LER ALTERAÇÕES DESTACADAS

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1 LER ALTERAÇÕES DESTACADAS bioelisa HTLV-I+II tests Teste ELISA para a detecção de anticorpos contra HTLV-I e HTLV-II em soro ou plasma humano. Prevê-se seu uso como teste de triagem que requer repetir as amostras inicialmente reativas. Sumário Os vírus linfotrópicos humanos de células T (HTLV) são retrovírus patogénicos que podem provocar doenças hematológicas e neurológicas graves nos indivíduos infectados. A família HTLV compreende dois membros bem estudados, o HTLV-I e o HTLV-II, bem como dois membros recém-descobertos, o HTLV-3 e o HTLV-4. O HTLV-I é conhecido como o agente etiológico da leucemia/linfoma de células T adultas (ATL), a paraparésia espástica tropical/mielopatia associada à HTLV (TSP/HAM) e a uveíte associada à HTLV. A infecção por HTLV-II também foi associada à leucemia e a doenças neurológicas, embora seja menos patogénica do que a provocada pelo HTLV-I. Várias evidências moleculares sugerem que o HTLV-3 possui algumas das propriedades do HTLV-I, embora se saiba pouco sobre a patogenicidade do HTLV-3. Estudos de distribuição geográfica da infecção por HTLV-I revelam que o vírus é muito prevalente no Japão, África, as ilhas do Caribe e América do Sul. Estudos epidemiológicos realizados recentemente nos Estados Unidos da América e na Europa, confirmam a presença de uma prevalência mista de HTLV-I e HTLV-II entre várias populações de alto risco, tais como os consumidores de drogas por via intravenosa e os receptores de transfusões. Os vírus podem ser transmitidos por contacto sexual e através de produtos sanguíneos contaminados, e da mãe para o filho através da amamentação. O bioelisa HTLV-I+II 5.0 é um imunoensaio directo sandwich que utiliza uma combinação de proteínas recombinantes e uma proteína recombinante de fusão tripla marcada com peroxidase de rábano. Este formato de análise garante a detecção simultânea de vários anticorpos específicos IgA, IgG e IgM contra o HTLV-I e o HTLV-II. Para além do mais, avaliações externas demonstraram que o bioelisa HTLV-I+II 5.0 é capaz de detectar anticorpos contra o HTLV-3/STLV-3 (consulte o capítulo específico sobre características funcionais). O kit bioelisa HTLV-I+II 5.0 foi desenvolvido como enzimo-imuno-teste semi-quantitativo para a detecção de anticorpos frente aos vírus HTLV-I e HTLV-II em soro ou plasma humano. Prevê-se seu uso como teste de triagem. É preciso voltar a analisar as amostras inicialmente reativas e confirmar o resultado das amostras repetidamente reativas com testes complementares. Princípio Os pocinhos das tiras das microplacas de poliestireno são revestidos com uma mistura de três proteínas recombinantes diferentes de HTLV, que correspondem a segmentos muito antigênicos dos vírus HTLV-I e HTLV-II. O conjugado está baseado em uma proteína recombinante de fusão tripla, marcada com peroxidase de rabanete. O antígeno de tripla fusão é gerado através da clonação de três fragmentos de ADNc que codificam as três proteínas recombinantes do HTLV num único vector.. O soro ou plasma humano, diluído em o diluente que contem o conjugado, incuba-se em um pocinho revestido. Os anticorpos específicos contra o HTLV-I/II (IgA, IgG e IgM), caso estejam presentes, unem-se tanto aos antígenos imobilizados na fase sólida como ao antígeno de tripla fusão do conjugado. Os pocinhos são lavados minuciosamente para eliminar todo o produto não ligado Este anticorpo marcado une-se aos complexos antígeno-anticorpo previamente formados; os anticorpos marcados não ligados restantes são eliminados por meio de lavagem. A seguir acrescenta-se nos pocinhos uma solução de substrato que contém o cromógeno 3,3, 5,5 - tetrametilbenzidina (TMB). O aparecimento de uma cor azul depois da adição do substrato indica a presença de anticorpos específicos. Para deter a reação adiciona-se ácido sulfúrico e a cor azul muda a amarelo. A intensidade da cor, que se mede por espectrofotometria a 450 nm, é proporcional à quantidade de anticorpos presentes na amostra. Componentes 1. MCPL MICROPLACA: 2 placas com 12 tiras de 8 pocinhos. Os pocinhos das microplacas contêm proteínas recombinantes de HTLV-I e HTLV-II adsorvidas. Conservar entre 2-8 C. 2. CONTROL CONTROLE NEGATIVO: 1 x 1,8 ml de soro humano normal, negativo para anti-hcv, anti-hiv-1/2, anti-htlv-i/ii e para HBsAg. Contém mertiolato sódico e azida sódica como conservantes. Conservar entre 2-8 C. 3. CONTROL + CONTROLE POSITIVO: 1 x 1,8 ml de soro humano inativado, com uma concentração alta de anticorpos IgG específicos contra HTLV-I/II e negativo para anti-hcv, anti-hiv-1/2 e para HBsAg. Contém mertiolato sódico e azida sódica como conservantes. Conservar entre 2-8 C.

