5. Esta observação confirma a necessidade de

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1 QUANTA Lite Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada dsdna SC ELISA Aplicação Diagnóstica Este kit destina-se à deteminação in vitro de autoanticorpos IgG anti-cadeia dupla de DNA (dsdna) presente no soro humano, com o objectivo de diagnosticar o Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE), em conjunto com outros dados clínicos. São fornecidos reagentes suficientes para testar até 40 amostras em duplicado ou 88 amostras simples, com a curva de calibração e os controlos positivo, negativo e controlo de cadeias simples de DNA. Resumo e Explicação do teste Os autoanticorpos anti-dna reconhecem as cadeias simples (ss) e as cadeias duplas (ds) dos ácidos nucleícos. Os autoanticorpos anti-ssdna não são especifícos estão associados a um conjunto de doenças autoimunes incluindo: Lúpus Eritematoso Sistémico induzido por drogas, doença do Tecido Conjuntivo Misto, Artrite Reumatóide, Escleroderma e Síndroma de Sjögren. Em contraste, os autoanticorpos anti-dsdna estão associados de um modo mais especifico com o SLE 1,2,3, no qual a formação de um imunocomplexo penbsa-se ter um papel mais relevante na patogénese da doença. A deposição dos imunocomplexos leva à inflamação e às características renais e vasculares próprias da doença 4. Aumentos inesperados de actividade da doença SLE são normalmente precedidos por um aumento nos níveis de anti-dsdna, seguido de um decréscimo abrupto durante a doença 5. Esta observação confirma a necessidade de monotorização frequente dos níves dos autoanticorpos em doentes com SLE. Princípio do método Os poços da microplaca estão revestidos com antigénio dsdna do timo de vitelo. Os calibradores, controlos e amostras diluídas dos doentes são pipetados nos poços, os autoanticorpos que reconhecem o antigénio dsdna ligam-se a eles durante a primeira incubação. Após a lavagem dos poços, para a remoção das proteínas que não se ligaram, é adicionado o conjugado IgG de cabra anti-humano, marcado com um peroxidase purificado. O conjugado liga-se ao anticorpo humano capturado e o excesso de conjugado é removido através de lavagem. Após a adição do substrato 3,3,5,5 Tetrametilbenzidina (TMB) forma-se um produto de cor azul, cuja intensidade é proporcional à concentração de anticorpo na amostra. É adicionado ácido sulfúrico a cada poço produzindo uma cor amarela que indica o final da reacção. A leitura é realizada a um comprimento de onda de 450nm. Reagentes 1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno revestida com antigénio de timo de novilho dsadn (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos dsadn, pré-diluído, 1,2 ml 3. Calibrador A dsadn SC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com 4. Calibrador B dsadn SC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com 5. Calibrador C dsadn SC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com 6. Calibrador D dsadn SC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com 7. Calibrador E dsadn SC ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com 8. Controlo Positivo dsadn SC, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti dsadn pré-diluído, 1,2 ml 9. Diluente da amostra Type III, 2 frascos cor-de-amarelo, contém, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 10. Solução de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 11. Controlo monocatenário dsadn SC, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos anti ssadn pré-diluído, 1,2 ml 12. Conjugado HRP dsand SC IgG, 1 frasco de cor azul com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 13. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 14. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) nos controlos, diluente e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. O l diluente com Proclin 150. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 2. Todo o material de origem humana, utilizado na preparação dos controlos para este produto foi testado e deu resultados negativos para testes aprovados pela FDA em relação a anticorpos anti HBsAg, HIV e HCV. Contudo nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência destes anticorpos ou outros agentes infecciosos. Assim os controlos e calibradores dsand SC, controlo monocatenário devem ser manipulados como material potencialmente infectante. 8 1

