QUANTA Lite Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada. C1q CIC ELISA

Transcrição

1 QUANTA Lite Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada C1q CIC ELISA Aplicação Diagnóstica Este kit destina-se à quantificação dos imunocomplexos circulantes (CIC),in-vitro, os quais se ligam aos dos C1q presente no soro humano. Tem como objectivo a determinação de CIC no soro de doentes com doenças autoimunes e outras relacionadas com os CIC, sendo utilizado em conjugação com outros dados clínicos. O kit contém reagentes suficientes para testar até 41 amostras em duplicado ou 89 amostras simples em conjunto com a curva de calibração e dois controlos, um positivo e outro negativo. Resumo e Explicação do teste As inter-reacções antigénio-anticorpo podem dar origem à formação de imunocomplexos. Isto faz parte da função imunológica continua normal do organismo. Os antigénios podem ser fixados no tecido ou libertados no plasma ou para outros fluidos corporais formando imunocomplexos. Normalmente, os CIC são removidos através do sistema reticulo-endotelial. Contudo, elevados depósitos de imunocomplexos nas estruturas vasculares com activação subsequente de pathways inflamatórios tais como a cascata do complemento, podem dar origem a uma doença por imunocomplexos, associada a danificação dos tecidos. O destino a dar a estes complexos depende de um número de variáveis, nomeadamente a natureza do antigénio e do anticorpo, o tamanho do complexo, a percentagem de produção e a integridade funcional do sistema fagócitico. Devido ao papel patogénico dos CIC em muitas doenças, foram desenvolvidos métodos específicos para os detectar. Estes consideram as propriedades físico-químicas específicas dos CIC e/ou a sua capacidade de ligação à superfície das células ex. células Raji e plaquetas, ou moléculas tais como a C1q 1, 2, 3. Por estas razões, um estudo efectuado pela OMS recomenda que a determinação dos CIC seja efectuada com a utilização de, pelo menos, dois métodos de análise diferentes 4. A determinação das concentrações dos C1q ligador ao CIC no soro por ELISA é considerado um meio de prognóstico importante 5. É particularmente recomendado na monitorização dos níveis de CIC em doentes com Lúpus Eritematoso Sistémico, onde os níveis variam consoante a actividade da doença e as respostas do complemento 6. Princípio do método Os poços da microplaca estão revestidos com C1q purificado. Os calibradores, controlos e amostras diluídas dos doentes são pipetados nos poços e o complexo de ligação de C1q liga-se ao C1q durante a primeira incubação. Após a lavagem dos poços, para a remoção das proteínas que não se ligaram, é adicionado o conjugado purificado de cabra anti-igg marcado com peroxidase. O conjugado liga-se ao imunocomplexo capturado e o excesso de conjugado que não se ligou é removido através da lavagem posterior. Após a adição do substrato 3,3,5,5 Tetrametilbenzidina (TMB) forma-se um produto de cor azul, cuja intensidade é proporcional à concentração de CIC na amostra. Posteriormente é adicionado ácido sulfúrico a cada poço produzindo uma cor amarela para parar a reacção. A leitura é realizada a um comprimento de onda de 450nm. A concentração de CIC na amostra é obtida directamente da curva de calibração, sendo os resultados expressos como equivalentes de IgG humana agregada por ml (μg Eq/mL). Reagentes 1. Placa de ELISA de micropoços de poliestireno revestidos humano C1q antígeno (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos a 3. Calibrador A C1q CIC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada a 4. Calibrador B C1q CIC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada a 5. Calibrador C C1q CIC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada a 6. Calibrador D C1q CIC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada a 7. Calibrador E C1q CIC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada a 8. Controlo Positivo C1q CIC, 1 frasco de solução tampão com conservantes e 1 frasco de solução tampão com conservantes e de IgG humana agregada a 9. Diluente da amostra Type III, 2 frascos cor-de-amarelo, contém, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 10. Solução de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 11. Conjugado HRP C1q CIC IgG, 1 frasco de cor azul com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 12. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 13. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml 1