2 4. DIL DILUENTE: 1 x 50 ml de tampão fosfato-salina, com caseína e detergente. Contém Bronidox TM como conservante. Conservar entre 2-8 C. 5. WASH SOLN 20x SOLUÇÃO DE LAVAGEM CONCENTRADA: 1 x 120 ml de solução salina tamponada com fosfato e Tween-20. Contém cloro-acetamida como conservante. Conservar entre 2-8 C. 6. CONJ CONJUGADO: 1 x 160 µl de antígeno HTLV de fusão tripla marcada com peroxidase de rabanete. Contém 0,02% de mertiolato sódico como conservante.conservar entre 2-8 C. 7. SUBS TMB SUBSTRATO-TMB: 1 x 25 ml de solução incolor que contém 3,3, 5,5 - tetrametilbenzidina (TMB). Conservar no escuro entre 2-8 C. 8. H 2 SO 4 2M SOLUÇÃO DE BLOQUEIO: 1 x 30 ml de solução de ácido sulfúrico 2M. Conservar entre 2-8 C. 9. SEALS FOLHAS ADESIVAS: Para cobrir a microplaca durante as incubações. 10. BAG BOLSA DE PLÁSTICO: Para guardar as tiras sem usar. * Bronidox é uma Marca Registrada da Henkel Chemical Co. Precauções O bioelisa HTLV-I+II 5.0 é para o diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivamente por profissionais. Consulte a etiqueta do produto para obter informação sobre os componentes potencialmente perigosos. INFORMAÇÃO SANITÁRIA E DE SEGURANÇA PRECAUÇÃO: Este kit contém produtos de origem humana. Nenhum método de análise permite oferecer uma garantia absoluta de que os hemoderivados humanos não transmitam uma infecção. MANIPULE AS AMOSTRAS E OS CONTROLES POSITIVOS E NEGATIVOS DO TESTE COMO SE FOSSEM POTENCIALMENTE INFECCIOSOS. Recomenda-se manipular os componentes do kit e as amostras de acordo com as práticas corretas de laboratório. Do mesmo modo, devem ser eliminados de acordo com os procedimentos de segurança estabelecidos. O Controle Positivo e o Controle Negativo contêm mertiolato a 0,005% e azida sódica a 0,1%. A azida sódica pode reagir com o cobre e o chumbo utilizados em certos encanamentos e formar sais explosivos. Ainda que as quantidades usadas neste kit sejam pequenas, os materiais que contêm azida devem ser eliminados em volumes relativamente grandes de água para evitar a acumulação de azidas metálicas nos encanamentos. A seguir indicam-se os avisos referentes ao risco (R) e à segurança (S). Mertiolato: R26/27/28 S Nocivo por inalação, por ingestão e em contato com a pele. Após contacto com a pele, lave imediatamente com água em abundância. Use vestimenta de proteção adequada. No caso de acidente ou mal-estar, procure um médico imediatamente (se for possível, mostre-lhe a etiqueta). Azida sódica: R28-32 Nocivo por ingestão. Em contato com ácidos libera gases muito tóxicos. S28-45 Após contacto com a pele, lave imediatamente com água em abundância. No caso de acidente ou mal-estar, procure um médico imediatamente (se for possível, mostre-lhe a etiqueta).

