QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada

Transcrição

1 QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica O kit QUANTA-Lite H. pylori IgA é um ensaio baseado de imunoadsorção ligada a enzimas (ELISA) para a detecção qualitativa de anticorpos anti-h. pylori (Helicobacter pylori) IgA em soro humano. O teste destinase a ajudar no diagnóstico de infecção por H. pylori em doentes adultos com 18 ou mais anos de idade apresentando sinais e sintomas clínicos de doença gastrintestinal. O QUANTA Lite H. pylori IgA deve ser efectuado e interpretado em conjunto com o QUANTA Lite H. pylori IgG para a detecção de anticorpos IgG contra o H. pylori. Resumo e Explicação do teste A relação causal entre a infecção por H. pylori e a doença péptica ulcerosa encontra-se perfeitamente estabelecida desde que foi inicialmente proposta, em A infecção por H. pylori está presente em mais de 95% dos doentes com úlceras duodenais, 80% dos doentes com úlceras gástricas e associa-se ao carcinoma e linfoma gástricos. 2-5 A erradicação da infecção por H. pylori reduz a recidiva da úlcera. 2-5 O tratamento da infecção por H. pylori tem sido recomendado para doentes apresentando úlceras gástricas ou duodenais e, recentemente, também para a dispepsia funcional. 5,6 O diagnóstico de infecção por H. pylori inclui métodos invasivos e não invasivos. Entre os exames invasivos inclui-se a endoscopia para observação directa da mucosa do antro gástrico e para obtenção de biópsias para teste com urease, coloração histológica (Warthin-Starry) e cultura. 5,7 A cultura é considerada como o padrão dourado, mas consiste no exame menos sensível (sensibilidade de 70-80%). O exame Histológico e com urease apresentam sensibilidades e especificidades superiores a 90%. 5 As principais desvantagens dos métodos invasivos consistem no risco e incómodo para o doente, custo elevado e resultados falsos negativos decorrentes da distribuição em placas no estômago, característica do H. pylori. Entre os exames não invasivos inclui-se o teste respiratório (breath test) utilizando ureia marcada com 14 C ou 13 C e exames serológicos. O teste respiratório é sensível e específico, mas é oneroso. A serologia representa uma alternativa de baixo custo, sensível e específica relativamente aos caros procedimentos invasivos como a endoscopia e o teste respiratório com ureia 14 C. 2,3,5,8,9 Na maioria dos casos, a detecção de anticorpos da classe IgG contra H. pylori faculta uma determinação rigorosa da infecção por H. pylori, com sensibilidade e especificidade superior a 90%. Todavia, verificou-se que aproximadamente 2 a 7% dos doentes testados para anticorpos IgG e IgA contra H. pylori são negativos para IgG contra o H. pylori, mas positivos para IgA contra H. pylori. 12,15,16,18 Por conseguinte, a determinação isolada dos anticorpos IgG pode falhar alguns casos verdadeiros de infecção por H. pylori e pode fazer com que doentes infectados não recebam tratamento ou sejam sujeitos a procedimentos de teste muito mais caros e frequentemente invasivos. Para além da detecção de alguns doentes de que podem não ser detectados pelo ensaio de IgG contra H. pylori, entre os outros estudos que suportam a utilidade clínica da determinação de anticorpos IgA contra o H. pylori incluem-se: 1) achados que referem que a presença de níveis elevados de anticorpos IgA contra o H. pylori em conjunto com níveis baixos de pepsinogénio I sérico constitui um factor de risco para cancro gástrico 17, 2) após tratamento, os valores dos anticorpos IgA podem diminuir mais rapidamente do que os valores de IgG 15, 3) a detecção de anticorpos IgA contra o H. pylori pode ajudar no diagnóstico de indivíduos sintomáticos com valores de IgG contra H. pylori equívocos ou baixos e 4) a razão dos valores dos anticorpos IgA/IgG contra H. pylori pode estar relacionada com o grau da gastrite crónica associada a H. pylori. 19 Princípio do método O antigénio purificado H. pylori é ligado aos poços de uma placa de micropoços de poliestireno sob condições que vão preservar o antigénio no seu estado nativo. Os controlos pré-diluídos e o soro diluído dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos mitocôndrias presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgA antihumano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controlo. Reagentes 1. Placa de micropoços de poliestireno ELISA revestida com antigénio H. pylori purificado (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes. 2. Controlo negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano IgA sem anticorpos humanos anti H. pylori, pré-diluído, 1,2 ml 3. Positivo baixo H. pylori IgA ELISA, 1 frasco com solução tampão com conservante e soro humano IgA com anticorpos anti H. pylori, pré-diluído, 1,2 ml 4. Positivo alto H. pylori IgA ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano IgA com anticorpos anti H. pylori, pré-diluído, 1,2 ml 1

