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1 LER ALTERAÇÕES DESTACADAS bioelisa HBsAg tests tests Teste de ELISA para a detecção do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) em soro ou plasma humano para ser utilizado em laboratórios clínicos e como teste de triagem em bancos de sangue. Sumário A hepatite B é uma doença causada por uma infecção viral. Durante o período de infecção aparecem vários marcadores sorológicos, entre os quais está o HBsAg. Em 1964, Blumberg e col. 1, detectaram pela primeira vez, no soro de um aborígine australiano, um antígeno que reagia com um anticorpo do soro de um paciente hemofílico de Nova York. Posteriormente este antígeno foi identificado como antígeno de superfície do vírus da hepatite B. O descobrimento do HBsAg significou um grande passo para o conhecimento e diferenciação das hepatites virais. A presença de HBsAg no soro ou plasma, constitui o marcador mais importante para o diagnóstico de uma infecção pelo vírus da hepatite B (HBV). Em 1971, Engvall e Perlmann 2 e Van Weemen e Schuurs 3, descreveram pela primeira vez os ensaios imunoenzimáticos. O desenvolvimento posterior da técnica e a utilização de microplacas por Voller e col. 4,5, permitiram confeccionar kits de diagnóstico de alta precisão e sensibilidade. Princípio bioelisa HBsAg 3.0 é um método imunoenzimático direto, de tipo sanduíche, no qual os pocinhos de uma microplaca foram recobertos com anticorpos de cobaia anti-hbs para atuar como captura e que utiliza anticorpos de cabra anti-hbs marcados com peroxidase como conjugado. A amostra a ser analisada é incubada em um dos pocinhos da microplaca. Se a amostra tiver HBsAg, este se fixará ao anticorpo anti-hbs unido à placa. Após lavagem para extrair o material não fixado, se coloca o anticorpo de cabra anti-hbs conjugado com peroxidase, que reagirá com um possível complexo antígeno-anticorpo formado na primeira incubação. Após a segunda incubação e posterior lavagem, se procede à adição do substrato enzimático que contém um cromógeno, o que dará como resultado a aparição de cor azul se a amostra for positiva para HBsAg. A cor azul passará a amarelo depois do bloqueio da reação com ácido sulfúrico. A intensidade da cor é proporcional à concentração de HBsAg na amostra. Componentes 1. MCPL MICROPLACA: 12 x 8 pocinhos recobertos com anticorpos anti-hbs de cobaia. Pocinhos separáveis individualmente. 2. CONJ 51x CONJUGADO CONCENTRADO: Anticorpo de cabra anti-hbs conjugado com peroxidase. Contém corante vermelho, proteínas estabilizantes, Bronidox a 0,02% e sulfato de gentamicina a 0.001%. Diluir 1/51 com o diluente do conjugado antes de usar. 3. DIL CONJ DILUENTE DO CONJUGADO: Tampão Tris que contém corante amarelo, aditivos, Bronidox a 0,02% e sulfato de gentamicina a 0,001%. Usado para diluir o conjugado concentrado. 4. WASH SOLN 10x SOLUÇÃO DE LAVAGEM CONCENTRADA: Tampão fosfato concentrado (10x) que contém Tween 20 a 1% e mertiolato de sódio a 0,01%. Diluir 1/10 com água destilada ou deionizada antes de usar. 5. SUBS BUF TAMPÃO SUBSTRATO: Tampão citrato-acetato que contém peróxido de hidrogênio. 6. SOLN TMB CROMÓGENO: 3,3, 5,5 - Tetrametilbenzidina (TMB) dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO). Contém corante vermelho. 7. CONTROL + CONTROLE POSITIVO: Soro humano normal diluído em tampão fosfato que contém HBsAg purificado e inativado e azida sódica a 0,02%. Contém corante verde. Pronto para usar. 8. CONTROL CONTROLE NEGATIVO: Soro humano negativo para HBsAg diluído em tampão fosfato que contém azida sódica a 0,02%. Contém corante amarelo. Pronto para usar.