3 O Diluente contém 0,5% Bronidox, classificado como irritante (Xi) pelas Normas aplicáveis da Comunidade Econômica Européia (CEE). A seguir indicam-se as observações referentes aos riscos (R) e à segurança (S). R22 R38 S36 S46 Nocivo por ingestão. Irrita a pele. Use vestimenta de proteção adequada. No caso de ingestão, procure o médico imediatamente e mostre-lhe a etiqueta ou a embalagem. A Solução de Lavagem Concentrada (20x) contém 2% de cloro-acetamida, classificada como irritante (Xi) pelas Normas aplicáveis da Comunidade Econômica Européia (CEE). A seguir indicam-se as observações referentes aos riscos (R) e à segurança (S). R25 Nocivo por ingestão. R43 Possibilidade de sensibilização em contato com a pele. R62 Possíveis riscos de comprometer a fertilidade. S22 Não respirar o pó. S36/37 Use vestimenta e luvas de proteção adequadas. S45 No caso de acidente ou mal-estar, procure um médico imediatamente (se for possível, mostre-lhe a etiqueta). A Solução de Parada é ácido sulfúrico 2M, classificada como corrosiva (C) pelas Normas aplicáveis da Comunidade Econômica Européia (CEE). A seguir indicam-se as observações referentes aos riscos (R) e à segurança (S). R35 S Provoca queimaduras graves. Em caso de contato com os olhos, lave imediatamente com água em abundância e procure um médico. Nunca adicionar água a este produto. No caso de acidente ou mal-estar, procure um médico imediatamente (se for possível, mostre-lhe a etiqueta). 1. Evite a contaminação microbiana dos reativos ao abri-los e ao retirar alíquotas dos recipientes ou frascos originais. 2. Não pipetar com a boca. 3. Manipule as amostras, as microplacas, o controle positivo e o negativo como se fossem agentes potencialmente infecciosos. 4. Use bata de laboratório e luvas descartáveis durante a realização do teste. Jogue as luvas em sacos para resíduos que ofereçam perigo biológico. Lavar bem as mãos ao finalizar. 5. É muito recomendável que este teste seja realizado em uma câmara de segurança biológica. 6. Mantenha o material longe de bebidas e alimentos. 7. Em caso de acidente ou contato com os olhos, lave imediatamente com água em abundância e procure um médico. 8. Procure um médico imediatamente se ingerir material contaminado ou se este entrar em contato com feridas abertas ou outras lesões da pele. 9. O ácido sulfúrico pode causar queimaduras. EVITAR O CONTACTO. Em caso de contacto com a pele, lave imediatamente com água. 10. Evitar o contacto do ácido sulfúrico com qualquer agente oxidante ou metal. 11. Não exponha o substrato-tmb a luz forte. 12. Limpe imediatamente os resíduos de material potencialmente infeccioso com um papel absorvente e lave a zona contaminada com uma solução desinfetante antes de retomar o trabalho.