2 5. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor de rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 6. Solução de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 7. Conjugado HRP IgA, (de cabra), IgA anti-humana, 1 frasco de cor amarelo com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 8. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 9. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo baixo H. pylori IgA ELISA, o Positivo alto H. pylori IgA ELISA e o Controlo negativo devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. De modo a evitar lesões, evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele ou olhos. 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a remoção insuficiente dos líquidos dos poços ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do conjugado HRP para evitar estas ocorrências. 9. A contaminação química do conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação do conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras dos micropoços revestidas com antigénios que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8º C. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C. 2

3 Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A da NCCLS recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. Não se recomendam amostras repetidamente congeladas e descongeladas. Procedimento Material fornecido 1 Placa de micropoços de H. pylori IgA ELISA, (12-1 x 8 poços), com suporte 1 1,2 ml Controlo negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo baixo H. pylori IgA ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo alto H. pylori IgA ELISA, pré-diluído 1 50 ml Diluente da amostra HRP 1 25 ml Solução de lavagem HRP, 40x concentrado 1 10 ml Conjugado HRP IgA, (de cabra), IgA anti-humana 1 10 ml Cromogénio TMB 1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M Material adicional necessário mas não fornecido Micropipetas de 5, 100, e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para solução de lavagem HRP diluído Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda) Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir a solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de solução de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantémse estável durante uma semana a 2-8º C. 3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de diluente da amostra HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR o Positivo baixo H. pylori IgA ELISA, o Positivo alto H. pylori IgA ELISA e o Controlo negativo ELISA. 4. A determinação da presença ou ausência de H. pylori utilizando unidades arbitrárias requer o uso de dois poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra de doente. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. Técnica 1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água. 2. Adicione 100 µl de Positivo baixo H. pylori IgA ELISA, de Positivo alto H. pylori IgA ELISA, de Controlo negativo ELISA pré-diluídos e de amostras diluídas dos doentes aos respectivos poços. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra. 3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione µl de solução de lavagem HRP diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na adição das amostras. 3

4 4. Adicione 100 μl do conjugado HRP IgA a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no passo Lavagem: Repita o passo Adicione 100 µl do cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente. 7. Adicione 100 µl de solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da solução de paragem HRP, tal como efectuado para o cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços. 8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm. Controlo de qualidade 1. O Positivo baixo H. pylori IgA ELISA, o Positivo alto H. pylori IgA ELISA e o Controlo negativo ELISA devem ser processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. 2. Uma vez que o Positivo baixo H. pylori IgA ELISA, o Positivo alto H. pylori IgA ELISA e o Controlo negativo ELISA se encontram pré-diluídos, estes não controlam o procedimento associado à diluição das amostras. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20ºC. 4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do Positivo alto H. pylori IgA ELISA pré-diluído deve ser superior à absorvância do Positivo baixo H. pylori IgA ELISA pré-diluído, que deve ser superior à absorvância do Controlo negativo ELISA pré-diluído. b. O Positivo alto H. pylori IgA ELISA pré-diluído deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto o Controlo negativo ELISA pré-diluído não pode ter uma absorvância superior a 0,2. c. A absorvância do Positivo baixo H. pylori IgA ELISA deve ser mais do dobro da absorvância do Controlo negativo ELISA ou superior a 0,25. d. O Controlo negativo ELISA e o Positivo alto H. pylori IgA ELISA servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O Positivo alto H. pylori IgA ELISA não garante precisão no ponto de decisão do teste. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A da NCCLS 11 para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas. Cálculo dos resultados Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica média (DO) para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode ser calculada dividindo a DO média da amostra pela DO média do Positivo baixo H. pylori ELISA. O resultado é multiplicado pelo número de unidades do Positivo baixo H. pylori ELISA que se encontra especificado no rótulo. Densidade óptica da amostra Valor da amostra = x Positivo baixo H. pylori IgA ELISA (unidades) DO do Positivo baixo H. pylori IgA ELISA (unidades) A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num correspondente aumento ou diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de anticorpos não duplica a reactividade). Se for necessária uma quantificação mais exacta dos anticorpos do doente, será necessário efectuar diluições em série das amostras do doente, e a última diluição com resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o título de anticorpos do doente. Interpretação dos resultados O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças em populações de doentes. Os valores abaixo indicados são apenas valores sugeridos. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, baseados nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. 4

