorção. A etiologia exacta da doença permanece desconhecida, mas a gliadina ou a fracção de glúten de trigo solúvel em álcool é claramente o agente tóxico. 1 Anteriormente, era feita uma série de biópsias intestinais múltiplas para diagnosticar a doença celiáca e distúrbios relacionados. Mais recentemente, foram sugeridos os testes serológicos para o rastreio de doentes com suspeita de enteropatia sensível ao glúten, bem como a monitorização do cumprimento dietético. 2-5 A European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN) recomendou o uso de marcadores serológicos como, por exemplo, a gliadina, bem como a reticulina e anticorpos endomisiais para reduzir o número de biópsias intestinais necessárias para efectuar um diagnóstico. 6 Trabalhos recentes revelaram que os anticorpos da gliadina reactiva de doentes celíacos se ligam em número muito limitado a epítopos específicos da molécula de gliadina. 7,8 Estes mesmos estudos revelaram ainda que a desamidação selectiva da gliadina pela enzima associada à doença celíaca, a transglutaminase tecidular, resulta numa ligação aumentada dos anticorpos anti-gliadina. Com base nas observações acima, os ensaios utilizando péptidos desamidados e definidos demonstraram possuir uma maior precisão de diagnóstico para a doença celíaca quando comparados com ensaios anti-gliadina e ttg padrão. 9,10,11 Tanto os anticorpos anti gliadina IgA como IgG são detectados no soro de doentes com enteropatia sensível ao glúten. 2,3 Uma estratégia de rastreio sensível para populações de risco inclui testes para anticorpos anti gliadina IgG e IgA, uma vez que uma proporção significativa de doentes celíacos são IgG e IgA deficientes. 12 Os anticorpos anti gliadina IgA têm interesse para o acompanhamento da actividade da doença ao longo do tempo e para monitorizar a adesão a uma dieta sem glúten. 5 O antigénio endomisial foi identificado como a enzima de ligação cruzada com a proteína conhecida como transglutaminase tecidular (ttg). 13,14 Os procedimentos antigénicos específicos do ELISA integrando ttg proporcionam uma alternativa fiável e objectiva aos ensaios tradicionais por imunofluorescência integrando finas secções de esófago de primata como substrato O procedimento do ELISA pode ser adaptado a grandes ou pequenas quantidades de amostras de doentes. Nos dois últimos anos o antigénio ttg humano tem sido produzido por tecnologia recombinante. O antigénio recombinante humano pode ter determinadas vantagens comparado com o antigénio do fígado de porquinho-da-índia tradicional. 15,16,18 Dois desenvolvimentos mais recentes na serologia da doença celíaca são a utilização de transglutaminase tecidular humana nativa isolada de glóbulos vermelhos e a utilização de testes capazes de detectar transglutaminase tecidular de classe IgG. A utilização de ttg de glóbulos vermelhos humanos nativos em vez antigénio de porquinhos-da-índia ou de antigénio humano derivado recombinante proporciona a vantagem de facilitar a purificação e os resultados em preparados isentos de proteínas bacterianas, de insectos ou outras proteínas contaminantes Os testes do ELISA de ttg do antigénio humano que são apresentados na literatura parecem funcionar bem comparando com os testes mais tradicionais baseados 15, 16, em antigénio de porquinho-da-índia. Os kits de anticorpos de gliadina de classe de IgG têm sido utilizados já há algum tempo, essencialmente para ajudar na avaliação de indivíduos com IgA deficiente. Vários investigadores demonstraram a utilidade clínica de detectar anticorpos de classe IgG para ttg. 16,18,19 Num teste de estudo a sensibilidade aumentou de 91,5% de apenas anticorpo IgA para 98,5% considerando ambos os resultados de IgA e de IgG. 16 O QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen é um teste de rastreio sensível e específico para doença celíaca. Permite a detecção simultânea de ambos os anticorpos IgA e IgG contra um peptídeo sintético e selectivamente desamidado e h-ttg e permite a detecção de doença celíaca mesmo com a coexistência de deficiência em IgA. Princípio do método Os peptídeos de gliadina desamidados sintéticos purificados (DGP ou gliadina II) e a transglutaminase tecidular humana nativa (h-ttg) ligam-se aos poços da placa de micropoços de poliestireno sob condições que vão preservar o antigénio no seu estado nativo. Os controlos pré-diluídos e o soro diluído dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos péptidos gliadina e/ou h-ttg IgA ou IgG presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgA e IgG anti-humano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controlo. 1