4 PRECAUÇÕES ANALÍTICAS 1. Podem ser utilizadas amostras de soro ou plasma com EDTA, Heparina, Citrato Sódico, Potássio-Oxalato ou Ácido Citrato de Dextrose (ACD). Antes de guardar as amostras, verifique se se separaram por centrifugação os coágulos ou as células sangüíneas. 2. Não utilizar sangue total ou outros fluidos corporais. 3. Para obter o máximo rendimento do teste é necessário o CUMPRIMENTO ESTRITO do procedimento descrito no presente Manual de Instruções. Qualquer modificação no procedimento pode produzir resultados anômalos. 4. NÃO TROQUE NEM SUBSTITUA OS REATIVOS DE UM LOTE DO KIT PELOS DE OUTRO. Os controles, o conjugado e as microplacas estão ajustados para um rendimento ótimo. Use apenas os reativos fornecidos com o kit. 5. Não utilize os componentes do kit depois do prazo de validade que consta nas etiquetas. 6. Evite a contaminação microbiana dos reativos ao abri-los e ao extrair partes dos recipientes ou frascos originais, já que isso reduziria de forma prematura o período de validez dos kits e daria lugar a resultados errôneos. Ao extrair quantidades dos recipientes utilize técnicas assépticas, como pipetas ou pontas de pipeta descartáveis. 7. Para evitar a contaminação cruzada, use uma ponta de pipeta nova para cada quantidade que se extraia da amostra e não toque a borda nem o fundo das tiras, a borda dos pocinhos nem o líquido das mesmas com os dedos ou com as pontas de pipeta. 8. Aconselha-se lavar o material de vidro que será utilizado para os reativos com ácido clorídrico 2M e lavá-lo bem com água destilada ou desionizada antes de usá-lo. 9. Para obter melhores resultados, permita que todos os reativos e as amostras cheguem à temperatura ambiente (25 C ± 3 C) antes de usá-los. Imediatamente depois do uso, volte a conservá-los entre 2-8 C. 10. Utilize somente água destilada ou desionizada de qualidade reativa para diluir os reativos. 11. TODOS OS REATIVOS DEVEM SER MISTURADOS BEM ANTES DE SEU USO. 12. A SOLUÇÃO DE TRABALHO DO CONJUGADO DILUÍDO DEVE ESTAR RECÉM PREPARADA. 13. Não exponha os reativos nem execute a análise em uma área em que exista um nível elevado de vapores de desinfetantes químicos (P. ex. vapores de hipoclorito) durante as etapas de armazenamento e de incubação, já que o contato com os mesmos inibe a reação colorimétrica. Os reativos também não devem ser expostos à luz intensa. 14. Deixe as microplacas em sua embalagem de armazenamento até o momento imediatamente anterior a seu uso. As tiras abertas que não forem utilizadas devem conservar-se entre 2-8 C dentro de sua embalagem de armazenamento e com o dessecante fornecido. 15. Os controles do kit devem ser analisados ao mesmo tempo que as amostras clínicas em cada série de análise. 16. Deve evitar-se tocar ou salpicar a borda do pocinho com o conjugado. Não "esprema" a micropipeta. 17. O uso de amostras muito hemolisadas, soros não totalmente coagulados, amostras de plasma com fibrina ou amostras com contaminação microbiana pode causar resultados errôneos. 18. Não incube as placas em banho de água. 19. Durante a incubação a 37 C, é preciso evitar a evaporação. Cubra as placas com as folhas adesivas fornecidas para tal finalidade. 20. Evite abrir e fechar repetidamente a porta do incubador durante as etapas de incubação.

5 21. Certifique-se de que o fundo da placa está limpo e seco e que a superfície do líquido não apresenta borbulhas antes de ler a placa. Elimine todas as borbulhas do pocinho, por exemplo mediante pequenos golpes. 22. Assegure-se de que o equipamento automatizado foi verificado antes do seu uso. 23. Para evitar a contaminação por deslocamento de amostras muito reativas a amostras não reativas, é muito importante e recomendável realizar a manutenção sistemática do sistema de aspiração e lavagem. Conservação 1. Conserve o kit bioelisa HTLV-I+II 5.0 e seus componentes entre 2-8 C quando não estiverem sendo utilizados. 2. Todos os reativos e tiras, si se conservarem entre 2-8 C, são estáveis até a data de caducidade que consta no kit. Não congele os reativos. 