QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada

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1 QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica QUANTA Lite TM F-Actin IgA é um ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção semi-quantitativa de anticorpos IgA para o componente F-actina do músculo liso no soro humano. Em pacientes com historial clínico consistente com doença celíaca, a presença de anticorpos anti-f-actina IgA podem ajudar a avaliar a probabilidade de atrofia vilosa intestinal significativa. Resumo e Explicação do teste Os auto-anticorpos anti-f-actina são o principal componente do que foi denominado de anticorpos músculo liso (ASMA). Estes anticorpos apresentam uma especificidade em relação ao componente F-Actina do citosqueleto e são tradicionalmente detectados por imunofluorescência indirecta usando finas secções de fígado, rim ou estômago de rato como substrato. 1-3 Os anticorpos de músculo liso são dirigidos para vários componentes, o mais importante dos quais é a F-Actina, mas a imunofluorescência também pode detectar anticorpos a tubulina e filamentos intermédios. 4,5 Em pacientes com hepatite auto-imune (AIH), a reactividade anti-músculo liso reflecte principalmente anticorpos anti-f-actina, enquanto em infecções virais como a mononucleose infecciosa, hepatite viral, sarampo e papeira, a reactividade anti-músculo liso deve-se à reactividade a antigenes citoplásmicos não F-Actina. 4-8 Os anticorpos IgG anti-f-actina foram reportados em 52 a 85% dos pacientes com AIH e em 22% dos pacientes com cirrose biliar primária (PBC). 7-9,12-16 Os anticorpos IgG anti-f-actina (habitualmente de baixa titulação) foram reportados em 3 a 18% dos soros de população geral saudável. 17 Em contraste com os anticorpos IgG anti-f-actina que são característicos de pacientes com hepatite autoimune, os anticorpos IgA anti-f-actina são clinicamente relevantes em pacientes com doença celíaca. Estudos recentes concluíram que os anticorpos IgA de F-Actina mostram uma forte correlação com o grau de atrofia vilosa intestinal presente em pacientes com doença celíaca Clemente et al, usando um teste imunofluorescente (IFA) para a detecção de anticorpos IgA anti-f-actina es eritrócitos especialmente tratados, concluíram que 98,2% dos pacientes celíacos com mucosa plana, 89% dos pacientes com atrofia vilosa subtotal, 30% dos pacientes com atrofia vilosa parcial e 0% dos controlos negativos endomisiais e transglutaminase tecidular foram positivos a anticorpos IgA anti-f-actina. 25 Pedreira, S. et al. reportaram que 95% de pacientes com doença celíaca não tratada apresentavam valores superiores de anticorpos IgA anti-f-actina comparado com controlos normais. 23 Este grupo também descobriu que a titulação mais elevada de anticorpos anti-f-actina de correlacionava com ferimentos intestinais mais graves. Os anticorpos IgA anti-f-actina diminuem após a instituição de uma dieta sem glúten e sugere-se que a medição destes anticorpos pode ter um papel na monitorização da conformidade da dieta sem glúten. 22 Os procedimentos de imunofluorescência para a detecção de F-actina ou de anticorpos de músculo liso são subjectivos, com o desempenho do ensaio a depender do tipo de tecido usado, da especificidade do conjugado, da potência do sistema microscópico usado para ler o resultado, assim como da experiência técnica do observador. Os métodos ELISA para a detecção de anticorpos F-Actina, reportados pela primeira vez em meados dos anos 80 a princípio dos anos 90 4,5,7,8, têm o potencial para um desempenho automatizável e mais normalizado, menos tecnicamente exigente. 7,9-12 Princípio do método O antigénio F-actina purificado é ligado aos poços da placa de micropoços de poliestireno sob condições que vão preservar o antigénio no seu estado nativo. Os controlos pré-diluídos e soro diluído dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos F-Actin IgA presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgA anti-humano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controlo. Reagentes 1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno revestidos com antigénios purificados F-Actin (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos F-Actin, pré-diluído, 1,2 ml 3. Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos F-Actin, pré-diluído, 1,2 ml 4. Positivo Alto F-Actin IgA ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos F-Actin, pré-diluído, 1,2 ml 5. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor-de-rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 6. Solução de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 7. Conjugado HRP IgA, (de cabra), IgA anti-humana, 1 frasco de cor amarela com tampão, 1

2 estabilizadores proteicos e conservantes, 10ml 8. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 9. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA, o Positivo Alto F-Actin IgA ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a aspiração insuficiente dos líquidos dos poços ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do conjugado HRP para evitar estas ocorrências. 9. A contaminação química do conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação do conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras dos micropoços revestidas com antigénios que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8º C. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C. Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A3 da NCCLS recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura 2

