NOVA Lite HEp-2 ANA Kits/Substrate Slides Para Diagnóstico In Vitro
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- Juan Peres Lameira
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1 NOVA Lite HEp-2 ANA Kits/Substrate Slides Para Diagnóstico In Vitro Código do Produto: , , , Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica NOVA Lite HEp-2 é um ensaio imunofluorescência indirecta para o rastreio e determinação semiquantitativa de anticorpos antinucleares (ANA) no soro humano. A presença de anticorpos antinucleares pode ser usada em conjunto com outros testes serológicos e descobertas clínicas para ajudar no diagnóstico de lúpus eritematoso sistémico (SLE) ou outras doenças dos tecidos conjuntivos ou reumáticas. Resumo e Explicação do teste O termo anticorpos antinucleares" descreve uma variedade de auto-anticorpos que reagem com constituintes do núcleo de células, incluindo DNA, RNA e várias proteínas e ribonucleoproteínas. 1 Estes auto-anticorpos ocorrem com elevada frequência em doentes com doenças do tecido conjuntivo ou reumáticas, especialmente lúpus eritematoso sistémico. Virtualmente todos os doentes de SLE são ANA positivos. Esta sensibilidade de diagnóstico conduziu à incorporação dos testes de ANA nos Critérios Revistos de 1982 para a Classificação de Lúpus Eritematoso Sistémico por uma subcomissão do Colégio Americano de Reumatologia. 2 Enquanto o teste ANA é um excelente teste de rastreio para o SLE (um resultado negativo virtualmente exclui o SLE activo 3 ) não é de modo algum um teste específico. Os doentes com outras doenças de tecido conjuntivo tais como artrite reumatóide, escleroderma e dermatomiosite são frequentemente positivos, e títulos de ANA baixos podem ser observados noutros estados de doença e na população normal. Podem ocorrer resultados de ANA positivos a seguir a queimaduras graves ou infecções virais e têm sido relatados em algumas pessoas normais, saudáveis, especialmente em populações mais idosas. Devido a esta falta de especificidade, recomenda-se que todas as amostras positivas de ANA sejam tituladas até um ponto final e que sejam efectuados testes mais específicos para auto-anticorpos anti DNA de cadeia dupla (dsdna) e auto-anticorpos anti antigénios nucleares extraíveis. A imunofluorescência indirecta é o método de referência para o teste de ANA. Os substratos comuns são secções finas de órgãos de roedores ou vários tipos de linhas celulares. É geralmente aceite que os substratos de linhas celulares são preferíveis a secções de órgãos, visto que estas células de divisão rápida possuem níveis mais elevados de certos antigénios clinicamente relevantes incluindo, centrómeros, SS- A(Ro), Scl-70 e PCNA/Ciclina. Além do tipo de substrato, outros três factores são críticos para o desempenho de um teste de ANA: 1) o fixador usado na preparação da lâmina, 2) a razão de fluoresceína para proteína (F/P) e 3) a especificidade de subclasse de imunoglobulina do conjugado. Alguns fixadores ou combinações destes são conhecidos por destruirem certos antigénios nucleares e o seu uso deverá ser evitado. A sensibilidade e a coloração de base não específica de um conjugado é determinada pela razão de F/P enquanto a especificidade para a doença de um conjugado é determinada pela reactividade da subclasse de imunoglobulina. Virtualmente todos os auto-anticorpos clinicamente significativos exibem a especificidade da subclasse IgG mesma na presença de IgM e IgA específicos de ANA. 4 Em contraste, os ANA encontrados em dadores de sangue saudáveis são geralmente apenas da subclasse IgM e IgA. 5 Como consequência disto, os conjugados específicos para IgG são mais específicos de doença. O substrato escolhido para o NOVA Lite HEp-2 ANA é uma linha celular epitelial humana (HEp-2) fixada optimamente e o conjugado é IgG anti-humano de afinidade purificada possuindo uma razão de F/P seleccionada cuidadosamente. Estes parâmetros dos reagentes permitem ao teste NOVA Lite HEp-2 ANA detectar clinicamente autoanticorpos relevantes (incluindo SS-A e Scl-70) que podem permanecer indetectados