2 9. H 2 SO 4 1N SOLUÇÃO DE BLOQUEIO (somente no kit de 1 placa): Ácido sulfúrico 1N. Pronto para usar. 10. SEALS FOLHAS ADESIVAS: Para cobrir a microplaca durante as incubações. 11. BAG BOLSA DE PLÁSTICO: Para guardar as tiras não utilizadas. Precauções bioelisa HBsAg 3.0 é para o diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivamente por profissionais. ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO. Todos os materiais de origem humana utilizados na preparação deste produto foram testados e apresentaram resultados negativos em relação à presença de anticorpos contra os vírus HIV-1/HIV-2 e HCV, assim como para o antígeno de superfície da hepatite B, utilizando um método comercial autorizado, exceto quando necessariamente positivos. O HBsAg contido no controle positivo foi inativado a 60 C durante 10 horas. No entanto, dado que nenhum método pode oferecer a total segurança da ausência de agentes infecciosos, este produto deve ser manipulado com precaução: - Não permitir que os reagentes entrem em contato com a pele e os olhos. Se isto ocorrer, lavá-los com abundante quantidade de água. - Usar luvas. - Não pipetar nenhum reativo com a boca. - Não fumar. - Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. Os restos de amostras, controles, reativos aspirados e ponteiras descartáveis, devem ser recolhidos em um recipiente destinado a este fim, que deverá ser autoclavado a 121 C, ou tratar-se com hipoclorito de sódio a uma concentração de 10%, durante 30 minutos. (Os restos que contém ácido devem ser neutralizados antes de adicionar hipoclorito de sódio). - Alguns reativos deste kit contêm azida sódica. A azida sódica pode reagir com os encanamentos e ralos de chumbo ou cobre, originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao descartar os restos de reativos, fazê-lo em abundante volume de água. Cuidados de manipulação: - Ajustar o lavador ao tipo de placa utilizada (fundo plano), para conseguir uma boa lavagem. - Não utilizar reativos procedentes de lotes diferentes. - Não utilizar os reativos após sua data de validade. - Não use o reagente se se observar qualquer alteração na aparência dos componentes incluídos no kit. - Tomar as devidas precauções para evitar contaminação microbiana e contaminação cruzada entre reativos. - Utilizar ponteiras descartáveis para pipetar as amostras e os reativos. - É muito importante preparar a solução de substrato-tmb 5 a 10 minutos antes de ser utilizada. Mantê-la em um recipiente bem vedado e ao abrigo da luz direta. - Restos de sabões e detergentes, ou agentes oxidantes nos recipientes utilizados para a preparação da solução de substrato-tmb, podem interferir na reação. Por essa razão, caso se utilizem recipientes de vidro é recomendável que sejam lavados com ácido sulfúrico ou clorídrico 1N, enxaguados abundantemente com água destilada ou deionizada e secos antes de utilizar. Usar de preferência material plástico descartável. Conservação e estabilidade Os componentes permanecem estáveis até a data de validade indicada nos rótulos se forem conservados entre 2 e 8 C. A bolsa que contém a microplaca deve estar a temperatura ambiente antes de abri-la, para evitar a condensação nos pocinhos. Uma vez aberta a bolsa, as tiras são estáveis por 3 meses guardadas a 2-8 C na bolsa de plástico bem fechada, com a bolsinha de silicagel. A solução de lavagem, uma vez diluída, é estável durante 2 semanas, se conservada entre 2 e 8 C. O conjugado, uma vez diluído se mantém estável por 7 dias se conservado entre 2 e 8 C. Guardar o cromógeno ao abrigo da luz. A solução substrato-tmb uma vez preparada não é estável, por isso, devem-se seguir estritamente as indicações para sua utilização.