3. A solução de lavagem concentrada (20x) pode formar cristais ao conservar-se entre 2-8 C. Os cristais devem ser dissolvidos por aquecimento a 37 C antes de seu uso. 4. A estabilidade do kit após a sua abertura é de 12 meses. No entanto, a data de expiração do kit será a indicada na etiqueta da caixa do reactivo. 5. As tiras de microplacas abertas ou não utilizadas devem ser conservadas entre 2-8 C em uma bolsa fechada e com o dessecante fornecido. Coleta da amostra É possível utilizar amostras de soro ou plasma com EDTA, Heparina, Citrato sódico, Potássio-Oxalato ou Ácido Citrato de Dextrose (ACD). Antes de guardar as amostras, verifique se os coágulos ou as células sangüíneas se separaram por centrifugação. E preferível o uso de amostras frescas. Recomenda-se que o soro dos pacientes não seja submetido a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento antes do teste. As amostras devem ser conservadas entre 2-8 C se se pretende realizar a análise nos 7 dias posteriores à extração, ou congelar-se a uma temperatura de pelo menos -20 C se a análise atrasar-se mais de 7 dias. Também se pode utilizar azida sódica até 0,1% para estabilizar as amostras de soro ou plasma quando conservadas entre 2-8 C. É preferível utilizar amostras transparentes e não hemolisadas. As amostras lipêmicas, ictéricas ou contaminadas (por partículas ou bactérias) devem ser filtradas (0,45 µm) ou centrifugadas antes do teste. O soro dos pacientes pode estar inativado, mas isso não é um requisito indispensável para o rendimento ideal da análise. Porém, o efeito desse tratamento nos anticorpos IgM não foi determinado totalmente. Se necessário, inactivar da forma indicada a seguir: 1. Afrouxe as tampas dos recipientes com o soro. 2. Aqueça o soro a 56 C durante 30 minutos em banho-maria. 3. Deixe esfriar o soro antes de voltar a ajustar as tampas. 4. É possível manter o soro congelado até a análise. Recomenda-se que o soro dos pacientes não seja submetido a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento antes do teste. Material necessário não incluído 1. Papel absorvente descartável para o banco de trabalho e toalhas de papel. 2. Recipientes ou tubos de polipropileno. 3. Pipetas graduadas: 5 ml, 10 ml. 4. Pipeta multicanal capaz de dispensar 50 µl, 100 µl y 200 µl. 5. Pipetas graduáveis com capacidade de µl. 6. Pontas de pipeta descartáveis. 7. Recipientes para reativos (depósitos) com capacidade para 25 ml. 8. Água destilada ou desionizada de qualidade reativa. 9. Provetas: 500 ml, 1 litro.

6 10. Lavador de microplacas ELISA. Outra possibilidade consiste em realizar a lavagem manualmente com um pipetador multicanal capaz de dispensar volumes de 0,3 ml e um dispositivo aspirador. 11. Incubador a 37 ± 1 C. 12. Leitor de microplacas com filtro de 450 nm. Recomenda-se filtro de referência a 620 ou 630 nm. 13. Desinfetante eficaz. Processamento automático Esta prova pode ser utilizada de modo automático ou semi-automático com diferentes instrumentos. É muito importante validar qualquer sistema automático para demonstrar que os resultados obtidos para as amostras são equivalentes aos obtidos empregando-se o ensaio manual. É recomendado que o usuário valide periodicamente o instrumento. Se encontrar qualquer dificuldade na programação e ajuste dos processadores automáticos de Biokit, por favor, contate seu distribuidor. Preparação dos reativos 1. CONJUGADO DE TRABALHO a. O CONJUGADO DE TRABALHO deve estar recém-preparado. b. Misturar o conjugado e o diluente, cuidadosamente antes de usar. NÃO CENTRIFUGAR o frasco de conjugado. c. Para preparar o conjugado de trabalho, dilua a 1:200 o conjugado com o diluente fornecido no kit. Por exemplo, 10 µl de conjugado em 2,0 ml de diluente. d. Utilize somente tubos ou recipientes de polipropileno. TABELA DE PREPARAÇÃO DO CONJUGADO (1:200 factor de dilução) Número de testes Volume de Conjugado (µl) Volume de diluente (ml) 24 15,0 3, ,0 5, ,0 6, ,0 8,0 2. SOLUÇÃO DE LAVAGEM DILUÍDA a. A SOLUÇÃO DE LAVAGEM DILUÍDA é estável durante 2 semanas à temperatura ambiente. b. Dilua 1 volume da SOLUÇÃO DE LAVAGEM CONCENTRADA com 19 volumes de água destilada (de qualidade reativa). Misture bem. São necessários aproximadamente 200 ml de tampão de lavagem para lavar 1 placa. PROCEDIMENTO (Ver esquema do procedimiento) IMPORTANTE: Os imunotestes deste tipo são termo-sensíveis e tempo-dependentes. O cumprimento estrito do procedimento do teste garante o funcionamento ideal do mesmo. Qualquer modificação do procedimento recomendado pode provocar resultados anômalos. 