2 Reagentes 1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno revestida com péptidos de gliadina purificados e h-ttg(12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos anti gliadina contra os péptidos da gliadina. IgA ou IgG ou h-ttg, pré-diluído, 1,2 ml 3. Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e anticorpos humanos séricos IgA e IgG e/ou h-ttg contra os péptidos da gliadina, pré-diluído, 1,2 ml 4. Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e anticorpos humanos séricos IgA e IgG e/ou h-ttg contra os péptidos da gliadina, pré-diluído, 1,2 ml 5. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor-de-rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 6. Solução de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 7. Conjugado HRP h-ttg/dpg IgG/IgA, (de cabra), IgG e IgA anti-humana, 1 frasco incolor com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 8. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 9. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA, o Positivo Alto h-ttg/ DGP Screen e o Controlo Negativo ELISA devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a aspiração insuficiente dos líquidos dos poços ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do conjugado HRP para evitar estas ocorrências. 9. A contaminação química do conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação do conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos. 2

3 Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras dos micropoços revestidas com antigénios que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8º C. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C. Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A3 da CLSI (NCCLS) recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. 24 Procedimento Material fornecido 1 Placa de micropoços h-ttg/dgp Screen ELISA (12-1 x 8 poços), com suporte 1 1,2 ml Controlo Negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA, pré-diluído 1 50 ml Diluente da amostra HRP 1 25 ml Solução de lavagem HRP, 40x concentrado 1 10 ml Conjugado HRP h-ttg/dgp IgG/IgA, (de cabra), IgG e IgA anti-humana 1 10 ml Cromogénio TMB 1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M Material adicional necessário mas não fornecido Micropipetas de 5, 100, e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para Solução de lavagem HRP diluída Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda) Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de Solução de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantémse estável durante uma semana a 2-8º C. 3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de diluente da amostra HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR o Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA, o Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA e o Controlo Negativo ELISA. 4. A determinação da presença ou ausência h-ttg/dgp IgA e/ou IgG utilizando unidades arbitrárias requer o uso de 2 poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. Técnica 1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água. 2. Adicione 100 µl do Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA, do Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA, do Controlo Negativo ELISA pré-diluídos e das amostras diluídasdos doentes nos respectivos poços. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra. 3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione µl de solução de lavagem HRP diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na adição das amostras. 3

4 4. Adicione 100 μl do Conjugado HRP h-ttg/dgp IgG/IgA a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no passo Lavagem: Repita o passo Adicione 100 µl do cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente. 7. Adicione 100 µl de solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da Solução de paragem HRP, tal como efectuado para o Cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços. 8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm. Controlo de qualidade 1. O Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA, o Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. 2. Uma vez que o Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA, o Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA e o Controlo Negativo ELISA são pré-diluídos, estes não controlam o procedimento associado à diluição das amostras. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20ºC. 4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA pré-diluído deve ser superior à absorvância do Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA pré-diluído, que deve ser superior à absorvância do Controlo Negativo ELISA pré-diluído. b. O Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA pré-diluído deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto o Controlo Negativo ELISA pré-diluído não pode ter uma absorvância superior a 0,2. c. A absorvância do Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA pré-diluído deve ser mais do dobro da absorvância do Controlo Negativo ELISA ou superior a 0,25. d. O Controlo Negativo ELISA e o Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O Positivo Alto h-ttg/dgp Screen ELISA não consegue assegurar a precisão no ponto de decisão do ensaio. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A3 da CLSI (NCCLS) para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas. 25 Cálculo dos resultados Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica média (DO) para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode ser calculada dividindo a DO média da amostra pela DO média do Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA. O resultado é multiplicado pelo número de unidades do Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA que se encontram no rótulo. Densidade óptica da amostra Valor da amostra = x Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen (unidades) DO Positivo Baixo h-ttg/dgp Screen ELISA ELISA (unidades) A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num respectivo aumento ou diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de anticorpos não duplica a reactividade). Se for necessária uma quantificação mais exacta dos anticorpos do doente, será necessário efectuar diluições em série das amostras do doente, e a última diluição com resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o título de anticorpos do doente. Interpretação dos resultados Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, com base nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. A amostra pode então ser classificada como negativa ou positiva de acordo com a tabela abaixo. Unidades Negativo <20 Positivo >20 1. Um resultado positivo indica a presença de peptídeo de gliadina e/ou h-ttg de anticorpos IgG e/ou IgA e sugere a possibilidade de determinadas enteropatias sensíveis ao glúten, como a doença celíaca. 2. Um resultado negativo indica ausência do anticorpo péptidos gliadina e/ou ttg IgG ou IgA ou níveis abaixo do limite do ponto de decisão do ensaio. 4

5 3. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório incluam a declaração: Os resultados apresentados foram obtidos com o dispositivo INOVA QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen. Os valores péptidos gliadina e ttg IgG/IgA obtidos através de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis de anticorpo descritos não pode ser correlacionada com um título final. Limitações do método 1. Um resultado negativo num paciente sem tratamento não exclui completamente uma enteropatia glúten-sensível. 2. Sabe-se que os doentes tratados apresentam níveis de anticorpos IgA, nesta situação, os niveis de anticorpo gliadina IgA representam um melhor indicador da conformidade dietética que as concentrações de anticorpos gliadina IgG É possivel a ocorrência de falsos positivos (níveis elevados de anticorpos sem dados histológicos característicos). Podem ser realizados outros testes serológicos específicos de doença celíaca, como o endomísio (EMA), para confirmar resultados positivos. Os níveis IgA do soro também podem ser medidos para verificar deficiências de IgA. 4. Podem ocorrer resultados positivos mesmo se os testes individuais de h-ttg e gliadina II forem negativos. Uma vez que este teste de rastreio detecta anticorpos IgG e IgA em h-ttg e gliadina II pode haver um efeito aditivo devido a resultados negativos elevados múltiplos em testes individuais múltiplos. 5. Uma vez que este kit usa um conjugado combinado que detecta simultaneamente anticorpos IgA e IgG, não é possível determinar se um resultado positivo é devido a IgG, IgA ou a ambos. Se desejar uma quantificação e determinação individual de anticorpos IgA ou IgG específicos, devem ser utilizados kits de IgA e IgG separados para h-ttg e gliadina II. Os valores unitários separados de gliadina IgG e de gliadina IgA não correspondem aos valores unitários obtidos no teste h-ttg/dgp, uma vez que é utilizado um conjugado de IgG e IgA misto. 6. Utilize os resultados deste teste em conjunto com os resultados clínicos. 7. Para este teste devem ser utilizadas amostras de soro. Valores esperados Intervalo de valores normais Quatrocentos e noventa e seis indivíduos saudáveis e assintomáticos, residentes nos EUA e escolhidos aleatoriamente foram testados para anticorpos anti-h-ttg/dgp. Destes dadores, duzentos e noventa- nove tinham entre 14 e os 78 anos de idade e incluíam 150 homens e 149 mulheres. Sete amostras (1,4%) estavam acima do cut-off de 20 unidades. Cinco amostras foram positivas com valores de 20,2; 22,1; 23,4; 29,2 e 36,5 unidades. As outras duas positivas foram 46,1 e 39,0 unidades e crê-se serem uma verdadeira doença celíaca pelo facto de os resultados h-ttg IgA serem 57,2 e 72,4 unidades respectivamente. O valor médio destas 496 amostras era de 6,2 unidades. O desvio padrão das amostras era de 3,8 unidades. O valor médio é três desvios padrão abaixo do cut-off de 20 unidades. Características de desempenho específicas Comparação com Dispositivos Afirmados Ninety nove amostras de três laboratórios de referência em doença celíaca foram testadas internamente com os kits de ELISA QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen, QUANTA Lite TM h-ttg IgA, QUANTA Lite TM h- ttg IgG e QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen. Estes resultados, mais os 496 normais, estão indicados abaixo. Uma amostra era considerada positiva pelos aparelhos implicados se existisse um resultado positivo em qualquer dos três aparelhos implicados (o resultado não tinha de ser positivo nos três aparelhos). Uma amostra era considerada negativa pelos aparelhos implicados se existisse um resultado negativo nos três aparelhos implicados. N= 595 Celiac DGP Screen e/ou h-ttg Positivos Negativos h-ttg/dgp Screen Positivos 48 4* Negativos 7** 536 Concordância de percentagem de positivos: 48/55 (87,3%), 95% Intervalo de confiança (CI): 75,5% a 94,7% Concordância de percentagem de negativos: 536/540 (99,3%), 95% Intervalo de confiança (CI): 98,1% a 99,8% Concordância global: 584/595 (98,2%), 95% Intervalo de confiança (CI): 96,7% a 99,1% *Das 4 amostras positivas com o h-ttg/dgp Screen mas negativas com ambos os kits Celiac DGP e h-ttg, 3 eram do estudo normal. O quarto paciente era um paciente celiac em uma dieta livre do gluten, 22,1 unidades. **Das sete amostras negativas com o kit h-ttg/dgp Screen mas positivas com um dos kits Celiac DGP ou h-ttg, 5 eram do estudo normal. Dos restantes houve um teve doente celíaco com uma dieta sem glúten, 21,5 unidades em h-ttg IgA. A outra amostra era um familiar em primeiro grau, 20,2 unidades no Celiac DGP Screen. 5

6 Estudos Clínicos As amostras clinicamente definidas como sendo de doentes celíacos não tratados (139 são doentes celíacos pediátricos), de doentes celíacos com deficiência de IgA, de doentes celíacos latentes, de doentes celíacos refractários, de doentes celíacos com dieta sem glúten, de parentes em primeiro grau de doentes celíacos, de Doentes Não-Celíacos ou de controlos IgA deficientes foram testadas em estudos clínicos, tanto internos como externos, utilizando o QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen. Encontra-se em baixo um resumo das amostras definidas clinicamente mais das amostras do intervalo normal, anteriormente mencionado. Grupo de doentes # Positivo h-ttg/dgp % Celíacos não tratados (pediátricos) 185 (139) 183 (139) 99% (100%) Celíaco com deficiências IgA % Celíaco, latentes 11 10* 91% Celíaco, refractários 9 8** 89% Celíaco Positivo, Dieta sem glúten % Familiares de 1º grau % Doenças Controlos ,5% Indivíduos *** 2,2% *8 dos 11 doentes celíacos latentes foram positivos para ttg IgA e 9 foram positivos para EMA **Nenhum destes 9 doentes celíacos refractários foram positivos para EMA e apenas 2 (22%) foram positivos para ttg ***Pelo menos 2 dos 20 positivos deram positivo para testes individuais de h-ttg e DGP ELISA e também positivo para ttg por RIA por fase de fluido. Desempenho do teste ELISA h-ttg/dgp Screen para o Diagnóstico de Doença Celíaca: Diagnóstico* Positivo Negativo Soma (Celíacos não tratados, pediátricos deficiências IgA, latent e refractory) (Familiares de 1º grau, A doença Controla e Controles Saudáveis) QUANTA LITE Positivo h-ttg/dgp Negativ Screen o Soma * Não inclui os 120 doentes celíacos com dieta sem glúten. Sensibilidade: 98,6% (207/210), 95% Intervalo de confiança (CI): 95,9% a 99,7% Especificidade: 97,0% (978/1008), 95% Intervalo de confiança (CI): 95,8% a 98,0% Sensibilidade - A sensibilidade geral para doença celíaca é calculada através do agrupamento dos resultados de todos os doentes celíacos excepto os que já fazem uma dieta sem glúten. O número total de pacientes celíacos é 210, dos quais 207, ou seja, 98,6% são positivos. Especificidade - A especificidade pode ser calculada através do agrupamento de 914 normais, os 76 controlos da doença e os 18 familiares em primeiro grau. Este grupo totaliza 1008 amostras. Destas, 30 amostras eram positivas para uma especificidade de 97,0%. Reactividade-cruzada Para avaliar os potenciais problemas da reactividade-cruzada a outros anticorpos, foram testadas várias amostras positivas de anticorpos de alto título no dispositivo QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen. No total, foram testadas 83 amostras. Muitas das amostras eram os controlo positivos altos de outros kits de ensaio INOVA QUANTA Lite TM de autoanticorpos. As especificidades incluiam Actin (4), Chromatin (7), dsdna (4), M2 (4), MPO (5), Centromere (7), CCP3 (5), GBM (9), Ribo P (4), RF IgG (4), SS-B (4), RNP (4), Scl-70 (4), Jo-1 (4), Sm (4), SS-A (6) e TPO (4). O valor médio destas 83 amostras era de 4,51 unidades. Todas as amostras eram negativas com o QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen. O valor médio é 4,4 desvios padrão abaixo do cut-off de 20 unidades. Precisão No Laboratório O desempenho intra-ensaio do QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen foi avaliado ao testar 12 amostras num total de 5 vezes cada. Este teste foi realizado por operador único na INOVA Diagnostics usando um lote de kits. Os resultados estão mostrados embaixo. Desempenho entre ensaios do ELISA QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen Unidades médias 113,3 62,9 41,3 35,7 22,1 21,6 18,7 19,0 7,9 6,8 12,2 7,0 Desvio padrão 1,3 1,1 0,7 0,6 0,4 0,3 0,2 0,9 1,0 0,5 0,6 0,3 Coeficiente de variação % 1,2 1,7 1,7 1,7 1,9 1,2 1,2 4,5 12,4 7,7 4,6 4,6 A variação entre ensaios foi avaliada pelo teste em duplicado, um painel de 12 amostras duas vezes por dia (uma vez pela manhã e uma vez à tarde), durante 3 dias. Este teste foi realizado por operador único na INOVA Diagnostics usando um lote de kits. Apresenta-se em baixo um resumo dos resultados. 6