3 Apresentações disponíveis - Kit de 1 placa (96 testes), REF Contém: 1 placa; 1 x 0,4 ml conjugado concentrado; 1 x 16 ml diluente do conjugado; 2 x 50 ml solução de lavagem concentrada; 1 x 14 ml tampão substrato; 1 x 1,5 ml cromógeno; 1 x 1,7 ml controle positivo, 1 x 5 ml controle negativo, 1 x 12 ml solução de bloqueio, 1 bolsa de plástico e folhas adesivas. - Kit de 5 placas (5 x 96 testes), REF Contém: 5 placas; 1 x 1,3 ml conjugado concentrado; 2 x 30 ml diluente do conjugado; 3 x 100 ml solução de lavagem concentrada; 5 x 14 ml tampão substrato; 1 x 1,5 ml cromógeno; 1 x 1,7 ml controle positivo; 1 x 5 ml controle negativo, 1 bolsa de plástico e folhas adesivas. Material necessário não incluído - Água destilada ou deionizada. - Pipeta multicanal e micropipetas (100 µl) e ponteiras descartáveis. - Incubador (seco ou com umidade) a 37 C 1 C. - Cronômetro. - Leitor de microplacas com filtro de 450 nm. Recomendável filtro de referência de 620 ou 630 nm. - Sistema de lavagem manual ou automático. - Solução de bloqueio (kit de 5 placas): ácido sulfúrico 1N. Também pode-se empregar ácido sulfúrico 2N ou 4N. Coleta da amostra Usar soro fresco ou plasma (citrato/edta). Outros anticoagulantes devem ser avaliados antes de serem utilizados. As amostras podem ser conservadas por 3 dias entre 2-8 C. Para guardar por um período de tempo mais longo as amostras devem ser congeladas (-20 C). Evitar congelar e descongelar as amostras repetidamente. Partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. As amostras não devem ser inativadas pelo calor, pois podem produzir-se resultados incorretos. Processamento automático Esta prova pode ser utilizada de modo automático ou semi-automático com diferentes instrumentos. É muito importante validar qualquer sistema automático para demonstrar que os resultados obtidos para as amostras são equivalentes aos obtidos empregando-se o ensaio manual. É recomendado que o usuário valide periodicamente o instrumento. Se encontrar qualquer dificuldade na programação e ajuste dos processadores automáticos de Biokit, por favor, contate seu distribuidor. PROCEDIMENTO (Ver esquema do procedimiento) Operações prévias Todos os reativos devem haver alcançado a temperatura ambiente antes de iniciar-se o ensaio. Os reativos líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes de usar. Diluir 1/10 a solução de lavagem concentrada com água destilada ou deionizada. Para uma placa completa, misturar 50 ml de solução de lavagem concentrada com 450 ml de água. No caso de não se utilizar uma placa completa, preparar a parte proporcional de solução. Diluir o conjugado concentrado 1/51 com o diluente do conjugado. Para uma placa, adicionar 240 µl de conjugado concentrado (cor vermelha) a 12 ml de diluente do conjugado (cor amarela). Misturar delicadamente. Para menos de una placa seguir as indicações da tabela 1. A SOLUÇÃO DE TRABALHO É ALARANJADA. TABELA 1 Tiras requeridas Diluente do conjugado ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Conjugado concentrado µl Monitoração da adição das amostras e reativos Dado que a amostra não requer pré-diluição e que os controles e reativos são coloridos, é possível monitorar sua adição aos pocinhos da placa tanto visualmente como por meio de leitura espectrofotométrica. Para isso, depois de cada etapa de dosificação, fazer uma leitura a 450 nm (sem filtro de referencia). Os valores de absorbância devem ser os seguintes: SORO / PLASMA / CONTROLES: CONJUGADO DE TRABALHO (cor laranja): SUBSTRATO DE TRABALHO (cor de rosa): 0.050

4 Se em algum pocinho não se cumprem as especificações mencionadas, é uma indicação de que houve algum problema na dispensação que deve ser investigado. Realização da prova 1. Transferir 100 µl de cada um dos controles positivo e negativo aos pocinhos correspondentes. Utilizar no mínimo 3 pocinhos para o controle negativo, um pocinho para o controle positivo e um para o branco do substrato em todas as placas ou fração das mesmas cada vez que se realiza um ensaio, independente do número de amostras a testar. Deixar o pocinho do branco vazio (recomenda-se reservar o pocinho A1 para o branco). 2. Pipetar 100 µl de cada amostra aos pocinhos correspondentes. 