3 ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. 29 Procedimento Material fornecido 1 Placa de micropoços F-Actin ELISA (12-1 x 8 poços), com suporte 1 1,2 ml Controlo Negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo Alto F-Actin IgA ELISA, pré-diluído 1 50 ml Diluente da amostra HRP 1 25 ml Solução de lavagem HRP, 40x concentrado 1 10ml Conjugado HRP IgA, (de cabra), IgA anti-humana 1 10 ml Cromogénio TMB 1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M Material adicional necessário mas não fornecido Micropipetas de 5, 100, e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para Solução de lavagem HRP diluída Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda) Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de Solução de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantémse estável durante uma semana a 2-8º C. 3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de diluente da amostra HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR o Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA, o Positivo Alto F-Actin IgA ELISA e o Controlo Negativo ELISA. 4. A determinação da presença ou ausência de F-Actin IgA utilizando unidades arbitrárias requer o uso de dois poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra. Recomendase que as amostras sejam testadas em duplicado. Técnica 1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água. 2. Adicione 100 µl do Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA, do Positivo Alto F-Actin IgA ELISA, do Controlo Negativo ELISA pré-diluídos e das amostras diluídas dos doentes aos poços. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra. 3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione µl de solução de lavagem HRP diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na adição das amostras. 4. Adicione 100 μl do conjugado HRP IgA a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no passo Lavagem: Repita o passo Adicione 100 µl do cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente. 7. Adicione 100 µl de solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da Solução de paragem HRP, tal como efectuado para o Cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços. 8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm. 3

4 Controlo de qualidade 1. O Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA, o Positivo Alto F-Actin IgA ELISA e o Controlo Negativo ELISA devem ser processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. 2. Note que uma vez que o Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA, o Positivo Alto F-Actin IgA ELISA e o Controlo Negativo ELISA se encontram pré-diluídos, estes não controlam o procedimento associado à diluição das amostras. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20 C. 4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do Positivo Alto F-Actin IgA ELISA pré-diluído deve ser superior à absorvância do Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA pré-diluído, que deve ser superior à absorvância do Controlo Negativo ELISA pré-diluído. b. O Positivo Alto F-Actin IgA ELISA pré-diluído deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto o Controlo Negativo ELISA pré-diluído não pode ter uma absorvância superior a 0,2. c. A absorvância do Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA deve ser mais do dobro da absorvância do Controlo Negativo ELISA ou superior a 0,25. d. O Controlo Negativo ELISA e o Positivo Alto F-Actin IgA ELISA servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O Positivo Alto F-Actin IgA ELISA não consegue assegurar a precisão no ponto de decisão do ensaio. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A3 da NCCLS para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas. 30 Cálculo dos resultados Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica média (DO) para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode ser calculada dividindo a DO média da amostra pela DO média do Positivo Baixo da F-Actin IgA ELISA. O resultado é multiplicado pelo número de unidades do Positivo baixo F-Actin IgA ELISA que se encontram no rótulo. Densidade óptica da amostra Valor da amostra = x Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA (unidades) DO do Positivo Baixo F-Actin IgA ELISA (unidades) A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num respectivo aumento ou diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de anticorpos não duplica a reactividade). Se for necessária uma quantificação mais exacta dos anticorpos do doente, será necessário efectuar diluições em série das amostras do doente, e a última diluição com resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o título de anticorpos do doente. Interpretação dos resultados O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças nas populações de doentes. Os valores abaixo indicados são apenas valores sugeridos. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, com base nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. As amostras são interpretadas como negativas, equivocos ou positivas de acordo com a tabela abaixo: Unidades Negativa < 20 Equivocos 20,1 24,9 Positiva > Um resultado positivo de IgA anti-f-actina em pacientes com doença celíaca indica uma maior probabilidade de atrofia vilosa intestinal grave. 2. Um resultado negativo indica ausência do anticorpo F-Actin IgA ou níveis abaixo do ponto de decisão do ensaio. 3. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório incluam a declaração: Os resultados apresentados foram obtidos com o dispositivo INOVA QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA. Valores de F-Actin IgA obtidos através de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis IgA descritos não pode ser correlacionada a um título final. Limitações do método 1. A presença de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente pode causar um aumento do nível de ligação não-específica e produzir resultados falsos positivos neste ensaio. 2. Nem todos os pacientes celíacos são positivos a anticorpos IgA F-Actina. 3. Nem todas as amostras positivas de músculo liso têm anticorpos IgA F-actina. 4