por alguns outros testes de ANA comercializados. Adicionalmente, a especificidade do conjugado IgG elimina resultados fisiológicos falsos positivos devido a ocorrerem normalmente auto-anticorpos IgM de baixo título, encontrados frequentemente em pessoas mais idosas mas saudáveis. Princípio do Procedimento Na técnica de imunofluorescência indirecta, as amostras são incubadas com o substrato antigénico e anticorpos não reactivos são retirados. O substrato é incubado com conjugado especifico marcado com fluoresceína e depois o reagente em excesso é retirado. Quando se observa através de um microscópio de fluorescência, as amostras positivas com auto-anticorpos, exibirão uma fluorescência verde maçã correspondendo às áreas da célula ou do núcleo onde se ligaram os auto-anticorpos. 1
2 Composição do dispositivo 1. Lâminas de substrato HEp-2; 12 poços/lâmina ou 6 poços/lâmina Apenas em kit: 2. Lâminas de substrato HEp-2 (célula epitelial humana); 12 poços/lâmina ou 6 poços/lâmina, com excicante 3. Conjugado IgG Anti-Humano (cabra), marcado com fluoresceína em tampão contendo Azul de Evans e 0,09% de azida de sódio, 15 ml 4. Controlo Padrão de Ponto Final de Titulagem ANA, 1 frasco de tampão contendo 0,09% de azida de sódio e anticorpos de soro humano para HEp-2, pré-diluído, 0,5 ml 5. Controlo Negativo IFA, 1 frasco de tampão contendo 0,09% de azida de sódio e sem anticorpos de soro humano para HEp-2, pré-diluído, 0,5 ml 6. PBS II concentrado (40x), suficiente para 2000 ml 7. Meio de Montagem, 0,09% de azida de sódio, 7 ml 8. Lamelas Advertências 1. Todo o material de origem humana usado na preparação de kit controlos para este produto foi testado e considerado negativo para anticorpos anti HIV, HBsAg, e HCV pelos métodos aprovados pela FDA. No entanto, nenhum teste pode garantir segurança total em relação à ausência de HIV, HBV, HCV ou de outros agentes infecciosos. Assim, o Controlo de Padrão de Ponto Final de Titulagem ANA e o Controlo Negativo IFA deverão ser manuseados como material potencialmente infeccioso A Azida de Sódio é usada como um conservante em alguns componentes do kit. A Azida de Sódio é um veneno e pode ser tóxica se for ingerida ou absorvida através da pele ou dos olhos. A azida de sódio pode reagir com chumbo ou com canalizações de chumbo para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Lave as bacias, se forem usadas para despejar reagentes, com grandes volumes de água para impedir a formação de azida. 3. Use equipamento de protecção pessoal apropriado enquanto trabalhar com os reagentes fornecidos. 4. Os reagentes derramados deverão ser limpos imediatamente. Cumpra todos os regulamentos ambientais federais, estatais e locais quando descartar detritos. Precauções 1. Este produto (kit) é para Uso de Diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo, por componentes diferentes dos fornecidos neste sistema pode conduzir a resultados inconsistentes. 3. A lavagem incompleta ou ineficiente dos poços IFA pode causar uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação deste ensaio para uso com processadores de amostras automatizados e outros dispositivos de manuseamento de líquidos, totalmente ou em parte, podem produzir diferenças nos resultados dos testes em relação aos obtidos com o procedimento manual. É da responsabilidade de cada laboratório validar os seus procedimentos automatizados 5. Uma diversidade de factores influencia o desempenho dos ensaios. Estes incluem a temperatura de início dos reagentes, a potência da lâmpada do microscópio usado, a exactidão e reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia de lavagem e a duração dos períodos de incubação durante o ensaio. É necessária uma atenção cuidadosa em relação à consistência para obter resultados exactos e reprodutíveis. 6. Com o tempo, o Conjugado IgG Anti-Humano pode alterar a cor devido à exposição à luz. No entanto, a alteração de cor não afecta o desempenho do ensaio. 