2 Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) nos diluente da amostra, controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. Diluente da amostra contém Proclin 150. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 2. Todo o material de origem humana, utilizado na preparação dos controlos para este produto foi testado e deu resultados negativos para testes aprovados pela FDA em relação a anticorpos anti HBsAg, HIV e HCV. Contudo nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência destes anticorpos ou outros agentes infecciosos. Assim os controlos e calibradores C1q CIC manipulados como material 8 potencialmente infectante. 3. A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O Conjugado HRP C1q CIC IgG contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. Deve seguir-se as instruções com rigor. 3. Qualquer alteração pode ter efeito na prestação do teste, e nos resultados obtidos. Tomar atenção a Notas específicas e avisos ao longo das instruções de uso. 4. Utilizar sempre os reagentes do mesmo lote. Caso se realize um número elevado de testes dever-se-á verificar se todos os reagentes pertencem ao MESMO lote. As tiras devem ser provenientes do mesmo invólucro. A substituição de qualquer componente do kit pode induzir a resultados incorrectos. 5. Para evitar quaisquer contaminações dos reagentes utilizar pontas descartáveis de plástico/vidro. Nunca repor nos frascos originais reagentes não utilizados 6. Não deixar os recipientes dos reagentes destapados, qualquer evaporação ou contaminação pode levar a resultados inconsistentes. 7. O substrato TMB não dever ser exposto ao contacto com a luz ou água. 8. Não devem ser utilizados soros contaminados, hemolisados ou lipémicos e amostras que contenham partículas em suspensão. 9. A diluição não pode ser verificada visto que os controlos estão prontos a usar. Recomenda-se a utilização de pipetas calibradas e de soro de Controlo de Qualidade interno (CQ). 10. A utilização de sistemas automáticos para o teste, diluição das amostras e outros aparelhos automáticos pode conduzir a diferenças nos resultados quando comparados com o procedimento manual. É da responsabilidade de qualquer laboratório a validação do sistema com o qual está a trabalhar, e assegurar que os resultados se encontram dentro dos limites definidos pelas instruções de uso e pelo certificado de CQ associado. 11. Todo o equipamento utilizado deve ser calibrado e conservado de acordo com as instruções do fabricante. Precauções particulares de conservação 1. O kit deve ser conservado entre 2-8ºC e NÃO deve ser congelado. A conservação a temperaturas impróprias irão afectar os resultados. 2. O tampão de lavagem diluído pode ser conservado a 2-8ºC até 1 semana. 3. A data de validade do kit está mencionada no rótulo exterior. Colheita da amostra 1. As amostras de sangue devem ser colhidas por punção venosa de modo a permitir a formação do coágulo naturalmente e a separação do soro. 2. O soro pode ser conservado de 2-8ºC até 7 dias antes do teste 7, ou em aliquotas a -20ºC ou menos, para períodos mais prolongados. 3. Devem evitar-se descongelamentos e congelamentos sucessivos. 4. As amostras de soro não devem ser inactivadas pelo calor, pois poder-se-á obter resultados falsos positivos. Procedimento Material fornecido Instruções de uso: Fornece instruções detalhadas do teste. Certificado CQ: Indica a performance esperada para o lote. Microplaca revestida com C1q CIC: 12 tiras fraccionáveis constituídas por 8 poços cada evestidos com humano C1q. Cada microplaca é embalada num invólucro hermeticamente fechado e contém dois pacotes de exsicante. Controlo negativo ELISA: 1 frasco. Contém 1,2mL de soro humano diluído. Os valores esperados encontramse no certificado do CQ. Pronto a usar. 2

