QUANTA Lite Phosphatidylserine IgG ELISA Aplicação Diagnóstica Resumo e Explicação do teste Princípio do método Reagentes Advertências
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- Salvador Caldas Bicalho
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1 QUANTA Lite Phosphatidylserine IgG ELISA (Previamente Kit BINDAZYME para determinação de anticorpos Anti-fosfatidilserina Humana IgG por EIA) Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica Estes testes destinam-se à determinação in-vitro dos anticorpos anti-fosfatidilserina IgG em soro humano, como auxiliar no diagnóstico do sindroma anti-fosfolípidico (SAF). Cada kit contém reagentes suficientes para testar 89 amostras individuais ou 41 amostras em duplicado, incluindo a curva de calibração e os controlos positivo e negativo. Resumo e Explicação do teste Os doentes com sindroma anti-fosfolípidico possuem auto-anticorpos anti-fosfolípidos aniónicos, sofrendo de tromboses recorrentes, abortos e trombocitopenia 1. Estes anticorpos têm vindo a ser detectados através de testes que utilizam a cardiolipina como antigénio, associada ao co-factor ß 2 -glicoproteina 1 2. Em estudos recentes, foram também evidenciadas as implicações clínicas dos anticorpos anti-fosfatidilserina neste tipo de doenças 3. Os anticorpos anti-fosfatidilserina são o marcador ideal na monitorização do sindroma anti-fosfolípidico, este facto é suportado pela presença de tais anticorpos nas membranas das células endoteliais e das plaquetas 4 e foi observado na indução do sindroma nos ratos 5, através destes anticorpos. Princípio do método Os poços da microplaca estão revestidos com fosfatidilserina e co-factor. Os calibradores, controlos e as amostras dos doentes são pipetados nos poços, os auto-anticorpos que reconhecem a fosfatidilserina ligam-se durante a primeira incubação. Após a lavagem dos poços, para a remoção das proteínas que não se ligaram, é adicionado o conjugado de cabra IgG anti-humana, marcado com um peroxidase. O conjugado liga-se ao anticorpo humano capturado e o excesso de conjugado é removido através de lavagens. Após a adição do substrato 3,3,5,5 tetrametilbenzidina (TMB) forma-se um produto de cor azul, cuja intensidade é proporcional à concentração do auto-anticorpo na amostra. É adicionado ácido sulfúrico a cada poço produzindo uma cor amarela que indica o final da reacção. A leitura é realizada a um comprimento de onda de 450nm. Reagentes 1. Placa de ELISA de micropoços de poliestireno Fosfatidilserina antígeno (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes 2. Controlo Negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem IgG anticorpos humanos a Fosfatidilserina, pré-diluído, 1,2 ml 3. Calibrador A Fosfatidilserina IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano 4. Calibrador B Fosfatidilserina IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano 5. Calibrador C Fosfatidilserina IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano 6. Calibrador D Fosfatidilserina IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano 7. Calibrador E Fosfatidilserina IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano 8. Controlo Positivo Fosfatidilserina ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano 9. Diluente da amostra PS, 2 frascos cor-de-pahla, contém solução tampão fosfato salina, estabilizadores proteicos e conservantes, 50 ml 10. Solução de lavagem PBS (20x), 1 frasco 20x concentrado, de cor vermelho contém solução tampão fosfato salina, estabilizadores proteicos e conservantes, 50 ml 11. Conjugado HRP Fosfatidilserina IgG, 1 frasco de cor vermelho com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 12. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 13. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 2. Todo o material de origem humana, utilizado na preparação dos controlos para este produto foi testado e deu resultados negativos para testes aprovados pela FDA em relação a anticorpos anti HBsAg, HIV e HCV. Contudo nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência destes anticorpos ou outros agentes infecciosos. Assim os controlos e calibradores Fosfatidilserina manipulados como material 9 potencialmente infectante. 3. A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O Conjugado HRP Fosfatidilserina IgG contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 1