1. Todos os componentes do kit e amostras devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) antes de iniciar-se o ensaio. 2. Prepare o CONJUGADO DE TRABALHO tal como se descreve na PREPARAÇÃO DOS REATIVOS. 3. Retire a microplaca da embalagem de alumínio. 4. Agite suavemente a amostra e os frascos dos controles antes de usar. 5. Encha um recipiente para reativos com o CONJUGADO DE TRABALHO. Mediante uma pipeta multicanal, acrescente 50 µl de CONJUGADO DE TRABALHO em todos os pocinhos. 6. O pocinho A1 reserva-se para "BRANCO". NÃO ADICIONE CONJUGADO DE TRABALHO em este POCINHO. Adicione mais 50 µl de diluente em este pocinho. 50 µl 50 µl

7 7. Adicione 50 µl de cada amostra ao pocinho correspondente, começando pelo pocinho H1. Isto produz uma diluição final da amostra de 1:2. Misturar aspirando acima e abaixo, pelo menos uma vez. Repetir este passo com as outras amostras até que todas estejam dispensadas. 8. Adicione 50 µl de CONTROLE NEGATIVO por pocinho em três pocinhos B1, C1 e D1. Misturar aspirando acima e abaixo, pelo menos uma vez. 9. Adicione 50 µl de CONTROLE POSITIVO por pocinho em três pocinhos E1, F1 e G1. Misturar aspirando acima e abaixo, pelo menos uma vez. 10. Misture bem com pequenos golpes em todas as laterais da microplaca, garantindo que a placa seja mantida na horizontal na mesa de trabalho. Cubra com cuidado a microplaca com uma das lâminas adesivas fornecidas para evitar a evaporação durante a incubação. 50 µl 50 µl 50 µl Incube durante 60 2 minutos a 37 1 C. (Não use banho de água para a incubação). 60 minutos 12. Retire e elimine a lâmina adesiva e lave a microplaca com a SOLUÇÃO DE LAVAGEM DILUÍDA seguindo um dos dois métodos recomendados: A. Lavagem automática ou semi-automática da microplaca: Lave seis (6) vezes com pelo menos 300 µl por pocinho por lavagem. B. Lavagem manual da microplaca: Aspire todo o conteúdo de todos os pocinhos abaixando a ponta do aspirador lentamente até o fundo de cada pocinho. TENHA CUIDADO DE NÃO RASPAR A SUPERFÍCIE INTERIOR DO POCINHO. Encha a placa completa com pelo menos 300 µl por pocinho e, depois, aspire imediatamente na mesma ordem. Repita este ciclo seis (6) vezes. 13. Inverta a microplaca e golpeia-a com firmeza sobre papel absorvente para secá-la. O papel absorvente deve eliminar qualquer resto do tampão de lavagem que possa ter ficado na placa, já que este pode inibir o aparecimento de cor durante a incubação do substrato. 14. Encha um recipiente para reativos com o SOLUÇÃO SUBSTRATO-TMB. Por meio de uma pipeta multicanal, coloque 100 µl de SOLUÇÃO SUBSTRATO-TMB em cada pocinho. Cubra a placa com outra folha adesiva. 300 µl por pocinho por lavagem 300 µl por pocinho µl 15. Incube durante 30 2 minutos no escuro a 37 1 C. 30 minutos 16. Retire e elimine a folha adesiva. 17. Por meio de uma pipeta multicanal, dispense 50 µl de SOLUÇÃO DE BLOQUEIO em cada pocinho. Misture bem com pequenos golpes em todas as laterais da microplaca, garantindo que a placa seja mantida na horizontal na mesa de trabalho. 50 µl 18. Leia a absorbância de cada pocinho a 450 nm. Se se utiliza um instrumento com duplo filtro, o cumprimento de onda de referência deve ser de nm. NOTA: A absorbância deve ser lida antes de ter transcorrido uma hora desde a adição da SOLUÇÃO DE BLOQUEIO. Controle de qualidade 1. Certifique-se de que cada amostra e controlo são misturados correctamente com o CONJUGADO DE TRABALHO, pipetando acima e abaixo, pelo menos uma vez, depois da adição. 2. A mudança de cor do CONJUGADO DE TRABALHO indica que o soro ou plasma foi dispensado. 3. O BRANCO deve ser ensaiado em um unico pocinho e o CONTROLO NEGATIVO e o CONTROLO POSITIVO devem ser ensaiados em triplicado em cada placa com cada série de amostras. 4. Os valores de absorbância do branco devem ser 0, Os valores de absorbância do controle negativo devem ser 0,100 depois de subtrair o valor do branco.