3 Calibradores C1q CIC: 5 frascos, com 1,2mL de IgG humana agregada, com as seguintes concentrações de imunocomplexos: 100; 33,3; 11,1; 3,7; 1,23µg Eq/mL. Prontos a usar. Controlo positivo C1q CIC: 1 frasco. Contém 1,2mL de IgG humana agregada diluído. Os valores esperados encontram-se no certificado do CQ. Pronto a usar. Diluente da amostra, Type III: 2 frascos. Contém 50mL de tampão para a diluição da amostra. Com coloração de-amarelo e pronto a usar. Solução de lavagem HRP (40x): 1 frasco. Contém 25mL de tampão de lavagem concentrado 40 vezes, para lavagem dos poços das placas. Conjugado HRP C1q CIC IgG: 1 frasco. Contém 10mL de anticorpo anti-igg humana marcado com peroxidase, de coloração azul. Pronto a usar. TMB Cromogénio: 1 frasco. Contém. 10mL de cromogénio TMB. Pronto a usar. Solução de paragem HRP: 1 frasco. Contém 10mL de ácido sulfúrico a 0,344M. Pronto a usar. Material adicional necessário mas não fornecido Lavador automático de microplacas: É o mais recomendado, no entanto a lavagem pode ser efectuada manualmente. Leitor de microplacas: Para efectuar leituras de densidade óptica a 450nm contra o ar. Água destilada ou desionisada: A água deve ser de elevada qualidade. Micropipetas calibradas: Para a pipetagem de 1000, 100 e 10µL. Pipeta multicanal: Recomendado para a pipetagem de volumes de 100µL do conjugado, substrato e solução de paragem. Pontas de plástico/vidro: Para a diluição das amostras. Método Antes de iniciar 1. Conduzir o kit à temperatura ambiente O kit foi desenvolvido para a realização dos testes à temperatura ambiente (20-24 C). Retirar o kit do frigorifico e deixa-lo à temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. As microplacas não devem ser retiradas do invólucro antes deste se encontrar à temperatura ambiente. Nota: Este kit pode ser conservado à temperatura ambiente até uma semana. 2. Componentes do kit Agitar suavemente todos os componentes do kit, antes de usar. 3. Diluição do tampão de lavagem Diluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de Solução de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantém-se estável durante uma semana a 2-8º C. 4. Diluição da amostra Diluir 10µL de cada amostra com 1000µL de diluente da amostra (1:101) e misturar bem. Nota: Após a sua diluição a amostra deve ser utilizada nas 8 horas seguintes. 5. Manuseamento das tiras e do moldura das tiras Colocar o número de tiras necessárias na moldura da microplaca e fixá-las pelas extremidades, posicionar-se no poço A1 e preencher as colunas da microplaca da esquerda para a direita. Nota: Repor, de imediato, as tiras não utilizadas, no invólucro com os dois sacos de exsicante e fecha-los novamente de modo a minimizar a exposição ao ar. Cuidado para não perfurar ou rasgar o invólucro. AVISO: A exposição das tiras à humidade ou a contaminação pelo ar ou por outras partículas pode resultar na deterioração do antigénio, conduzindo à perda de precisão do teste bem como a resultados falsos. Técnica 1. Amostra Pipetar 100µL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:101) nos poços da microplaca. Nota: As amostras devem ser pipetadas de imediato, o tempo de incubação começa a contar após a pipetagem da última amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. 2. Lavagem Os passos de lavagem são passos críticos e requerem uma atenção especial. A lavagem dos poços quando realizada de modo inadequado, pode conduzir a resultados pouco precisos e a um elevado background. Após a incubação lavar a microplaca 3 vezes com µL tampão de lavagem, por poço. A microplaca deve ser lavada com um lavador automático de microplacas ou manualmente de acordo com as indicações abaixo. Após a lavagem de modo automático, inverter a microplaca sobre papel absorvente, batendo suavemente, de modo a secar os poços completamente. Lavagem manual das microplacas: a. Deitar fora o conteúdo dos poços. b. Bater suavemente com a microplaca invertida sobre papel absorvente. c. Encher cada poço com µL de tampão de lavagem utilizando uma pipeta multicanal. d. Agitar suavemente a microplaca numa superfície plana. e. Repetir os passos de a-d duas vezes. f. Repetir a e b. 3. Adição do conjugado Pipetar 100µL de conjugado em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modo a remover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso de conjugado no frasco correspondente. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. 4. Lavagem Repetir o descrito no passo 2. 3

