QUANTA Lite dsdna ELISA cadeia dupla DNA ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada

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1 QUANTA Lite dsdna ELISA cadeia dupla DNA ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica O QUANTA Lite dsdna ELISA é um ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção semi-quantitativa de autoanticorpos dsdna no soro humano. A presença de anticorpos anti dsdna pode ser utilizada em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes de laboratório para ajudar no diagnóstico de Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE). Resumo e Explicação do teste Os anticorpos antinucleares (ANA) podem ser encontrados numa grande variedade de doenças do tecido conjuntivo e representam um ensaio sensível de rastreio. 1 Embora o teste ANA seja um excelente teste de rastreio para o SLE (um resultado negativo elimina virtualmente a possibilidade do SLE activo) 2, não é de modo algum um teste específico. Os anticorpos anti dsdna ocorrem quase exclusivamente em doentes com SLE e são considerados anticorpos marcadores para esta doença. A presença de anticorpos anti dsdna é um forte indicador do SLE, no entanto, a ausência destes anticorpos não exclui o SLE em todos os casos. Os auto-anticorpos anti dsdna foram incluídos nos critérios revistos em 1982 da classificação do SLE por parte de um sub-comité da Associação de Artrite e Reumatismo. 3 Uma variedade de métodos foram utilizados para detectar anticorpos anti dsdna, incluindo testes de imunofluorescência, 4 testes de radioimunologia, 5 aglutinação passiva 6 e fixação de complementos 7. Também foram desenvolvidos testes ELISA com utilidade clinica para a detecção de anticorpos dsdna. 8,9,10,11 A técnica ELISA aplicada neste teste é objectiva, semi-quantitativa e pode ser convenientemente empregue num grande número de doentes. Para além disso, ao utilizar dsdna purificado como substrato, são eliminados resultados falsos positivos, originados pela presença de anticorpos de DNA de cadeia simples, histonas ou desoxinucleoproteínas. Princípio do método Os poços da microplaca de poliestireno, encontram-se revestidos com dsdna do timo de novilho altamente purificado, sob condições que vão preservar o antigénio no seu estado nativo. Os controlos pré-diluídos e o soro diluído dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos dsdna presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG anti-humano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite à enzima marcada com IgG anti-humana ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrofotometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controlo. Reagentes 1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno, revestida com antigénio dsdna altamente purificado de timo de novilho (12-1 x 8 poços), com suporte dentro de uma embalagem de alumínio com dessecantes 2. Controlo negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos anti dsdna, pré-diluído, 1,2mL 3. Positivo dsdna ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti dsdna, pré-diluído, 1,2 ml 4. Calibrador dsdna ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti dsdna, pré-diluído, 1,2 ml 5. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor de rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 6. Concentrado de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 7. Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humana, 1 frasco de cor azul com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 8. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 9. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o calibrador dsdna ELISA e os controlos positivo e negativo dsdna ELISA devem ser manipulados da mesma forma como material potencialmente infeccioso A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. De modo a evitar lesões, evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele ou olhos. 1

2 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a remoção insuficiente dos líquidos dos poços das tiras ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços das tiras ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do conjugado HRP para evitar estas ocorrências. 9. A contaminação química do conjugado HRP, do calibrador dsdna ELISA ou do controlo positivo dsdna ELISA pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação gradual do conjugado HRP, do calibrador dsdna ELISA e do controlo positivo dsdna ELISA. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras dos micropoços revestidas com antigénios que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8º C. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C. Colheita de amostras Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A2 da CSLI (anteriormente NCCLS) recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. Procedimento Material fornecido 1 Placa de micropoços dsdna ELISA (12-1 x 8 poços), com suporte 1 1,2 ml Controlo negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Controlo positivo dsdna ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Calibrador dsdna ELISA, pré-diluído 1 50 ml Diluente da amostra HRP 1 25 ml Concentrado de lavagem HRP, 40x concentrado 1 10 ml Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humano 1 10 ml Cromogénio TMB 1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M Material adicional necessário mas não fornecido Micropipetas de 5, 100, e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para concentrado de lavagem HRP diluído Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda) 2