5 4. A detecção de anticorpos IgA F-actina em pacientes com doença hepática deve ser interpretada com cuidado, uma vez que a presença de anticorpos IgG F-actina neste grupo é frequentemente acompanhada de anticorpos IgA F-Actina que podem não se relacionar com a patologia intestinal. Os anticorpos IgA F-Actina devem ser avaliados apenas em pacientes com doença celíaca como ajuda à avaliação do dano intestinal. 5. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos. 6. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro. Dados técnicos Valores esperados Intervalo de valores normais Foram testadas 500 amostras recolhidas de indivíduos aparentemente saudáveis (250 homens e 250 mulheres) com o kit QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA. As idades variaram entre os anos (média=41). A especificidade do ensaio foi de 92,2% (461/500). Três destas amostras foram positivas a anticorpos IgA ttg e podem, portanto, ser pacientes celíacos não diagnosticados. Uma das três amostras também foi positiva a endomisial e é virtualmente certo ser verdadeira celíaca. A prevalência da doença celíaca na população normal dos EUA foi calculada em 1:133 e, portanto, não se espera a detecção de doentes celíacos não diagnosticados no coorte normal. 26 Sensibilidade e Especificidade Clínica Uma vez que a utilização prevista do teste QUANTA Lite TM F-Actin IgA é avaliar a probabilidade do dano intestinal em pacientes com doença celíaca, a sensibilidade e especificidade foi calculada em 445 amostras com resultados por biópsia. Das 445 amostras, 157 possuíam patologia Marsh 3 e 288 possuíam Marsh 0, 1, ou N =445 Marsh Contagem F-Actin IgA Unidades M3a/b/c M0,M1,M2 Total Pos (>24,9 unidades) Neg (<24,9 unidades) Total Os resultados equívocos contaram como negativos (i.e. não positivos) Sensibilidade Clínica: 48,4% (76/157) (95% CI, 40,4% to 56,5%) Especificidade Clínica: 95,1% (274/288) (92,0 97.3%) Positiva Previsão valor: 84,4% Negativa Previsão valor: 88,4% Eficiência: 78,7% Se os cálculos forem efectuados usando apenas M3c (atrofia vilosa total) como índice de referência, a sensibilidade e especificidade são 59,4% e 91,3% respectivamente como indicado abaixo. N =445 Marsh Contagem F-Actin IgA Unidades M3c Non-M3c Total Pos (>24,9 unidades) Neg (<24,9 unidades) Total Os resultados equívocos contaram como negativos (i.e. não positivos) Sensibilidade Clínica: 59,4% (60/101) (95% CI, 49,2% to 69,1%) Especificidade Clínica: 91,3% (314/344) (87,7 94,0%) Positiva Previsão valor: 66,7% Negativa Previsão valor: 88,5 Eficiência: 78,7% Comparação com dispositivo implicado O ELISA QUANTA Lite TM F-Actin IgA foi comparado a um dispositivo autorizado pela FDA para a detecção de anticorpos IgA de transglutaminase tecidular marcador de doença celíaca (ttg). O acordo de percentagem positiva foi de 74/128 = 57,8% e o acordo de percentagem negativa de 27/29 = 93,1% quando os pacientes celíacos com Marsh 3a 3b, ou 3c foram testados com os dois dispositivos. Quando foram testados apenas indivíduos com patologia Marsh 3c (atrofia vilosa total), o acordo de percentagem positiva foi de 60/98 = 61,2% e o acordo da percentagem negativa de 3/3 = 100%. Enquanto a maior parte das amostras positivas IgA F-Actina também eram positivas a ttg, só eram positivos a IgA F-actina pacientes celíacos com danos intestinais graves. Reactividade cruzada Foram testadas amostras de soro de 36 pacientes com anticorpos de doença auto-imune/infecciosa ou soro de estado de doença específico incluindo células parietais, RNP, SS-A,SS-B, Scl-70, Jo-1, membrana basal glomerular, LKM-1, antigene solúvel do fígado, centrómero, cromatina, hepatite auto-imune, cirrose biliar primária, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, colangite esclerosante primária, a reactividade cruzada 5