4 5. Adição de substrato (TMB) Pipetar 100µL de substrato (TMB) em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modo a remover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso de substrato (TMB) no frasco correspondente. Incubar, no escuro, à temperatura ambiente durante 30 minutos. 6. Paragem da reacção Pipetar 100µL de solução de paragem em cada poço. Dá-se uma mudança de cor de azul para amarelo. 7. Leitura da densidade óptica Ler a densidade óptica (DO) de cada poço a 450nm, num leitor de microplacas até 30 minutos após a paragem da reacção. Controlo de qualidade 1. Controlo de qualidade Para que o teste seja válido, tem que obedecer aos seguintes critérios: Os calibradores e controlos positivo e negativo devem estar incluídos em cada série. Os valores obtidos para todos os controlos devem encontrar-se dentro do intervalo especificado pelo Certificado de CQ. A curva obtida deve ser similar à curva de calibração evidenciada no Certificado CQ. Caso os critérios acima referidos não sejam respeitados, o teste é considerado inválido e o teste deve ser repetido. 2. Cálculo da média das densidades ópticas (somente para os ensaios realizados em duplicado) Para cada calibrador, controlo ou amostra calcular a média da DO das leituras em duplicado. A percentagem do coeficiente de variação (%C.V.) para cada DO em duplicado deverá ser inferior a 15%. 3. Curva de calibração A curva de calibração pode ser traçada automaticamente ou manualmente, colocando a concentração de imunocomplexos em µg Eq/mL na escala logarítmica e as DO de cada calibrador na escala linear. Automaticamente utilizar um software adequado. Manualmente utilizar um papel log/linear, traçar a melhor curva através dos pontos obtidos, (não traçar uma linha recta, ou unir ponto por ponto). 4. Tratamento de pontos anómalos Caso algum ponto se encontre fora da curva de calibração, este poderá ser retirado. A ausência deste significa que a curva tem uma forma diferente da curva de calibração ou caso exista mais que um ponto fora da curva, o teste deverá ser repetido. 5. Cálculo dos valores CIC dos controlos e das amostras Determinar o nível dos imunocomplexos ligados nos controlos e nas amostras diluídas directamente a partir da curva de calibração. Os valores devem estar compreendidos entre o intervalo fornecido no Certificado do CQ. Nota: Os valores do calibrador foram ajustados por um factor de 100 para uma diluição de amostra de 1:101. Não é necessário mais nenhum tipo de correcção. 6. Calibração do teste O teste é calibrado em µg Eq/mL por um calibrador de referência interno, cujos valores foram atribuídos segundo a preparação de referência da OMS para IgG humana agregada. Limitações do método 1. Este kit é utilizado somente para diagnóstico. Um resultado positivo deve ser confirmado através de outros dados clínicos e outros testes serológicos. 2. Os resultados obtidos com este teste não constituem prova de diagnóstico da presença ou ausência da doença. 3. O soro poderá conter substâncias interferentes tais como agentes quelantes, ADN, autoanticorpos anti- C1q, factor reumatóide ou imunoglobulina monomérica. Valores esperados O intervalo de referência foi determinado, utilizando soros de 200 dadores adultos saudáveis. O limite superior deste intervalo é expresso em μg equivalente por ml (μg Eq/mL). O intervalo descrito em baixo serve apenas de referência. Os testes de ELISA são muito sensíveis e capazes de detectar pequenas diferenças nas amostras. Recomenda-se que cada laboratório determine os seus intervalos de referência, baseando-se em técnicas e equipamento utilizado. Valores esperados < 4,4μg Eq/mL Resultado negativo 4,4 -<10,8µg Eq/mL Dúbio 10,8μg Eq/mL Resultado positivo Intervalo de valores normais Foram determinados os níveis de C1q-CIC em 200 amostras de soro de doadores saudáveis. Os resultados estão representados no gráfico abaixo. Os C1q-CIC encontram-se esporadicamente na população saudável como resultado de uma infecção, podendo também apresentar níveis elevados após a injestão de comida. Para chegar a um valor lógico de cut-off para amostras verdadeiramente normais, as amostras elevadas foram eliminadas através de três ciclos de repetição, resultando num cut-off de 4,4µg Eq/mL. Foi estabelecido um intervalo incerto entre 4,4 e 10,8µg Eq/mL, sendo 10,8µg Eq/mL um resultado positivo. Com base neste, 9/200 amostras normais obtiveram resultados positivos com valores entre 11,6-13,5µg Eq/mL. 4