3 Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir o concentrado de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco do concentrado de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantém-se estável durante uma semana a 2-8º C. 3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de diluente de amostras HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR o Calibrador dsdna ELISA, o controlo positivo dsdna ELISA ou o controlo negativo ELISA. 4. A determinação da presença ou ausência de auto-anticorpos dsdna requer o uso de dois poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra de doente. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. Técnica 1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água. 2. O calibrador dsdna ELISA e o controlo positivo dsdna ELISA devem ser removidos dos frascos usando condições assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária de calibrador dsdna ELISA e de controlo positivo dsdna ELISA para efectuar o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O Calibrador dsdna ELISA ou o controlo positivo dsdna ELISA NÃO USADO NO FRASCO. Adicione 100 µl de calibrador dsdna ELISA pré-diluído, de controlo positivo dsdna ELISA, de controlo negativo dsdna ELISA e das amostras diluídas nos respectivos poços. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra. 3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione µl de solução de lavagem HRP diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na adição das amostras. 4. Adicione 100 μl do conjugado HRP IgG a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no passo Lavagem: Repita o passo Adicione 100 µl do cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente. 7. Adicione 100 µl de solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da solução de paragem HRP, tal como efectuado para o cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços. 8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm. Controlo de qualidade 1. O calibrador dsdna ELISA, o controlo positivo dsdna ELISA e o controlo negativo ELISA devem ser aplicados em todos os lotes de amostras de modo a assegurar que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. 2. Note que uma vez que o calibrador dsdna ELISA, o controlo positivo dsdna ELISA e o controlo negativo ELISA se encontram pré-diluídos, estes não controlam o procedimento associado à diluição das amostras. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20ºC. 4. O valor calculado do controlo positivo UI/ml ou WHO unid./ml deve situar-se dentro do intervalo indicado no frasco. 5. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do controlo positivo dsdna ELISA pré-diluído deve ser superior à absorvância do calibrador dsdna ELISA pré-diluído, a qual, por sua vez, deve ser superior à absorvância do controlo negativo ELISA pré-diluído. b. O controlo positivo dsdna ELISA pré-diluído deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto que a absorvância do controlo negativo ELISA pré-diluído não pode ser superior a 0,2. c. A absorvância do calibrador dsdna ELISA deve ser duas vezes superior à absorvância do controlo negativo ELISA ou superior a 0,25. d. O controlo negativo ELISA e o positivo dsdna ELISA servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O controlo positivo dsdna ELISA não consegue assegurar precisão no ponto de decisão do teste. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A3 da CSLI (anteriormente NCCLS) para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas. 3

4 Cálculo dos resultados Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica média (DO) para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode ser calculada através da divisão da DO média da amostra pela DO média do calibrador dsdna ELISA e multiplicando o resultado pelo valor UI/ml ou WHO unid./ml do calibrador dsdna ELISA. As unidades para o calibrador dsdna ELISA encontram-se no frasco. Densidade óptica da amostra Valor da amostra = x calibrador dsdna ELISA (unidades) DO do calibrador dsdna ELISA (unidades) A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num correspondente aumento ou diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de anticorpos não duplica a reactividade). Se for necessária uma quantificação mais exacta dos anticorpos do doente, será necessário efectuar diluições em série das amostras do doente, e a última diluição com resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o título de anticorpos do doente. Interpretação dos resultados O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças em populações de doentes. Os valores abaixo indicados são apenas valores sugeridos. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, baseados nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. A amostra pode ser classificada como negativa, ambígua, moderadamente positiva ou fortemente positiva conforme indicado na tabela em baixo. UI/ml WHO unid./ml Negativa ,6 Ambígua ,7-138,9 Moderadamente positiva ,4 Fortemente positiva >801 >370,5 As amostras com resultados ambíguos devem ser testadas novamente antes dos resultados serem apresentados. 1. Um resultado positivo indica a presença de anticorpos dsdna e sugere a possibilidade de SLE. 2. Uma amostra com níveis ambíguos de anticorpos dsdna não pode ser determinada para os niveis de anticorpos. Se o resultado permanecer ambíguo depois de repetido o teste, o resultado deve ser apresentado como ambíguo e/ou deve ser colhida uma amostra adicional. 3. Um resultado negativo indica a ausência de anticorpos dsdna ou níveis abaixo do limite do ponto de decisão do ensaio. 4. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório devem incluir a declaração: Os resultados seguintes foram obtidos com o INOVA QUANTA Lite dsdna ELISA. Os valores dsdna obtidos com métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. Limitações do método 1. Os anticorpos de DNA de cadeia simples, de complexos DNA-histona ou outros complexos núcleo-proteicos não devem reagir de forma significativa com o antigénio dsdna utilizado neste ensaio. Estes anticorpos podem ser detectados em maior ou menor quantidade por outros métodos de ensaio. Por isso, a comparação entre diferentes métodos pode dar origem a resultados divergentes. 2. Uma vez que os anticorpos IgG são considerados clinicamente mais significativos, 13,14,15 este ensaio recorre a um conjugado IgG específico. Os anticorpos IgM dsdna não medidos neste ensaio podem competir com os anticorpos IgG por locais de ligação disponíveis. No caso de haver suspeitas de interferência por parte dos anticorpos IgM, é necessário efectuar um ensaio novo com uma diluição maior. Um aumento acentuado do valor da amostra indica a presença de competição por parte dos anticorpos IgM. Este novo valor proporciona uma estimativa mais exacta da quantidade de anticorpos dsdna IgG na amostra do doente. 3. A presença de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente podem causar um aumento do nível de ligação não-específica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio. 4. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos. 5. Um resultado dsdna negativo não exclui a presença de SLE. 6. Um resultado positivo apenas indica a presença de anticorpos anti dsdna e não indica, necessariamente, um diagnóstico de SLE. 7. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro. Valores esperados A capacidade do teste QUANTA Lite dsdna ELISA em detectar anticorpos dsdna foi avaliada através da comparação com um teste de imunofluorescência, comercialmente disponível, da INOVA Diagnostics, Inc. Intervalo de valores normais O intervalo de valores normais para este ensaio foi determinada por análise das amostras de 175 dadores de sangue aleatórios. Deste número, à excepção de 2 (1,1%), todos apresentaram valores anti-dsdna inferiores a 200 UI/ml (92,6 WHO unidades/ml). 4