7. É recomendado um cumprimento rigoroso dos protocolos. Condições de Armazenamento 1. Armazene todos os lâminas e reagentes a 2-8 C. Não congele. Os reagentes ficam estáveis até à data de validade quando são armazenados e manuseados conforme indicado. 2. O tampão PBS II diluído é estável durante 4 semanas a 2-8 C. Colheita de Amostras Este procedimento deverá ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras podem afectar negativamente os resultados. Amostras com contaminação microbiana, tratadas termicamente ou contendo partículas visíveis não deverão ser usadas. As amostras de soro com hemólise macroscópica ou altamente lipémica deverão ser evitadas. Após colheita, o soro deverá ser separado do coágulo. O Documento H18-A3 da CLSI (NCCLS) recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Armazene as amostras à temperatura ambiente durante um período não superior a 8 horas. 2) Se o ensaio não estiver concluido dentro de 8 horas, guarde a amostra a 2-8 C. 3) Se o ensaio não for efectuado em 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congele a -20 C ou a temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem misturadas após descongelação e antes do teste. 2
3 Procedimento Material fornecido (kits) Lâminas com Substrato HEp-2, 12- poços 1 15 ml de FITC Conjugado IgG Anti-Humano 1 0,5 ml de Controlo Padrão de Ponto Final de Titulagem ANA 1 0,5 ml de Controlo Negativo IFA 2 25 ml de PBS II Concentrado (40x) 1 7 ml de Meio de Montagem 1 20 Lamelas Lâminas com Substrato HEp-2, 12- poços ml de FITC Conjugado IgG Anti-Humano 10 0,5 ml de Controlo Padrão de Ponto Final de Titulagem ANA 10 0,5 ml de Controlo Negativo IFA ml de PBS II Concentrado (40x) 10 7 ml de Meio de Montagem Lamelas Lâminas com Substrato HEp-2, 12- poços 1 4 ml de FITC Conjugado IgG Anti-Humano 1 0,5 ml de Controlo Padrão de Ponto Final de Titulagem ANA 1 0,5 ml de Controlo Negativo IFA 1 25 ml de PBS II Concentrado (40x) 1 7 ml de Meio de Montagem 1 20 Lamelas Material fornecido (lâminas) x Hep-2 lâminas, 12- poços x Hep-2 lâminas, 12- poços x Hep-2 lâminas, 12- poços x Hep-2 lâminas, 12- poços Material Necessário Não Fornecido Micropipetas de L de volume Água destilada ou desionizada Frascos de pressão ou pipetas Pasteur Câmara húmida Recipiente de 1L (para diluir PBS II) Tinas Microscópio de fluorescência com filtro de 495 nm e filtro barreira de 515 nm Método Antes de começar 1. Todos os componentes devem encontrar-se á temperatura ambiente (20-26ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir o PBS II Concentrado : IMPORTANTE: Dilua o PBS II Concentrado 1:40 adicionando o conteúdo do frasco de PBS II Concentrado para 975 ml de água destilada ou desionizada e misture completamente. O tampão PBS II é usado para diluir as amostras dos doentes e como tampão de lavagem. O tampão diluidopode ser armazenado até 4 semanas a 2-8 C. 3. Diluir as Amostras : a. Rastreio Inicial: Dilua as amostras 1:40 com o tampão PBS II diluido (i.e., adicione 50 L de soro para 1,95 ml de Tampão PBS II). b. Titulação: Faça diluições em série, duplas, a partir da diluição de rastreio inicial para todas as amostras positivas com Tampão PBS II diluído (i.e. 1:80, 1:160,... 1:2560). Procedimento 1. Preparar as Lâminas: Deixe que a Lâmina atinja a temperatura ambiente antes de a remover da saqueta. Marque-a com um lápis e coloque-a numa câmara húmida adequada. Adicione uma gota (20-25 L) do controlo não diluído positivo e negativo aos poços 1 e 2 respectivamente. Adicione 1 gota (20-25 L) da amostra do doente diluída aos poços remanescentes. 2. Incubação da Lâmina: Incube a lâmina durante minutos numa câmara húmida (uma toalha de papel humedecida colocada numa base plana de um recipiente de plástico ou de vidro fechado manterá as condições de humidade adequadas). Não deixe secar o substrato durante o procedimento. 3