5 Distribuição normal da amostra No. de amostras >10 C1q CIC ug Eq/mL Este intervalo é fornecido apenas como referência. Recomenda-se que cada laboratório determine os seus intervalos de referência. Características de desempenho Precisão A precisão intra- e inter-testes foi determinada utilizando três amostras dentro do intervalo da curva de calibração. A concentração e % C.V. para cada amostra está representada abaixo: PRECISÃO INTER-TESTE n=3 Concentração (μg Eq/mL) % C.V. Amostra 1 5,4 13,0 Amostra 2 28,7 7,1 Amostra 3 50,7 3,9 PRECISÃO INTRA-TESTE n=16 Concentração (μg Eq/mL) % C.V. Amostra 4 5,3 7,2 Amostra 5 24,0 5,5 Amostra 6 67,4 7,5 Sensibilidade Analítico A sensibilidade foi determinada calculando a concentração média + 2 DP de 20 determinações do diluente da amostra. O valor obtido é igual a 0,1μg Eq/mL. Especificidade, Sensibilidade e Concordãncia Relativas A especificidade, sensibilidade e concordância foram determinadas com base num kit alternativo de CIC-C1q EIA, tendo sido testadas 48 amostras, incluindo 29 de dadores adultos e 12 de doentes de SLE. EIA alternativo + dúbio BINDAZYME dúbio C1q-CIC EIA Sensibilidade relativa 95,0% Especificidade relativa 75,0% Concordância relativa 83,3% Para o cálculo da sensibilidade, especificidade e concordância relativas, os valores dúbios foram considerados com positivos. A correlação dos valores dos dois kits deu uma R 2 de 0,80. Substância Interferentes Foram testados vários tipos de soro de modo a verificar o possível efeito de substâncias interferentes utilizando um kit de verificação de substâncias interferentes Interference Check A plus TM - Kokusai, Shiyaku, Japão). Substância Bilirubina F (livre) Bilirubina C (conjugada) Hemoglobina hemolisada quilo Factor reumatóide Concentração 18,3mg/dL 19,0mg/dL 490mg/dL 1930 Unidades 500 IU/mL Não foram detectadas quaisquer interferências para as concentrações acima referidas de bilirubina, hemoglobina ou quilo, contudo o factor reumatóide (FR) interfere, devem ser efectuado um rastreio das amostras que contenham factor reumatóide através de um teste de FR apropriado antes da determinação de C1q CIC. 5

6 Intervalo de Leitura O intervalo de leitura do teste é de 1,23-100µg Eq/mL. Esquema da Microplaca A B C D E F G H Sumário do Procedimento 1. Pipetar 100µL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:101) nos poços. Incubar durante 30 minutos. Lavar. 2. Adicionar 100µL de conjugado em cada poço. Incubar durante 30 minutos. Lavar. 3. Adicionar 100µL de substrato em cada poço. Incubar durante 30 minutos. 4. Adicionar 100µL de solução de paragem em cada poço. Ler as absorvâncias a 450nm. QUANTA Lite é uma marca registrada da INOVA Diagnostics, Inc. Copyright 2012 Todos os Direitos Reservados 6

7 Referências 1. Hay FC et al.: Routine assay for the detection of immune complexes of known immunoglobulin class using solid phase C1q. Clin. Exp. Immunol., 1976; 24: Stanilova SA, Slavov ES: Comparative study of circulating immune complexes quantity detection by three assays - CIF-ELISA, C1q-ELISA and anti-c3 ELISA. J. Immunol. Meth, 2001; 253: Van Hoeyveld E, Bossuyt X: Evaluation of seven commercial ELISA kits compared with the C1q solidphase binding RIA for detection of circulating immune complexes. Clin. Chem, 2000; 46: Lambert PH: WHO collaborative study for the evaluation of immune complexes in serum. Clin Lab Immunol., 1978; 1: Espinoza LR and Osterland CK.: Circulating immune complexes. Their clinical significance. Future publishing Co., Abrass CK et al.: Correlation and Predictive Accuracy of Circulating Immune Complexes with Disease Activity in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum., 1980; 23: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT August 2012 Revision 3 7