6 com o ELISA QUANTA Lite TM F-Actin IgA. Várias amostras com doença hepática foram positivas a anticorpos IgA F-Actina. A detecção de anticorpos IgA F-actina em pacientes com doença hepática deve ser interpretada com cuidado, uma vez que a presença de anticorpos IgG F-actina neste grupo é frequentemente acompanhada de anticorpos IgA F-Actina que podem não se relacionar com a patologia intestinal. Precisão e Reprodutibilidade O desempenho entre ensaios foi avaliado examinando-se 6 amostras num total de 7 vezes cada. Tabela 1: Desempenho entre ensaios do ELISA QUANTA Lite TM F-Actin IgA Spec.1 Spec.2 Spec.3 Spec.4 Spec.5 Spec.6 Unidades médias 104, , ,4 Desvio padrão 2,4 7 0,3 1,5 0,4 0,4 Coeficiente de variação% 2,3 4,6 0,9 3,8 3,0 2,6 O desempenho inter-ensaio foi avaliado pelo teste em duplicado de 6 amostras com o kit de controlo altamente positivo (HPC) e controlo negativo (NC) duas vezes por dia (uma vez pela manhã e uma vez à tarde), durante 3 dias. Tabela 2: Desempenho inter-ensaios do ELISA QUANTA Lite TM F-Actin IgA (HPC) Spec.1 Spec.2 Spec.3 Spec.4 Spec.5 Spec.6 NC Unidades médias 78,3 104,8 156,8 41,5 41,1 14,8 17,0 1,0 Desvio padrão 4,7 6,6 5,8 1,7 2,6 0,7 0,8 0,1 Coeficiente de variação% 6,0 6,3 3,7 4,2 6,4 5,0 4,7 10,5 Referências 1. Gabbiani, G. et al. Human smooth muscle autoantibody. Its identification as antiactin antibody and a study of its binding to "nonmuscular" cells. Am J Pathol 72, (1973). 2. Anderson, P. Studies on the specificity of smooth-muscle antibodies. Clin Exp Immunol 26, (1976). 3. Bottazzo, G. F. et al. Classification of smooth muscle autoantibodies detected by immunofluorescence. J Clin Pathol 29, (1976). 4. Toh, B. H. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin Exp Immunol 38, (1979). 5. Toh, B. H. et al. Viral infections and IgM autoantibodies to cytoplasmic intermediate filaments. Clin Exp Immunol 37, (1979). 6. Andersen, P., Small, J. V., Andersen, H. K. & Sobieszek, A. Reactivity of smooth-muscle antibodies with F- and G-actin. Immunology 37, (1979). 7. Bretherton, L. et al. ELISA assay for IgG autoantibody to G-actin: comparison of chronic active hepatitis and acute viral hepatitis. Clin Exp Immunol 51, (1983). 8. Kurki, P. Determination of anti-actin antibodies by a solid-phase immunoenzymatic assay and by indirect immunofluorescence technique. Clin Immunol Immunopathol 11, (1978). 9. Dighiero, G., Lymberi, P., Monot, C. & Abuaf, N. Sera with high levels of anti-smooth muscle and anti-mitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin Exp Immunol 82, 52-6 (1990). 10. De Scheerder, I. et al. Post-cardiac injury syndrome and an increased humoral immune response against the major contractile proteins (actin and myosin). Am J Cardiol 56, (1985). 11. Leibovitch, L., George, J., Levi, Y., Bakimer, R. & Shoenfeld, Y. Anti-actin antibodies in sera from patients with autoimmune liver diseases and patients with carcinomas by ELISA. Immunol Lett 48, (1995). 12. Frenzel, C. et al. Evaluation of F-Actin ELISA for the diagnosis of autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol 101, (2006). 13. Czaja, A. J., Cassani, F., Cataleta, M., Valentini, P. & Bianchi, F. B. Frequency and significance of antibodies to actin in type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 24, (1996). 14. Kurki, P. et al. Different types of smooth muscle antibodies in chronic active hepatitis and primary biliary cirrhosis: their diagnostic and prognostic significance. Gut 21, (1980). 15. Granito, A. et al. Antibodies to filamentous actin (F-Actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 59, (2006). 16. Liaskos, C., Bogdanos, D. P., Davies, E. T. & Dalekos, G. N. Diagnostic relevance of anti-filamentous actin antibodies in autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 60, (2007). 17. Fagraeus, A. & Norberg, R. Anti-actin antibodies. Curr Top Microbiol Immunol 82, 1-13 (1978). 18. Carroccio, A. et al. IgA anti-actin antibodies ELISA in coeliac disease: A multicentre study. Dig Liver Dis 39, (2007). 19. Carroccio, A. et al. Anti-actin antibodies in celiac disease: correlation with intestinal mucosa damage and comparison of ELISA with the immunofluorescence assay. Clin Chem 51, (2005). 20. Clemente, M. G. et al. Immune reaction against the cytoskeleton in coeliac disease. Gut 47,520-6 (2000). 21. Clemente, M. G. et al. Detection of Autoantibodies against Enterocyte Actin Filaments as Serological Predictive Test for Intestinal Villous Atrophy in Celiac Disease: Results of a Polycentric Study. Gastroenterology 124, A-660 (2003). 22. Granito, A. et al. Anti-actin IgA antibodies in severe coeliac disease. Clin Exp Immunol 137, (2004). 6

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