2 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. Deve seguir-se as instruções com rigor. 3. Qualquer alteração pode ter efeito na prestação do teste, e nos resultados obtidos. Tomar atenção a Notas específicas e avisos ao longo das instruções de uso. 4. Utilizar sempre os reagentes do mesmo lote. Caso se realize um número elevado de testes dever-se-á verificar se todos os reagentes pertencem ao MESMO lote. As tiras devem ser provenientes do mesmo invólucro. A substituição de qualquer componente do kit pode induzir a resultados incorrectos. 5. Para evitar quaisquer contaminações dos reagentes utilizar pontas descartáveis de plástico/vidro. Nunca repor nos frascos originais reagentes não utilizados 6. Não deixar os recipientes dos reagentes destapados, qualquer evaporação ou contaminação pode levar a resultados inconsistentes. 7. O cromogénio TMB não dever ser exposto ao contacto com a luz ou água. 8. Não devem ser utilizados soros contaminados, hemolisados ou lipémicos e amostras que contenham partículas em suspensão. 9. A diluição não pode ser verificada visto que os controlos estão prontos a usar. Recomenda-se a utilização de pipetas calibradas e de soro de Controlo de Qualidade interno (CQ). 10. A utilização de sistemas automáticos para o teste, diluição das amostras e outros aparelhos automáticos pode conduzir a diferenças nos resultados quando comparados com o procedimento manual. É da responsabilidade de qualquer laboratório a validação do sistema com o qual está a trabalhar, e assegurar que os resultados se encontram dentro dos limites definidos pelas instruções de uso e pelo certificado de CQ associado. 11. Todo o equipamento utilizado deve ser calibrado e conservado de acordo com as instruções do fabricante. Precauções particulares de conservação 1. O kit deve ser conservado entre 2-8ºC e não deve ser congelado. O armazenamento a temperaturas inapropriadas irá afectar os resultados. 2. O tampão de lavagem diluído para um frasco limpo pode ser conservado à temperatura ambiente (20-26ºC) até 1 semana. 3. A data de validade do kit está mencionada no rótulo exterior. Colheita da amostra 1. As amostras de sangue devem ser colhidas por punção venosa de modo a permitir a formação do coágulo naturalmente e a separação do soro. 2. O soro pode ser conservado de 2-8 C até 7 dias antes do teste 6, ou em aliquotas a -20 C ou menos, para períodos mais prolongados. 3. Deve evitar-se o descongelamento e congelamento sucessivo. 4. As amostras de soro não devem ser inactivadas pelo calor, pois poder-se-á obter resultados falsos positivos. Procedimento Material fornecido Instruções de uso: Fornece instruções detalhadas do teste. Certificado CQ: Indica a performance esperada para o lote. Phosphatidylserine Coated Wells (Microplaca revestida com Fosfatidilserina): 12 tiras fraccionáveis constituidas por 8 poços cada revestidos com antigénio Fosfatidilserina. Cada microplaca é embalada num invólucro hermeticamente fechado e contém dois pacotes de exsicante. PS Sample Diluent (Diluente da amostra PS): 2 frascos contendo 50mL de tampão para a diluição da amostra. Com coloração pahla e formato pronto a usar. PBS Wash Concentrate (20x) (Tampão de lavagem PBS, concentrado 20 vezes): 1 frasco contendo 50mL de tampão de lavagem dos poços da microplaca concentrado 20 vezes. Phosphatidylserine IgG Calibrators (Calibradores Fosfatidilserina IgG): 5 frascos com 1,2mL de soro humano com autoanticorpos anti- Fosfatidilserina com as seguintes concentrações: 100; 33,3; 11,1; 3,7; 1,23 GPS U/mL. Pronto a usar. Phosphatidylserine IgG Positive Control (Controlo positivo Fosfatidilserina IgG): 1 frasco contendo 1,2mL de soro humano. Pronto a usar. ELISA Negative Control (Controlo negativo ELISA): 1 frasco contendo 1,2mL de soro humano. Pronto a usar. HRP Phosphatidylserine IgG Conjugate (Conjugado HRP Fosfatidilserina IgG): 1 frasco contendo 10mL de anticorpo para IgG humana marcado com um peroxidase. Coloração vermelho. Pronto a usar. TMB Chromogen (Cromogénio TMB): 1 frasco contendo 10mL de substrato TMB. Pronto a usar. HRP Stop Solution (Solução de paragem HRP): 1 frasco contendo 10mL de ácido sulfúrico 0,344 M. Pronto a usar. 2