5 A amostras são interpretadas como negativas (negativo para o antibody de IgA aos H. pylori), equívocos, ou o positivo (antibody de IgA aos H. pylori detectados) de acordo com a tabela seguinte: Negativa 0,0 20,0 Unidades Equívocos 20,1 24,9 Unidades Positiva 25 Unidades Os espécimes equívocos devem ser reexaminados antes que os resultados estejam relatados. 1. O QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA deve ser efectuado e deve interpretado em conjunto com o ensaio QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA para a detecção de anticorpos IgG contra H. pylori. Algumas amostras podem ser negativas para anticorpos IgA contra o H. pylori e positivas para anticorpos IgG contra o H. pylori, enquanto que outras podem ser positivas para anticorpos IgA contra o H. pylori e negativas para anticorpos IgG contra o H. pylori. Não se encontram estabelecidos dados de desempenho/interpretação adequados para amostras positivas para anticorpos IgA contra o H. pylori e negativas para anticorpos IgG contra o H. pylori, podendo estar justificado um acompanhamento adicional. 2. Um resultado positivo indica apenas exposição imunológica prévia a H. pylori. Não pode distinguir uma infecção activa de uma infecção inactiva por H. pylori. A infecção activa é avaliada pela cultura de material de biópsia, através do teste respiratório com ureia 14 C ou através de outros métodos de detecção com urease. 3. Uma amostra com níveis equívocos de IgA contra o H. pylori não pode ser avaliada relativamente ao estado dos anticorpos. Se os resultados permanecerem equívocos depois da repetição do teste, o resultado deve ser reportado como equívoco e/ou deve ser colhida uma amostra adicional. 4. Um resultado negativo não indica anticorpos IgA contra o H. pylori ou níveis abaixo do limite de detecção do ensaio. Amostras colhidas muito precocemente durante a infecção primária podem não apresentar níveis detectáveis de anticorpos IgA. Caso se suspeite de uma infecção primária, deve ser colhida outra amostra em 4 a 6 semanas e testada no mesmo ensaio, simultaneamente com a amostra original. 5. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório devem incluir a declaração: Os seguintes resultados foram obtidos com INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA. Os valores de H. pylori obtidos através de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis de IgA descritos não pode ser correlacionada com um título final. Limitações do método 1. A presença de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente podem causar um aumento do nível de ligação não-específica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio. 2. Este teste destina-se a servir como auxílio no diagnóstico de infecção por H. pylori para indivíduos apresentando sintomas sugestivo de doença gastrintestinal e não se destina a ser utilizado com doentes assintomáticos. 3. Este teste pode ser utilizado para complementar mas não para substituir o despiste de anticorpos IgG contra o H. pylori. Os resultados de IgA contra o H. pylori em amostras não devem ser reportados sem os resultados correspondentes de IgG contra o H. pylori na amostra. 4. Um resultado negativo para IgA contra o H. pylori não exclui a presença de H. pylori, dado que muitos indivíduos com infecção prévia ou presente por H. pylori podem ser negativos para IgA contra o H. pylori. 5. Um resultado negativo de anticorpos IgA contra o H. pylori não exclui a presença de H. pylori, porque a concentração de anticorpos pode estar abaixo do limite de detecção do ensaio. 6. Podem obter-se resultados negativos se as amostras forem colhidas demasiado cedo no decurso da infecção, antes do desenvolvimento de anticorpos detectáveis. Caso se suspeite de infecção por H. pylori, devem obter-se novas amostras decorridas 4 a 6 semanas e testadas dentro paralelo com a primeira amostra. 7. Um resultado de teste positivo não permite distinguir entre infecção activa e colonização por H. pylori. 8. Um resultado de teste positivo só indica a presença de anticorpos contra o H. pylori e não indica necessariamente que esteja presente doença gastrintestinal. 9. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos. 10. Este ensaio não se encontra estabelecido para doentes com menos de 18 anos de idade. 11. As referências da literatura sugerem que anticorpos contra as espécies de Pseudomonas podem estabelecer reacções cruzadas com o H. pylori. O desempenho deste ensaio com soros contendo anticorpos anti-pseudomonas não foi avaliado. 12. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro. 5