3. Cobrir a placa com uma folha adesiva e incubar durante 60 5 minutos a 37 C. 4. Retirar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos pocinhos e enchê-los completamente (aproximadamente 350 µl), com a solução de lavagem. Repetir o processo de aspiração e lavagem 3 vezes mais. Assegurar que cada coluna de pocinhos esteja em remolho ao menos 15 segundos antes do novo ciclo de aspiração. Após a última lavagem golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar qualquer excesso de líquido nos pocinhos. 5. Transferir 100 µl de conjugado diluído a todos os pocinhos da placa, com exceção do pocinho do branco do substrato. 6. Cobrir a placa com uma nova folha adesiva e incubar 30 2 minutos a 37 C. 7. Durante os últimos 5-10 minutos desta incubação, preparar a solução de substrato-cromógeno. Para uma placa inteira adicionar 280 µl de solução de cromógeno (TMB) diretamente em um frasco de tampão substrato (14 ml) e homogeneizar bem. A SOLUÇÃO PARA USO DEVE SER COR DE ROSA; descartar caso se torne azul. Se não for utilizar toda a placa, preparar a quantidade necessária indicada na tabela 2. TABELA 2 Tiras requeridas Tampão substrato ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Cromógeno (TMB) µl NOTA: O TMB está dissolvido em DMSO. Dado que a temperatura de fusão do DMSO é de 18 C, deixar que o cromógeno alcance a temperatura de C para que se descongele completamente e homogeneizar bem antes de usar. 8. Retirar a folha adesiva. Aspirar e lavar a placa como no passo Adicionar 100 µl de substrato-tmb em todos os pocinhos, inclusive o branco. 10. Incubar durante 30 2 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). 11. Parar a reação pipetando 100 µl de solução de bloqueio em cada pocinho, guardando a mesma seqüência e com os mesmos intervalos observados na adição do substrato-tmb. 12. Ajustar o zero do leitor com o pocinho do branco e ler a absorbância de cada um dos pocinhos a 450 nm, no prazo máximo de 30 minutos. É recomendável fazer leitura bicromática utilizando filtro de referência de nm. Controle de qualidade Os resultados de um ensaio são válidos se são cumpridos os seguintes critérios: 1. Branco do substrato. A absorbância obtida deve ser inferior ou igual a 0,100.

5 2. Média do controle negativo (CNx). Calcular a média dos valores de absorbância obtidos para o controle negativo. Cada um dos valores individuais obtidos deve ser igual ou maior que 0,5 vez o CNx e igual ou inferior a 1,5 vez o CNx. Se um dos valores não estiver dentro dos limites deve ser descartado e recalcular-se a média. Se forem dois os valores fora dos limites a prova deve ser repetida. Exemplo: 0,144 CNx = = 0, ,5 x 0,048 = 0,024 1,5 x 0,048 = 0,072 Controle negativo Absorbância 1 0, , ,049 Total 0,072 Neste exemplo não deve ser descartado nenhum valor. A média dos valores de absorbância dos controles negativos deve ser menor que 0,120 depois de subtrair o branco. CNx < 0, Controle positivo (CP). O valor de absorbância obtido para o controle positivo deve ser superior ou igual a 0,700 depois de subtrair o branco. CP 0,700 Se algum dos critérios acima não se cumpre, o ensaio não é válido e deverá ser repetido. Resultados A presença ou ausência de HBsAg nas amostras analisadas se determina relacionando-se o valor da absorbância de cada amostra com o valor cut-off calculado. 1. Calcular o valor cut-off somando 0,040 à média do controle negativo. Valor cut-off = CNx + 0, Dividir a absorbância da amostra pelo valor cut-off. Positivo: relação absorbância/cut-off 1,0 Negativo: relação absorbância/cut-off 0,9 Duvidoso: relação absorbância/cut-off 0,9 1,0 Interpretação dos resultados Um resultado repetidamente positivo para HBsAg é indicativo da existência de infecção pelo vírus da hepatite B. Para determinar se é uma infecção aguda ou crônica devem ser pesquisados outros marcadores sorológicos da hepatite B, estudando-se paralelamente o quadro clínico do paciente. Limitações do procedimento Toda a amostra com um resultado positivo ou duvidoso para HBsAg deve ser retestada por duplicado; se o resultado é repetidamente positivo ou duvidoso, deve-se provar com um outro teste de características similares. Ainda que o presente método seja qualificado como de terceira geração para a detecção de HBsAg, é reconhecido que os métodos atuais existentes para a detecção de HBsAg, não são suficientemente sensíveis para detectar todos os casos possíveis de hepatite B.