3 Material adicional necessário mas não fornecido Lavador automático de microplacas: É o mais recomendado, no entanto a lavagem pode ser efectuada manualmente. Leitor de microplacas: Para efectuar leituras de densidade óptica a 450nm contra o ar. Água destilada ou desionisada: A água deve ser de elevada qualidade. Micropipetas calibradas: Para a pipetagem de 1000, 100 e 10µL. Pipeta multicanal: Recomendado para a pipetagem de volumes de 100µL do conjugado, cromogénio e s olução de paragem. Pontas de plástico/vidro: Para a diluição das amostras. Método Antes de iniciar 1. Conduzir o kit à temperatura ambiente O kit foi desenvolvido para a realização dos testes à temperatura ambiente (20-24 C). Retirar o kit do frigorifico e deixa-lo à temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. As microplacas não devem ser retiradas do invólucro antes deste se encontrar à temperatura ambiente. Nota: Este kit pode ser conservado à temperatura ambiente até uma semana. 2. Componentes do kit Agitar suavemente todos os componentes do kit, antes de usar. 3. Diluição do tampão de lavagem Diluir o Tampão de lavagem PBS 1:20, adicionando o conteúdo do frasco do concentrado Tampão de lavagem PBS a 950 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 4,0 ml de concentrado a 76 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. 4. Diluição da amostra Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 10 µl de amostra a 1000 µl de diluente de amostras PS. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR os Calibradores Fosfatidilserina A a E, o Controlo Fosfatidilserina nem o Controlo Negativo ELISA. 5. Manuseamento das tiras e da moldura das tiras Colocar o número de tiras necessárias na moldura da microplaca e fixá-las pelas extremidades, posicionar-se no poço A1 e preencher as colunas da microplaca da esquerda para a direita. Nota: Repor, de imediato, as tiras não utilizadas no invólucro com os dois sacos de exsicante e fecha-los novamente de modo a minimizar a exposição ao ar. Cuidado para não perfurar ou rasgar o invólucro. AVISO: A exposição das tiras à humidade ou contaminação pelo ar ou por outras partículas pode resultar na deterioração do antigénio, conduzindo à perda de precisão do teste bem como a resultados falsos. Técnica Manter durante o teste a mesma sequência de pipetagem. 1. Amostra Pipetar 100µL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:101) nos poços da microplaca. Nota: As amostras devem ser pipetadas de imediato para a placa com o objectivo de minimizar as alterações aos resultados do teste, o tempo começa a contar após a pipetagem da ultima amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. 2. Lavagem Os passos de lavagem são passos críticos e requerem uma atenção especial. A lavagem dos poços quando realizada de modo inadequado, pode conduzir a resultados pouco precisos e a um elevado background. Após a incubação lavar a microplaca 3 vezes com µL tampão de lavagem, por poço. A microplaca deve ser lavada com um lavador automático de microplacas ou manualmente de acordo com as indicações abaixo. Após a lavagem de modo automático, inverter a microplaca sobre papel absorvente, batendo suavemente, de modo a secar os poços completamente. Lavagem manual das microplacas: a. Deitar fora o conteúdo dos poços. b. Bater suavemente com a microplaca invertida sobre papel absorvente. c. Encher cada poço com µL de tampão de lavagem utilizando uma pipeta multicanal. d. Agitar suavemente a microplaca numa superfície plana. e. Repetir os passos de a-d duas vezes. f. Repetir a e b. 3. Adição do conjugado Pipetar 100µL de conjugado em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modo a remover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso de conjugado no frasco correspondente.incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. 