4 3. Lavagem de Lâminas: Após a incubação, use um frasco de pressão de plástico ou uma pipeta para lavar suavemente o soro com o tampão PBS II diluído. Oriente a lâmina e o fluxo do tampão PBS II de modo a minimizar o transbordo das amostras entre os poços. Evite direccionar o fluxo directamente para os poços para impedir danos nos substratos. Coloque as lâminas na tina de lavagem com PBS II diluído durante mais 5 minutos. Se desejado, coloque as lâminas em um frasco de Coplin do amortecedor diluído de PBS II por até 5 minutos. 4. Adição de Conjugado Fluorescente: Deite fora o excedente do tampão PBS II. Coloque novamente a lâmina na câmara húmida e cubra imediatamente cada poço com uma gota de conjugado fluorescente. Incube as lâminas durante mais minutos. 5. Lavagem de Lâminas: Repita o Passo Lamela: O procedimento para colocar a lamela varia de laboratório para laboratório; no entanto, são recomendados os seguintes procedimentos: a. Coloque uma lamela numa toalha de papel. b. Aplique meio de montagem numa linha contínua na extremidade da lamela. c. Deite fora o excesso de tampão PBS II e toque com a extremidade inferior da lâmina na extremidade da lamela. Baixe a lâmina suavemente no sentido da lamela de tal modo que o meio de montagem flua para a extremidade superior da lâmina sem a formação de bolhas de ar ou artefactos. Controlo de Qualidade O Controlo Padrão de Ponto Final de Titulagem ANA e o Controlo Negativo IFA deverão ser colocados em todas as lâminas para assegurar que todos os reagentes e procedimentos foram efectuados correctamente. Outros controlos adequados podem ser preparados alíquotando amostras de soro humano e armazenando a < -70 C. De forma a que os resultados dos testes sejam considerados válidos, todos os critérios defenidos devem ser satisfeitos. Se algum destes critérios não for satisfeito, os resultados do teste deverão ser considerados inválidos e o ensaio deverá ser repetido. 1. O Controlo Padrão de Ponto Final de Titulagem ANA não diluído deve ser > O Controlo Negativo IFA deve ser negativo. Interpretação dos Resultados Reacção Negativa. Uma amostra é considerada negativa se a fluorescência nuclear específica for igual ou inferior ao Controlo Negativo IFA. As amostras podem exibir vários graus de fluorescência de fundo devido a anticorpos heterófilos ou auto-anticorpos de baixo nível de fluorescência para constituintes citoplasmáticos tais como proteínas contrácteis. Reacção Positiva. Uma amostra é considerada positiva se a fluorescência nuclear específica for superior ao Controlo Negativo IFA. Determine o grau ou intensidade de fluorescência usando estes critérios: 4+ Fluorescência verde maçã brilhante 3+ Fluorescência verde maçã clara 2+ Fluorescência positiva claramente distinguível 1+ Fluorescência específica mais baixa que permite que a fluorescência nuclear ou citoplasmática seja claramente diferenciada da fluorescência de fundo. Interpretação do Padrão. Uma diversidade de padrões de fluorescência nuclear e citoplasmática podem ser exibidos dependendo dos tipos e das quantidades relativas de auto-anticorpos presentes na amostra. Podem ser observados os seguintes tipos de padrões de fluorescência: Homogéneo: Uma fluorescência sólida do núcleo com ou sem ocultação aparente dos nucléolos. Antigénios nucleares presentes: dsdna, ssdna, histonas Associação de doença: Os títulos elevados são sugestivos de SLE; os títulos mais baixos são sugestivos de SLE ou de outras doenças do tecido conjuntivo. Periférico: Uma fluorescência sólida, inicialmente em volta da região exterior do núcleo, com fluorescência mais fraca na direcção do centro do núcleo. Antigénios nucleares presentes: dsdna, ssdna, RNP, histonas Associação de doença: Os títulos elevados são sugestivos de SLE; os títulos mais baixos são sugestivos de SLE ou de outras doenças do tecido conjuntivo. Mosqueado: Uma fluorescência de aspecto fino ou granulado do núcleo, geralmente sem coloração fluorescente dos nucléolos. Antigénios nucleares presentes: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B, e outros sistemas antigénio/anticorpo ainda não caracterizados. Associação de doença: Títulos elevados sugestivos de SLE (anticorpo Sm), doença mista do tecido conjuntivo (anticorpo RNP), escleroderme (anticorpo Scl-70), ou complexo de síndroma-sicca de Sjogren (anticorpo SS-B); títulos mais baixos podem ser sugestivos de outras doenças do tecido conjuntivo. Nucleolar: Fluorescência granulada grosseira dentro do núcleo, geralmente em número inferior a 6 por célula, com ou sem granulados finos ocasionais. Antigénios nucleares presentes: 4-6S RNA e outros antigénios nucleares desconhecidos. Associação de doença: Os títulos elevados são prevalentes na escleroderme e no síndroma de Sjogren. Centrómero: Um padrão de fluorescência discreto, granulado. Os grânulos nucleares são muito discretos e normalmente em número múltiplo de 46. Antigénios nucleares presentes: Centrómero cromossómico (cinetócoro). 4