6 Resultados esperados A prevalência de portadores crônicos de HBsAg varia amplamente no mundo, de alta (> 8%, ex., África, Ásia e Pacifico Oeste) a intermediaria (2-7%, ex., sul e leste Europeu) e baixa (< 2%, ex., Europa ocidental, América do Norte e partes da América do Sul). Na Europa ocidental o índice de portadores de HBsAg se situa entre 0,1 e 0,5% e no sul da Europa a prevalência de portadores varia entre 1 e 5%. 13 Características funcionais Sensibilidade analítica A sensibilidade é, como mínimo, de 0,100 unidades/ml de HBsAg para os subtipos ad e ay, utilizando padrões de HBsAg referenciados aos do Instituto Paul Ehrlich (PEI-Alemanha, ref. 87). Utilizando o Segundo Padrão Internacional da Organização Mundial da Saúde para HBsAg, subtipo adw2, genótipo A (ref. NIBSC: 00/588) a sensibilidade obtida é, no mínimo, de 0,125 UI/ml. Avaliações - Em um estudo para avaliar o funcionamento do kit, foram provadas 416 amostras presumivelmente positivas para HBsAg e comparadas com um método de referência. Neste estudo foi obtida uma sensibilidade de 100% amostras de pacientes hospitalizados foram testadas em comparação com um método de referência. 196 amostras foram negativas com ambos os métodos, 3 foram confirmadas positivas e 1 foi um resultado falso positivo. A especificidade obtida neste estudo foi de 99,5%. - Foram testadas 440 amostras de soro de um banco de sangue com 3 lotes de reagente e os resultados foram comparados com o método utilizado em rotina para a triagem de HBsAg. Foi obtida uma especificidade de 100% com dois lotes e de 99,5% com o terceiro lote. - Em um banco de sangue (EFS Centro Atlântico, França), 4871 amostras de doadores não selecionados foram analisadas em paralelo com o método utilizado em rotina para a triagem de HBsAg. Deste total, 11 amostras foram inicialmente reativas (0,23%), das quais 3 foram repetidamente reativas (0,06%). A especificidade obtida foi de 99,94%. Precisão Reprodutibilidade intra-ensaio: Os coeficientes de variação obtidos para os valores de absorbância de 72 réplicas de uma amostra positiva foram de 2,2%, 2,5% e 2,6% em três lotes estudados. Reprodutibilidade inter-ensaio: O controle positivo foi provado em 5 dias diferentes com 3 lotes diferentes de bioelisa HBsAg 3.0. Os coeficientes de variação obtidos para os índices absorbância/cut-off do controle com os três lotes foram de 1,2%, 1,0% e 2,4% respectivamente. Interferências Interferência por adição No se observou interferência por hemoglobina (2 mg/ml), bilirrubina (0,2 mg/ml) e triglicérides (13 mg/ml). Reações cruzadas Em um estudo de possíveis interferências, foram testadas 144 amostras com risco potencial de produzir resultados falsos positivos. Destas amostras, 20 eram provenientes de soros positivos para RPR, 15 eram provenientes de soros positivos para mononucleose, 18 eram positivas para anticorpos anti-nucleares (ANA), 9 eram positivas para fator reumatóide (RF), 32 eram de mulheres grávidas, 20 eram positivas para anticorpos contra a hepatite C, 20 eram positivas para anticorpos contra HIV e 15 eram positivas para anticorpos contra a hepatite A. Foram encontradas 2 amostras positivas que foram confirmadas com um teste de referência. Todas as outras amostras foram negativas com o bioelisa HBsAg 3.0.