6 Valores esperados Foi calculado que aproximadamente 50% da população mundial está infectada com H. pylori. Nos países em desenvolvimento, 50% ou mais da população é infectada pelo H. pylori antes dos 10 anos de idade, enquanto que em países desenvolvidos a infecção na infância é rara. A seroprevalência de anticorpos IgG contra o H. pylori aumenta cerca de 0,5 a 1,0% por ano com o aumento da idade (ou seja, uma seroprevalência de aproximadamente 60% para o grupo dos 60 anos de idade). 3,7,13,14 Os indivíduos infectados também mostraram produzir anticorpos IgA contra o H. pylori. Verificou-se que um pequeno número (2 a 7%) de indivíduos é positivo para anticorpos IgA contra o H. pylori e negativo para anticorpos IgG contra o H. pylori. 12,15,16,18 A capacidade do QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA para detectar anticorpos IgA contra o H. pylori foi avaliada por comparação com um ELISA IgA contra o H. pylori disponível no mercado e por avaliação de amostras de doentes clinicamente definidas. Os resultados do ELISA IgA contra o H. pylori disponível no mercado foi determinado de acordo com o folheto informativo do fabricante. Intervalo de valores normais Procedeu-se ao teste de um painel de 120 amostras colhidas em indivíduos assintomáticos, saudáveis (intervalo de idades 17-75, mediana 35) com o QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA. Das 120 amostras, verificou-se que 9% (11/120) eram positivas para IgA contra o H. pylori. Quando se excluíram as amostras positivas ou equívocas para IgG contra o H. pylori, 2,8% (3/105) foram positivas para anticorpos IgA contra o H. pylori (e negativas para anticorpos IgG contra o H. pylori). Tal produz uma especificidade calculada de 97,1% (102/105) [IC de 95% = 91,9-99,4]. Características de Desepenho Específico O desempenho do QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA foi comparado com um comercial IgA H. pylori ELISA predicado. Testaram-se 145 amostras submetidas para teste de anticorpos contra o H. pylori, 8 EQAS (programa de controle de qualidade externo), mais 100 amostras de indivíduos assintomáticos, saudáveis, com ambos os ensaios. Das 253 amostras, 130 foram positivas e 91 negativas com ambos os métodos. Quadro 1: IgA H. pylori ELISA Predicado + +/ QUANTA Lite % Concordância de positivos: 91,5% (130/142) H.pylori IgA ELISA +/ % Concordância de negativos: 90,1% (91/101) Amostras de estudo Testou-se um total de 111 amostras de soro arquivadas e colhidas em doentes apresentando infecção documentada por H. pylori por uma combinação de UBT, CLO histologia e/ou métodos de cultura utilizando o kit QUANTA Lite IgA H. pylori ELISA. Quadro 2: Método de referência + QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA +/- 8-3 Sensibilidade (não excluindo equiv.) = 90,1% (100/111), [95% CI =83,0%-94,9%] Estudo de reactividade cruzada Foi efectuado um estudo de adsorção para avaliar a reactividade cruzada de antigénios bacterianos com o INOVA QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA. Resumidamente, soros com vários níveis de anticorpos contra o H. pylori foram adsorvidos com antigénios de H. pylori, C. jejuni, C. coli, C. fetus ou E. coli e testaram-se amostras de soros sem tratamento e com tratamento no ensaio de IgA contra o H. pylori. Todas as amostras seropositivas para H. pylori permaneceram seropositivas quando absorvidas com antigénios diferentes de H. pylori. A inibição percentual média foi de 82% utilizando o antigénio H. pylori e de 10% quando se utilizaram antigénios derivados de outros microrganismos. Também se testou a reactividade cruzada decorrente da presença de anticorpos anti-nucleares (3 soros), factor reumatóide (3 soros), beta-2 microglobulina (3 soros), ou B. burgdorferi (11 soros), tendo-se demonstrado que não afecta a especificidade do INOVA QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA. Interferência Para determinar se a presença de níveis elevados de bilirrubina, hemoglobina, colesterol ou triglicéridos em amostras de soro interfere com o QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA, foram efectuados dois estudos. No primeiro, foram testadas 6 amostras de soro (4 positivas e 2 negativas para H. pylori) com e sem a adição de bilirrubina (40x o nível normal) ou hemoglobina (66x o nível normal). Um segundo estudo consistiu em submeter um soro positivo para H. pylori a soro contendo níveis elevados de colesterol (3), triglicéridos (1) ou bilirrubina (2). Embora a presença de níveis elevados de bilirrubina, hemoglobina ou colesterol não tenha aparentemente interferido com o ensaio, a presença de níveis elevados de triglicéridos (uma amostra) mostra alguma interferência. 6