2 3. A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. Este produto deverá ser usado somente por pessoal qualificado. 3. Deve seguir-se as instruções com rigor. Qualquer alteração pode ter efeito na prestação do teste, e nos resultados obtidos. Tomar atenção a Notas específicas e avisos ao longo das instruções de uso. 4. Utilizar sempre os reagentes do mesmo lote. Caso se realize um número elevado de testes dever-se-á verifcar se todos os reagentes pertencem ao MESMO lote. As tiras devem ser provenientes do mesmo invólucro. A substituição de qualquer componente do kit pode induzir a resultados incorrectos. 5. Para evitar quaisquer contaminações dos reagentes utilizar pontas descartáveis de plástico/vidro. Nunca repor nos frascos originais reagentes não utilizados 6. Diluir o tampão de lavagem num frasco limpo. Caso o tampão apresente evidências de contaminação ou com uma aparência opaca, preparar uma nova solução. 7. Não deixar os recipientes dos reagentes destapados, qualquer evaporação ou contaminação pode levar a resultados inconsistentes. 8. O substrato TMB não dever ser exposto ao contacto com a luz ou água. 9. Não devem ser utilizados soros contaminados, hemolisados ou lipémicos e amostras que contenham partículas em suspensão. 10. Recomenda-se a utilização de pipetas calibradas e de soro de Controlo de Qualidade interno (CQ). 11. A utilização de sistemas automáticos para o teste, diluição das amostras e outros aparelhos automáticos pode conduzir a diferenças nos resultados quando comparados com o procedimento manual. É da responsabilidade de qualquer laboratório a validação do sistema com o qual está a trabalhar, e assegurar que os resultados se encontram dentro dos limites definidos pelas instruções de uso e pelo certificado de CQ associado. 12. Todo o equipamento utilizado deve ser calibrado e conservado de acordo com as instruções do fabricante. Precauções particulares de conservação 1. O kit deve ser conservado entre 2-8ºC e NÃO deve ser congelado. A conservação a temperaturas impróprias irão afectar os resultados. 2. O tampão de lavagem diluído pode ser conservado a 2-8ºC até 1 semana. 3. A data de validade do kit está mencionada no rótulo exterior. Colheita da amostra 1. As amostras de sangue devem ser colhidas por punção venosa de modo a permitir a formação do coágulo naturalmente e a separação do soro. 2. O soro pode ser conservado de 2-8ºC até 7 dias antes do teste 6, ou em aliquotas a -20ºC ou menos, para períodos mais prolongados. 3. Devem evitar-se descongelamentos e congelamentos sucessivos. 4. As amostras de soro não devem ser inactivadas pelo calor, pois poder-se-á obter resultados falsos positivos. Procedimento Material fornecido Instruções de uso: Fornece instruções detalhadas do teste. Certificado CQ: Indica a performance esperada para o lote. Microplaca revestida com dsadn SC: 12 tiras fraccionáveis constituídas por 8 poços cada evestidos com antigénio de ADN bovino. Cada microplaca é embalada num invólucro hermeticamente fechado e contém dois pacotes de exsicante. Controlo negativo ELISA: 1 frasco. Contém 1,2mL de soro humano diluído. Os valores esperados encontramse no certificado do CQ. Pronto a usar. Calibradores dsadn SC: 5 frascos, com 1,2mL de soro humano diluído, com as seguintes concentrações de autoanticorpos anti-dsadn: 1000; 333; 111; 37; 12,3 UI/mL. Prontos a usar. Controlo positivo dsadn SC: 1 frasco. Contém 1,2mL de soro humano diluído. Os valores esperados encontram-se no certificado do CQ. Pronto a usar. Diluente da amostra, Type III: 2 frascos. Contém 50mL de tampão para a diluição da amostra. Com coloração de-amarelo e pronto a usar. Solução de lavagem HRP (40x): 1 frasco. Contém 25mL de tampão de lavagem concentrado 40 vezes, para lavagem dos poços das placas. 2