7 bioelisa: Guia de problemas Problema Possíveis causas Solução 1. Controles fora de validação. 2. Sem cor ou pouca cor ao final do ensaio. 1a. Temperatura, incubação ou pipetagem incorreta. 1b. Preparação incorreta de reativos, erro de diluição. Reativos não homogeneizados. 1c. Contaminação cruzada entre controles. Verificar o procedimento. Verificar o procedimento. Pipetar cuidadosamente. Não intercambiar as tampas dos frascos. 1d. Filtro de leitura incorreto. Comprovar que o filtro de leitura seja de 450 nm. Se não se usa filtro de referência de nm, as absorbâncias aumentam aproximadamente 50 miliunidades. 1e. Interferência no caminho ótico. 1f. Foram utilizados componentes de lotes diferentes. Verificar o leitor. Limpar ou secar o fundo dos pocinhos. Comprovar que não haja bolhas de ar. Repetir a leitura. Não utilizar componentes de lotes diferentes já que os mesmos são ajustados para cada lote. 1g. Reativos vencidos. Verificar a data de validade do kit e de seus componentes. Não utilizar kits ou reativos vencidos. 2a. Um ou mais reativos não adicionados ou adicionados em seqüência incorreta. 2b. Conjugado inativo: diluição incorreta, conservação incorreta. 2c. Microplaca inativa: conservação incorreta. 2d. Substrato inativo: conservação ou diluição incorreta, o recipiente utilizado afeta a estabilidade do substrato, contaminação cruzada com a solução de bloqueio. Verificar o procedimento. Verificar se há contaminação, verificar o procedimento. Manter sempre as tiras não utilizadas na bolsa de plástico, bem fechada, com o dessecante dentro. Repetir o ensaio. Utilizar sempre uma diluição recém preparada de TMB em tampão substrato. Utilizar recipientes descartáveis ou lavados com ácido ou etanol e enxaguados com água deionizada. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio.

8 bioelisa: Guia de problemas Problema Possíveis causas Solução 3. Demasiada cor em todos os pocinhos da microplaca. 4. Reprodutibilidade pobre ou elevado número de amostras reativas que não se repetem. 3a. Substrato contaminado, oxidado ou preparado incorretamente. 3b. Reativos contaminados ou preparados incorretamente. 3c. Solução de lavagem (1x) contaminada. 3d. Lavagem insuficiente ou não uniforme: volume dispensado ou aspiração insuficiente ou não uniforme, número de ciclos de lavagem insuficiente. Lavador contaminado. 3e. Foi utilizada solução de lavagem de outro fabricante. Comprovar que o substrato preparado seja cor de rosa, descarte-o caso se torne azul. Assegurar-se de que o TMB esteja completamente líquido antes de utilizá-lo. Misturar bem o TMB com o tampão substrato. Utilizar recipientes descartáveis ou lavados com ácido ou etanol. Repetir o ensaio. Verificar se há contaminação (aspecto turvo). Comprovar as diluições. Verificar a qualidade da água destilada/deionizada utilizada para preparar a diluição. Verificar o lavador. Encher totalmente e aspirar completamente os pocinhos. Aumentar o número de ciclos de lavagem e o tempo de molho. Bater a placa invertida sobre papel absorvente. Utilizar somente a solução de lavagem de biokit. 4a. Problemas de lavagem. Ver itens 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetas mal calibradas ou ponteiras mal encaixadas. Técnica de pipetagem incorreta. 4c. Reativos e/ou amostras muito frios ou não homogeneizados antes de usar. 4d. Correntes de ar sobre a microplaca durante as incubações. 4e. Demasiada demora na adição de amostras e/ou reativos. Inconsistência nos intervalos de tempo. Bolhas de ar. 4f. Interferência no caminho ótico. Utilizar pipetas calibradas, com ponteiras bem encaixadas. Pipetar cuidadosamente sem fazer bolhas nem salpicar. Repetir o ensaio. Deixar que os reativos e amostras alcancem a temperatura ambiente e misture-os bem antes de usar. Manter a microplaca protegida de correntes de ar. Desenvolver uma técnica uniforme e reprodutível. Ver 1e.

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