8 6. Pelo menos dois dos três valores do controle positivo devem ter uma absorbância de 0,600 depois de subtrair os valores do branco. Qualquer valor fora desta margem não deverá ser utilizado para calcular a media do controle positivo (CPx). 7. Em caso o teste não será válido, consultar o GUIA DE PROBLEMAS. Resultados Cada microplaca deve ser considerada por separado ao calcular e interpretar os resultados do teste, independentemente do número de placas que tenha sido processado ao mesmo tempo. OS VALORES DA ABSORBÂNCIA MÉDIA DO BRANCO DEVEM SER SUBTRAÍDOS DE TODOS OS VALORES DE ABSORBÂNCIA DA PLACA ANTES DE INTERPRETAR OS RESULTADOS. A presença ou ausência de anticorpos específicos frente a HTLV-I/II determina-se relacionando a absorbância das amostras com o VALOR CUT-OFF (COV) da placa. O VALOR CUT-OFF é calculado somando-se 0,250 à absorbância média do Controle Negativo: VALOR CUT-OFF = 0,250 + CNx Cálculo de resultados 1. Cálculo da absorbância média do Controle Negativo (CNx). Exemplo: Nº do pocinho Absorbância B1 0,020 C1 0,021 D1 0,022 Total 0,063 Média 0,063 / 3 = 0,021 (CNx) Os valores individuais do controle negativo devem ser 0,100. Se um dos valores do Controle Negativo não cumpre o critério anterior, deve considerar-se anômalo e excluir-se. A média do Controle Negativo (CNx) deve ser calculada utilizando os valores individuais do Control Negativo. Todos os valores individuais do Controle Negativo deve cumprir o critério anterior; caso contrário, o teste não será válido e será preciso repeti-lo. 2. Cálculo da absorbância média do Controle Positivo (CPx). Exemplo: Nº do pocinho Absorbância E1 1,221 F1 1,144 G1 1,298 Total 3,663 Média 3,663 / 3 = 1,221 (CPx) Os valores individuais do Controle Positivo devem ser 0,600. Se um dos valores do Controle Positivo não cumprir os dois critérios anteriores, deve considerar-se anômalo e excluir-se. Nesse caso, a média do Controle Positivo (CPx) deve ser calculada novamente utilizando os valores individuais dos controles positivos restantes. Todos os valores individuais dos controles positivos restantes devem cumprir os critérios anteriores; caso contrário, o teste não será válido e será preciso repeti-lo. 3. Cálculo do VALOR CUT-OFF. VALOR CUT-OFF = 0,250 + CNx Exemplo: CNx = 0,021 VALOR CUT-OFF = 0, ,021 = 0,271

9 Interpretação dos resultados 1. As amostras com valores de absorbância menores que o VALOR CUT-OFF são consideradas não reativas. 2. As amostras com valores de absorbância maiores ou iguais ao VALOR CUT-OFF consideram-se inicialmente reativas de acordo com o critério do bioelisa HTLV-I+II 5.0 e deveriam ser analisadas novamente em duplicado antes de sua interpretação. 3. As amostras que forem reativas ao repetir a análise podem ser interpretadas como amostras com reatividade repetida para anticorpos frente a HTLV-I/II. 4. As amostras que são inicialmente reativas e não reativas ao repetir a análise são consideradas negativas. 5. As amostras com reatividade repetida no teste bioelisa HTLV-I+II 5.0 devem ser analisadas com métodos adicionais mais específicos. Características funcionais Sensibilidade Foram estudadas 515 amostras positivas para o HTLV-I/II, 40 indeterminadas para o HTLV e 11 positivas para o HTLV-3/STLV-3 em três centros, sendo um no próprio centro e dois em França. Os resultados, resumidos na tabela 1 mostraram uma taxa de detecção de 100% para 515 amostras positivas para o HTLV-I/II confirmadas, e de cerca de 72,7% (8/11) para amostras