5 Sensibilidade e Especificidade relativa A reactividade cruzada do ensaio foi estabelecida testando, 50 doentes com diversas doenças auto-imunes, que apresentavam algum tipo de anticorpos antinucleares (ANA) mas nenhum anticorpo significativo anti dsdna por um método de referência. Destes doentes, à excepção de 1 (2,0%), todos apresentaram também valores anti-dsdna inferiores a 200 UI/ml (92,6 WHO unidades/ml). Uma comparação directa com outro sistema de teste de anticorpos dsdna ELISA comercialmente disponível foi realizada em 64 doentes seleccionados entre uma população contendo amostras positivas e negativas. Os resultados destes estudos encontram-se na tabela seguinte. Método de referência P A N P 16** 0 0 P = positivo INOVA A 0 1* 1 A = Ambíguo N 0 7* 39 N = negativo *Teste negativo por IFA com Crithidia luciliae. ** 12 de 16 também positivos por IFA com Crithidia luciliae. 5

6 Referências 1. Tan E: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: 167, Casalo SP, Friou GJ, Myers LL: Significance of antibodies to DNA is systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: 379, Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271, Crowe W, Kusher I: An immunofluorescent method using Crithidia luciliae to detect antibodies to double-stranded DNA. Arthritis and Rheumatism 20: 811, Fish F, Ziff M: A sensitive solid phase microradioimmunoassy for anti double-stranded DNA antibodies. Arthritis and Rheumatism 24: 534, Inami YH, Nakamura RM, Tan EM: Microhemagglutination test for the detection of native and single-stranded DNA antibodies and circulating DNA antigen. Journal Immunol Methods 3: 287, Arana RK, Seligmann M: Antibodies to native and denatured deoxyribonucleic acid in systemic lupus erythematosus. Journal Clinical Investitgation 46: 1867, Kavai M, et al.: Enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to native DNA in sera of patients with SLE. Journal Immunol Methods 48: 169, Rubin RL, et al.: An improved ELISA for anti-native DNA by elimination of interference by anti-histone antibodies. Journal Immunol Methods 63: 359, Pisetsky DS, Peters DV: A simple enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to native DNA. Journal Immunol Methods 41: 187, Klotz JL: Enzyme-linked Immunosorbent Assay for antibodies to native and denatured DNA. Methods in Enzymology 84: 194, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, Fifth Edition, Sontheimer RD, Gilliam JN: DNA antibody class, subclass, and complement fixation in systemic lupus erythematosus with and without nephritis. Clinical Immunolgy and Immunopatholgy 10: 459, Talal N, et al.: Biological significance of IgM and IgG antibodies to DNA and RNA in autoimmune disease. American Journal of Clinical Pathology 68: 643, Gonzalez EN, Rothfield NF. Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. New England Journal of Medicine 274: 133, Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : info@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT May 2010 Revision 22 6