7 Desempenho inter ensaios do ELISA QUANTA Lite TM h-ttg/dgp Screen A B C D E F G H I J K L Unidades médias 66,6 117,1 46,4 22,4 36,8 22,9 16,1 17,1 7,2 6,6 6,6 9,7 Desvio padrão 2,1 3,6 2,4 1,2 3,3 2,2 1,1 1,5 0,3 0,7 1,4 1,8 Coeficiente de variação % 3,2 3,0 5,2 5,3 9,0 9,5 6,9 8,7 4,4 11,2 21,3 18,8 Variação de Lote para Lote A variação de lote para lote foi realizada na INOVA Diagnostics por três operadores diferentes usando três kits de lotes diferentes em três dias diferentes. Apresenta-se em baixo um resumo dos resultados. Amostra Lote 1 Lote 2 Leot 3 Unidades médias Std Dev %CV Alto Positivo Controlo 88,23 77,39 98,90 88,17 10,76 12,20 Positivo 1 53,22 57,92 58,94 56,69 3,05 5,38 Positivo 2 104,68 118,56 110,69 111,31 6,96 6,25 Positivo 3 44,16 43,85 44,83 44,28 0,50 1,13 Positivo 4 27,31 21,24 29,48 26,01 4,27 16,42 Positivo 5 30,63 36,85 37,25 34,91 3,71 10,63 Positivo 6 22,23 23,23 21,74 22,40 0,76 3,39 Positivo 7 40,39 47,32 46,74 44,82 3,84 8,58 Positivo 8 114,13 121,18 114,36 116,56 4,01 3,44 Reagente Branco 1,66 1,66 1,96 1,76 0,17 9,84 Negativo Controlo 1,71 1,54 1,96 1,74 0,21 12,17 Negativo 1 6,64 5,64 7,43 6,57 0,90 13,65 Negativo 2 6,44 6,61 8,63 7,23 1,22 16,86 Negativo 3 8,55 8,94 9,19 8,89 0,32 3,63 Negativo 4 8,55 11,90 12,45 10,97 2,11 19,25 Referências 1. Trier JS: Celiac Sprue. New England Journal of Medicine 325: , Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: , McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for celiac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: , Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. Journal of Internal Medicine 241: , Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for celiac disease. Arch Dis Child 66: , Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of celiac disease. Arch Dis Child 65: , Osman AA, et al.: B-Cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 121: , Aleanzi M, et al.: Celiac disease: Antibody recognition against native and selectively deamidated gliadin peptides. Clinical Chemistry 47: , Schwertz E, et al.: Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clinical Chemistry 50: , Prince HE: Evaluations of the INOVA Diagnostics Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits for Measuring Serum Immunoglobulins G (IgG) and IgA to Deamidated Gliadin Peptides. Clinical and Vaccine Immunology 13: , Sugai E, et al.: Accuracy of Testing Antibodies to Synthetic Gliadin-Related Peptides in Celiac Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology 4: , Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and celiac disease. Scand Journal Gastroenterology 27: , Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al.: Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: , Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al.: Autoantibodies in celiac disease: tissue transglutaminase guilt by association? Gut 41: , Sardy M, et al.: Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of gluten-sensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, Sblattero D, et al.: Human recombinant tissue transglutaminase ELISA : an innovative diagnostic assay for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: 1253, Sugai E, et al.: Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit. Am J Gastro 95: , Lampasona V, et al.: Tissue transglutaminase and combined screening for celiac disease and type 1 diabetes-associated autoantibodies. Lancet 352: , Hansson T, et al.: Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children with celiac disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 379, Andersson AS, et al.: Inhibition of endomysial staining with human tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Axiö-Frekricksson UB, et al.: Differences in human and guinea pig tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Signorini M, et al.: Human erythrocyte transglutaminase: Purification and preliminary characterization. Biological Chemistry 369: 275, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition,

8 24. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), CLSI (NCCLS). Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions; Approved Guideline- 3rd edition NCCLS Document C24-A3, Vol. 26(25), Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service PRT April 2007 Revision 0 8