4. Lavagem Repetir o descrito no passo Adição do cromogénio (TMB) Pipetar 100µL de cromogénio (TMB) em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modo a remover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso de cromogénio (TMB) no frasco correspondente. Incubar, no escuro, à temperatura ambiente durante 30 minutos. 7. Paragem da reacção Pipetar 100µL de solução de paragem em cada poço. Dá-se uma mudança de cor de azul para amarelo. 8. Leitura da densidade óptica Ler a densidade óptica (DO) de cada poço a 450nm, num leitor de microplacas até 30 minutos após a adição da solução de paragem. 3
4 Controlo de qualidade 1. Controlo de qualidade Para que o teste seja válido, tem que obedecer aos seguintes critérios: Os controlos positivos e negativos e calibradores devem estar incluídos em cada série. Os valores obtidos para os controlos devem encontrar-se dentro do intervalo especificado pelo Certificado de CQ. A curva obtida deve ser similar à curva de calibração evidenciada no Certificado CQ. Caso os critérios acima referidos não sejam respeitados o teste é considerado inválido e o teste deve ser repetido. 2. Cálculo da media das densidades ópticas (somente para os testes realizados em duplicado) Para cada calibrador, controlo ou amostra calcular a média da DO das leituras em duplicado. A percentagem do coeficiente de variação (%C.V.) para cada DO em duplicado deverá ser inferior a 15%. 3. Traçar curva de calibração A curva de calibração pode ser traçada automaticamente ou manualmente, colocando o valor das concentrações dos autoanticorpos anti-fosfatidilserina na escala logarítmica e as D.O. a cada calibrador na escala linear. Automaticamente utilizar um software adequado e uma curva adequada aos dados obtidos. Manual utilizar um papel log/linear, traçar a melhor curva através dos pontos obtidos (não traçar uma linha recta nem "ponto a ponto"). 4. Tratamento de pontos anómalos Caso algum ponto se encontre fora da curva de calibração, este pode ser removido. Caso a ausência deste ponto determine uma forma que não seja semelhante à da curva padrão de calibração, ou caso surjam outros pontos irregulares, o teste deve ser repetido. 5. Cálculo dos níveis de auto-anticorpos nos controlos e nas amostras Determinar o nível dos auto-anticorpos anti-fosfatidilserina dos controlo e nas amostras diluídas directamente a partir da curva de calibração. Os valores dos controlos devem incidir no intervalo referido no Certificado de CQ. Nota: Os valores dos calibradores foram ajustados por um factor de 100 de acordo com o factor de diluição da amostra (1:101). Não é necessário fazer qualquer outra correcção. 6. Calibração do teste O teste foi calibrado de acordo com o calibrador de referência Louisville LAPL-GM-200. Limitações do método Este kit é utilizado somente como auxílio para diagnóstico. Um resultado positivo deve ser confirmado através de outros dados clínicos e outros testes serológicos. Os resultados obtidos deste teste não servem para confirmar o diagnóstico da presença ou ausência da doença. Características de desempenho Precisão A precisão intra-ensaio foi determinada utilizando três amostras cujos valores se encontram no intervalo da curva de calibração. Os valores de %CV para cada amostra são apresentados na tabela seguinte: PRECISÃO INTRA-ENSAIO n=16 Concentração (GPS U/mL) % C.V. Amostra 1 12,7 7,3 Amostra 2 25,7 6,6 Amostra 3 75,4 6,9 PRECISÃO INTER-ENSAIO n=3 Concentração (GPS U/mL) % C.V. Amostra 4 16,7 2,9 Amostra 5 22,4 10,6 Amostra 6 34,2 4,8 Intervalo de valores normais Os níveis de autoanticorpos anti-fosfatidilserina foram determinados no soro de 200 dadores de sangue normais. Os resultados estão demonstrados nos gráficos abaixo. Com base num cut-off negativo de <11 GPS U/mL, 1/200 das amostras foram consideradas positivas com um resultado de 12,86. Distribuição normal IgG PS No. de Amostras >11 IgG anti-ps GPS U/mL Os valores de referência apresentados servem apenas de exemplo. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores normais. 4