3 Controlo monocatenário dsadn SC: 1 frasco. Contém 1,2mL de soro humano diluído. Os valores esperados encontram-se no certificado do CQ. Pronto a usar. Conjugado HRP dsadn SC IgG: 1 frasco. Contém 10mL de anticorpo anti-igg humana marcado com peroxidase, de coloração azul. Pronto a usar. TMB Cromogénio: 1 frasco. Contém. 10mL de cromogénio TMB. Pronto a usar. Solução de paragem HRP: 1 frasco. Contém 10mL de ácido sulfúrico a 0,344M. Pronto a usar. Material adicional necessário mas não fornecido Lavador automático de microplacas: É o mais recomendado, no entanto a lavagem pode ser efectuada manualmente. Leitor de microplacas: Para efectuar leituras de densidade óptica a 450nm contra o ar. Água destilada ou desionisada: A água deve ser de elevada qualidade. Micropipetas calibradas: Para a pipetagem de 1000, 100 e 10µL. Pipeta multicanal: Recomendado para a pipetagem de volumes de 100µL do conjugado, substrato e solução de paragem. Pontas de plástico/vidro: Para a diluição das amostras. Método Antes de iniciar 1. Conduzir o kit à temperatura ambiente O kit foi desenvolvido para a realização dos testes à temperatura ambiente (20-24 C). Retirar o kit do frigorifico e deixa-lo à temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. As microplacas não devem ser retiradas do invólucro antes deste se encontrar à temperatura ambiente. Nota: Este kit pode ser conservado à temperatura ambiente até uma semana. 2. Componentes do kit Agitar suavemente todos os componentes do kit, antes de usar. 3. Diluição do tampão de lavagem Diluir a Solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco de Solução de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantém-se estável durante uma semana a 2-8º C. 4. Diluição da amostra Diluir 10µL de cada amostra com 1000µL de diluente da amostra (1:101) e misturar bem. Nota: Após a sua diluição a amostra deve ser utilizada nas 8 horas seguintes. 5. Manuseamento das tiras e do moldura das tiras Colocar o número de tiras necessárias na moldura da microplaca e fixá-las pelas extremidades, posicionar-se no poço A1 e preencher as colunas da microplaca da esquerda para a direita. Nota: Repor, de imediato, as tiras não utilizadas, no invólucro com os dois sacos de exsicante e fecha-los novamente de modo a minimizar a exposição ao ar. Cuidado para não perfurar ou rasgar o invólucro. AVISO: A exposição das tiras à humidade ou a contaminação pelo ar ou por outras partículas pode resultar na deterioração do antigénio, conduzindo à perda de precisão do teste bem como a resultados falsos. Técnica 1. Amostra Pipetar 100µL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:101) nos poços da microplaca. Nota: As amostras devem ser pipetadas de imediato para a placa com o objectivo de minimizar as alterações aos resultados do teste, o tempo começa a contar após a pipetagem da ultima amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. 2. Lavagem Os passos de lavagem são passos críticos e requerem uma atenção especial. A lavagem dos poços quando realizada de modo inadequado, pode conduzir a resultados pouco precisos e a um elevado background. Após a incubação lavar a microplaca 3 vezes com µL tampão de lavagem, por poço. A microplaca deve ser lavada com um lavador automático de microplacas ou manualmente de acordo com as indicações abaixo. Após a lavagem de modo automático, inverter a microplaca sobre papel absorvente, batendo suavemente, de modo a secar os poços completamente. Lavagem manual das microplacas: a. Deitar fora o conteúdo dos poços. b. Bater suavemente com a microplaca invertida sobre papel absorvente. c. Encher cada poço com µL de tampão de lavagem utilizando uma pipeta multicanal. d. Agitar suavemente a microplaca numa superfície plana. e. Repetir os passos de a-d duas vezes. f. Repetir a e b. 3. Adição do conjugado Pipetar 100µL de conjugado em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modo a remover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso de conjugado no frasco correspondente. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. 4. Lavagem Repetir o descrito no passo Adição do substrato (TMB) Pipetar 100µL de substrato (TMB) em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modo a remover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso de substrato (TMB) no frasco correspondente. Incubar, no escuro, à temperatura ambiente durante 30 minutos. 3

4 6. Paragem da reacção Pipetar 100µL de solução de paragem em cada poço. Dá-se uma mudança de cor de azul para amarelo. 7. Leitura da densidade óptica Ler a densidade óptica (DO) de cada poço a 450nm, num leitor de microplacas até 30 minutos após a adição da solução de paragem. Controlo de qualidade 1. Controlo de qualidade Para que o teste seja válido, tem que obedecer aos seguintes critérios: Os controlos e calibradores devem estar incluídos em cada série. Os valores obtidos para os controlos devem encontrar-se dentro do intervalo especificado pelo Certificado de CQ. A curva obtida deve ser similar à curva de calibração evidenciada no Certificado CQ. Caso os critérios acima referidos não sejam respeitados o teste é considerado inválido e o teste deve ser repetido. 2. Cálculo da media das densidades ópticas (somente para os testes realizados em duplicado) Para cada calibrador, controlo ou amostra calcular a média da DO das leituras em duplicado. A percentagem do coeficiente de variação (%C.V.) para cada DO em duplicado deverá ser inferior a 15%. 3. Curva de calibração A curva de calibração pode ser traçada automaticamente ou manualmente, colocando o valor das concentrações dos anticorpos anti-dsdna na escala logarítmica e as DO correspondentes a cada calibrador, na escala linear. Automaticamente utilizar um software adequado. Manual utilizar um papel log/linear, traçar a melhor curva através dos pontos obtidos, (não traçar uma linha recta nem "ponto a ponto"). 4. Pontos anómalos Caso algum ponto se encontre for a da curva, pode ser desprezado. Caso exista mais que um ponto fora da curva o ensaio deve ser repetido. 5. Cálculo dos níveis de anticorpos nas amostras pré-diluídas e controlos Determinar o nível dos autoanticorpos IgG anti-dsdna das amostras pré-diluídas e dos controlos directamente a partir da curva de calibração. Nota: Os valores dos calibradores foram ajustados através de um factor de 100 correspondente ao factor de diluição da amostra (1:101). Não é necessário fazer qualquer outra correcção. 6. Calibração do teste O teste foi calibrado contra o calibrador de referência OMS, Wo80 (UI/mL) 7. Limitações do método 1. Este kit é utilizado somente para diagnóstico. Um resultado positivo deve ser confirmado através de outros dados clínicos e outros testes serológicos. 2. Os resultados obtidos com este teste não são uma evidência clínica da doença. 3. Os resultados limite devem ser repetidos com amostras recentes. 4. É importante testar regularmente os doentes de modo a monotorizar as variações do nível de autoanticorpos dsdna. Valores esperados Os valores de refrência foram determinados no soro de 113 doadores saudáveis (secção 10.2). O limite superior do intervalo é expresso como a concentração média +5DP e é igual a 30 UI/mL, com uma média de 9,2 e DP de 4,4 UI/mL. Estes valores são somente fornecidos como referência. Os ensaois de ELISA são muito sensíveis e capazes de detectar pequenas diferenças na amostragem. Recomenda-se que cada laboratório determine os seus valores de referência. INTERPRETAÇÃO < 30 UI/mL Valores negativos UI/mL Valores duvidos > 75 UI/mL Valores positivos Precisão A precisão intra- e inter-ensaio foi determinada usando três amostras cujos valores se encontram no intervalo da curva de calibração. Os valores obtidos para a média e a %C.V. para cada amostra são apresentados na tabela seguinte. PRECISÃO INTRA-ENSAIO n=16 Concentração (UI/L) % C.V. Amostra ,0 Amostra ,7 Amostra ,1 PRECISÃO INTER-ENSAIO n=3 Concentração (UI/L) % C.V. Amostra ,2 Amostra ,5 Amostra ,6 4