5 Associação de doença: Altamente sugestiva do síndroma de CREST, uma variante de esclerose sistémica progressiva (PSS). O CREST é uma forma de PSS com calcinose proeminente, bem como o fenómeno de Raynaud, dismotilidade esofágica e envolvimento limitado da pele (frequentemente circunscrito aos dedos ou à face), telanglectásia. Mitocondrial: Um granulado discreto do citoplasma com limitação relativa da área nuclear. Antigénios presentes: Vários tipos de antigénios mitocondriais. Associação de doença: Títulos elevados indicam cirrose biliar primária. É importante prevenir o utilizador para ter cuidado sobre a confiança a ter nos padrões, para determinar a especificidade de auto-anticorpos, excepto para os padrões nucleolares e centrómeros nos quais cada um dos antigénios está muito bem definido e os seus padrões são característicos. Uma vez que muitos autoanticorpos ou combinações deles podem induzir um padrão homogéneo ou granulado, recomenda-se que sejam efectuados testes específicos, de seguimento de auto-anticorpos (tais como dsdna e ENA) em todas as amostras granuladas ou homogéneas. Limitações do Procedimento 1. Um título elevado de ANA é sugestivo de doença do tecido conjuntivo mas não deverá ser considerado um diagnóstico. O resultado de ANA deverá ser considerado em conjunto com outros resultados serológicos bem como toda a história clínica do doente. 2. Os padrões de ANA mudam frequentemente à medida que a amostra é titulada até ao ponto final. Este fenómeno é devido à descida dos anticorpos de título inferior, abaixo da sensibilidade do sistema, à medida que é testada a amostra mais diluída. 3. Uma diversidade de factores externos influenciam a sensibilidade do teste incluindo o tipo de microscópio de fluorescência usado, a potência e a idade da lâmpada, a ampliação usada, o sistema de filtro e o observador. 4. Se for usado um filtro diferente do filtro de barreira 515, pode ser observado uma fluorescência artificial aumentada. 5. Deve apenas ser usado um lápis para etiquetar as lâminas. A utilização de qualquer outro material de escrita pode provocar fluorescência artificial. 6. Todas as tinas usadas para lavagem de lâminas deverão estar isentas de todos os resíduos de corantes. O uso de tinas contendo resíduos de corantes pode provocar fluorescência artificial. 7. Os resultados deste ensaio deverão ser usados em conjunto com descobertas clínicas e outros testes serológicos. 8. As características do ensaio não foram estabelecidas para matrizes diferentes do soro. As lâminas vendidas em separado têm a classificação de Reagentes específicos de analitos. Excepto como componente do kit NOVA Lite HEp-2 ANA, as características analíticas e de desempenho não foram estabelecidas. Valores Esperados Utilizando o teste NOVA Lite HEp-2 ANA, foram testados diversos doentes com doenças do tecido conjuntivo, bem como 200 dadores de sangue aleatórios. Os resultados obtidos foram os seguintes: Grupo Número Número de Positivos NOVA Lite HEp-2 ANA SLE Lúpus Induzido por Medicamento Artrite Reumatóide Escleroderme Dermatomiosite Síndroma de Sjogren Normais
6 Referências 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: , Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009 Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT December 2012 Revision 21 NOVA Lite, e INOVA Diagnostics, Inc., são marcas registradas. Copyright 2012 Todos os Direitos Reservados 6
Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados.
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