5 Especificidade, Sensibilidade e Concordãncia A especificidade, sensibilidade e concordância relativas foram determinadas contra kits alternativos de antifosfatidilserina EIA utilizando 55 amostras. EIA Kit Alternativo EIA + - BINDAZYME a EIA anti-fosfatidilserina IgG Sensibilidade relativa 100,0% Especificidade relativa 64,3% Concordância relativa 81,8% a Foi comprovada a concordância entre a presença de anticorpos anti-fosfatidilserina e anti-cardiolipina nas amostras dos doentes 7. As 10 amostras que apresentaram discrepâncias foram testadas com um teste de anticardiolipina IgG; 8/10 confirmaram serem positivas. Sensibilidade Analítico A sensibilidade foi determinada calculando a concentração média + 2 SD dada por 20 determinações do diluente da amostra. Isto equivale a 0,21 GPS U/mL. Intervalo de Leitura O intervalo de leitura do teste é de 1, GPS U/mL. Substância Interferentes Foram inseridos, numa amostra de anti-fosfatidilserina elevada e baixa, vários tipos de substâncias interferentes, subsequentemente re testadas. O método utilizado para a verificação destas substâncias foi baseado no Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku, Japão. Substância Bilirrubina F (livre) Bilirrubina C (conjugada) Hemoglobina hemolisada Quilo Concentração 18,3 mg/dl 19,0 mg/dl 490,0 mg/dl 1930,0 unidades Não se verificou quaisquer interferências. NOTA: As amostras de doentes com mielomas IgG podem gerar resultados falsos positivos. Contudo, está documentado 8 que alguns anticorpos do mieloma demonstram uma actividade anti-fosfolípidica específica. Valores esperados Os valores de referência foram determinados em 200 amostras de soro de doadores saudáveis. Estes valores são somente fornecidos como referência. Os testes de ELISA são muito sensíveis e capazes de detectar pequenas diferenças nas amostras. Recomenda-se que cada laboratório determine os seus intervalos de referência. Anti-fosfatidilserina IgG <11 GPS U/mL Resultado negativo 11 GPS U/mL Resultado positivo 5
6 Esquema da Microplaca A B C D E F G H Sumário do Procedimento 1. Pipetar 100µL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:101) nos poços. Incubar durante 30 minutos. Lavar. 2. Adicionar 100µL de conjugado em cada poço. Incubar durante 30 minutos. Lavar. 3. Adicionar 100µL de substrato em cada poço. Incubar durante 30 minutos. 4. Adicionar 100µL de solução de paragem em cada poço. Ler as absorvâncias a 450nm. QUANTA Lite é uma marca registada da INOVA Diagnostics, Inc. 6
7 Referências 1. McNeil HP, Chesterman CN, Krillis SA (1991). Immunology and Clinical Importance of Anti-phospholipid Antibodies. Adv Immunol,49: Roubey AS (1996). Immunology of the Anti-phospholipid Antibody Syndrome. Arthritis & Rheumatism,39: Barna LK et al. (1994) A study of relationships among anti-phosphatidylserine and anti-cardiolipin antibodies, the lupus anticoagulant and clinical complications. Lupus 3: Schick PK, Kurica KB, Chacko GK (1976) Location of phosphatidylethanolamine and phosphatidylserine in the human platelet plasma membrane. J Clin Invest 57: Blank M, Tincani A,, Shoenfeld Y (1994) Induction of experimental anti-phospholipid syndrome in naïve mice with purified IgG anti-phosphatidylserine antibodies. J Rheumatol 21: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Radway-Bright E.L., Ravirajan C.T. and Isenberg D.A. (2000) The prevalence of antibodies to anionic phospholipids in patients with the primary antiphospholipid syndrome and their relatives and spouses. J Rheumatol 21: MacGregor AJ. et al. (1992). Analysis of antibody reactivity in sera of 42 patients with paraproteinaemia. Autoimmunity; 13: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT August 2012 Revision 1 7
5. Esta observação confirma a necessidade de
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