5 Valores de Referência Foram determinmados os níveis de autoanticorpos Anti-dsDNA em 113 amostras de soro de doadores saudáveis, os resultados estão representados no gráfico abaixo. Baseados num cut-off de 30 UI/mL nenhuma das amostras foi considerada positiva ou no intervalo entre a positividade e a negatividade. Numero de amostras < >25 Anti-dsDNA UI/mL Especificidade, Sensibilidade e Concordãncia A especificidade, sensibilidade e concordâncua foram determinadas com base num kit alternativo de EIA de antidsdna e imunofluorescência em Crithidia luciliae, utilizando 69 amostras. Na comparação com Crithidia luciliae, as amostras que apresentam resultados duvidosos no teste de ELISA são considerados positivos. EIA EIA Alternativo + Valor limite - BINDAZYME AntidsDNA Valor limite EIA Sesibilidade relativa 97,8% Especificidade relativa 95,7% Concordância relativa 97,1% Crithidia luciliae Crithidia luciliae + - BINDAZYME Anti-dsDNA EIA Sesibilidade relativa 95,7% Especificidade relativa 91,3% Concordância relativa 94,2% Sensibilidade A sensibilidade foi determinada calculando a concentração média + 2 DP de 20 determinações do diluente da amostra. O valor obtido é igual a 4,6 UI/mL. Substâncias Interferentes Foram testados vários tipos de soro de modo a verificar o possível efeito de substâncias interferentes. Utilizou-se para o efeito um kit de verificação de substâncias interferentes, Interference Check A plus (Kokusai, Japão). Substância Bilirubina F (livre) Bilirubina C (conjugada) Hemoglobina hemolisada Quilo Factor rematóide Concentração 18,3mg/dL 19,0mg/dL 490mg/dL 1930 unidades 50 UI/mL Não se vericou quais quer interferencias com bilirrubina conjugada ou livre, hemoglobina, lípidos ou factor reumatóide. Intervalo de Leitura O intervalo de leitura é 12, UI/mL. 5

6 Sumário do Procedimento 1. Pipetar 100µL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:101) nos poços. Incubar durante 30 minutos. Lavar. 2. Adicionar 100µL de conjugado em cada poço. Incubar durante 30 minutos. Lavar. 3. Adicionar 100µL de substrato em cada poço. Incubar durante 30 minutos. 4. Adicionar 100µL de solução de paragem em cada poço. Ler as absorvâncias a 450nm. Esquema da Microplaca A B C D E F G H 6

7 Referências 1. Stollar B D. Antibodies to DNA. CRC Critical Review of Biochemistry, 1986; 20: Stollar B D. The specificity and applications of antibodies to helical nucleic acids. CRC Critical Review of Biochemistry, 1975; 3: Swaak AJ et al. Anti-dsDNA and complement profiles as prognostic guides in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatism, 1979; 22: Koffler D et al. Systemic lupus erythematosis: Prototype of immune complex nephritis in man. J Exp Med, 1971; 134 (suppl): ter Borg EJ et al. Measurement of increases in anti-double stranded DNA antibody levels as a predictor of disease exacerbation on systemic lupus erythematosus, a long term, prospective study. Arthritis Rheumatism, 1990; 33: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Feltkamp T E W. et al. The First International Standard for Antibodies to Double Stranded DNA. Annals of Rheumatic diseases, 1988; 47: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. QUANTA Lite y INOVA Diagnostics son marcas comerciales registradas de Derecho de Autor 2011 Todos los derechos reservados Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT July 2012 Revision 3 7