7 Reprodutibilidade/Precisão O desempenho intra-ensaio foi avaliado testando 6 amostras, incluindo uma negativa, equívoca, positiva borderline, positiva baixa, positiva moderada e positiva elevada 12 vezes. Os resultados estão resumidos no Quadro 3. Quadro 3: Desempenho Intra-ensaio para o QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA Soro 1 Soro 2 Soro 3 Soro 4 Soro 5 Soro 6 Média 52, ,84 15,9 7,00 29,6 D.P. 2,15 2,18 0,72 1,2 0,68 1,19 C.V.% 4,74 3,8 1,77 7,56 9,72 4,03 O desempenho inter-ensaio foi avaliado testando 13 amostras incluindo uma negativa, positiva baixa, moderada e positiva elevada num total de seis vezes no decurso de três dias. Duas execuções por dia, uma de manhã e uma à tarde. Os resultados estão resumidos no Quadro 4. Quadro 4: Desempenho inter-ensaio para o QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA Soro 1 Soro 2 Soro 3 Soro 4 Soro 5 Soro 6 Soro 7 Soro 8 Soro 9 Soro 10 Soro 11 Soro 12Soro 13 Média 53,7 6,1 54, ,5 19,1 43,4 49,4 31,1 5,8 26,7 28,9 36,7 D.P. 1,25 0,25 3,8 3,94 1,65 0,87 1,46 1,97 1,53 0,35 1,38 2,48 2,51 C.V.% 2,3 4,1 6,9 7,4 9,5 4,6 3,4 4,0 4,9 6,0 5,2 8,6 6,9 7

8 Referências 1. Marshall BJ: Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, ii , Walsh JH and Peterson WL: The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. N.Engl. J. Med. 333(15): , Blaser MJ: Helicobacter pylori: its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15: , The Eurogast Study Group. An international association between H. pylori infection and gastric cancer. Lancet 341(8857): NIH Concensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease. JAMA , Malfertheiner P, et.al.: Current European concept in the management of Helicobacter pylori infection- the Maastricht concensus report. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 9:1-2, Hirschl AM, et. al.: Kinetics of specific IgG antibodies for monitoring the effect of anti- Helicobacter pylori chemotherapy. J. Infect. Dis. 168: Bourke B, Jones N, and Sherman P: Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in children. Ped. Infect. Dis. J. 15:1-13, Patel P, et. al.: Prospective screening of dyspeptic patients by Helicobacter pylori serology. Lancet. 346: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Internal quality Control: Principles and definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6), Kosunen T, et. al.: Diagnostic value of decreasing IgG, IgA and IgM antibody titers after eradication of Helicobacter pylori. Lancet 339: , Megraud F, et. Al.: Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J. Clin. Microbiol. 27: , Veldhuyzen SJO, et. al.: Increasing prevalence of H. pylori infection with Age: Continuous risk of infection in adults rather than cohort effect. J. Infect. Dis. 169:4347, Veenendaal RA: Long term serological surveillance after treatment of Helicobacter pylori infection. Gut 32: , Jaskowski TD, et. al.: Immunoglobulin A antibodies to Helicobacter pylori. J. Clin. Microbiol. 35(11): , Aromaa A, et. al.: Circulating Anti-Helicobacter pylori Immunoglobulin A antibodies and low serum pepsinogen 1 level are associated with increased risk of gastric cancer. Am. J. Epidem. 144(2): , Granberg C, et. al.: Diagnosis of Helicobacter pylori Infection by Using Pyloriset EIA-G and EIA-A for Detection of Serum Immunoglobulin G (IgG) and IgA Antibodies. J. Clin. Microbiol. 31(6): , Futagami S: Systemic and local immune responses against Helicobacter pylori urease in patient with chronic gastritis: distinct IgA and IgG productive sites. Gut 43: , Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service PRT November 2009 Revision 5 8