positivas para o HTLV-3/STLV-3 (equivalente em símios do HTLV-3). Tabela 1: Índice de detecção de anticorpos contra o HTLV-I e o HTLV-II em vários grupos de amostras de HTLV. Tipo de amostra Nº de amostras bioelisa HTLV-I+II 5.0 Reativas Negativas Confirmado positivo para anticorpos contra HTLV-I/II a HTLV-I HTLV-II HTLV-I/II co-infecção HTLV soropositivas HTLV indeterminadas HTLV-3/STLV-3 b c ND a b c Todas as amostras positivas para HTLV-I/II foram confirmadas com um ELISA alternativo, e a maioria das amostras foram também confirmadas com HTLV Blot 2.4 e/ou PCR. As 11 amostras são positivas por PCR. Seis das amostras provêm de macacos (STLV-3). As outras 5 amostras correspondem a extracções em série de 2 indivíduos infectados por HTLV-3: Lobak18 (perfil inclassificável em HTLV Blot 2.4) e Pyl43 (analisado como indeterminado com MPD HTLV Blot 2.4). Estas 3 amostras são negativos limite provenientes de Pyl43, cuja carga proviral de HTLV-3 é muito baixa, segundo o determinado por PCR. Especificidade Analisou-se um total de amostras, que incluíam doadores de sangue aleatórios (n=5.001), amostras clínicas (n=205) e amostras que podiam interferir potencialmente (n=100) no estudo. Os resultados, resumidos na tabela 2, mostraram uma especificidade diagnóstica de 99,82% (4.990/4.999) para os doadores de sangue aleatórios, e de 100% para as amostras clínicas e as amostras com capacidade de interferência.

10 Tabela 2: Especificidade diagnóstica do bioelisa HTLV-I+II 5.0 em vários grupos de amostras. Grupo de Amostras Nº de Amostras bioelisa HTLV-I+II 5.0 NÃO reativas Repetidamente reativas Confirmado Falso Positivo a Doador de sangue (0,18%) Paciente internado Gravidez clínica HCV HIV H. pylori Fator reumatóide Total (0,18%) a Todas as amostras repetidamente reactivas foram confirmadas posteriormente com MPD HTLV Blot 2.4 para determinar as amostras positivas ou indeterminadas. Reprodutibilidade A reprodutibilidade inter-lote e intra-lote de bioelisa HTLV-I+II 5.0 foi avaliada internamente com os controles do kit, uma amostra positiva para o HTLV-I, e uma amostra positiva para o HTLV-I/II. Inter-lote: Intra-lote: Precisão Total: Foram analisados três lotes de componentes para ELISA incluindo 30 replicados por calibrador de soro em 3 ocasiões. O coeficiente de variação (CV) para os 3 calibradores em séries diferentes mostrou uma variação que oscilou entre 6,5% e 13,6% (Tabela 3). Foi registado um total de 90 observações para avaliar a precisão entre as séries. Estas observações representam 3 séries para as quais são utilizados 3 lotes de componentes para ELISA com cada calibrador de soro. O coeficiente de variação para os 3 calibradores mostrou uma variação entre 8,2% e 15,7% (Tabela 3). Foram analisados três lotes de componentes para ELISA incluindo 4 replicados por calibrador de soro em cada ocasião. Isto foi repetido 36 vezes durante um período de tempo de 40 dias por 4 operadores. A precisão geral foi avaliada com 430 valores de dados normalizados (OD/COV) obtidos com 3 calibradores de soro. O coeficiente de variação é de 15,9%. Tabela 3: Reprodutibilidade teste bioelisa HTLV-I+II 5.0. Amostra Controle Positivo HTLV-I Positivo HTLV-II Positivo Nº de teste Nº de replicados Média DO/COV Precisão intra-lote (CV %) # ,5 # ,0 # ,0 # ,5 # ,9 # ,7 # ,1 # ,6 # ,1 Precisão inter-lote (CV %) 9,5 8,2 15,7

11 Limitações do procedimento Um resultado de reatividade repetida com o teste bioelisa HTLV-I+II 5.0 indica presunção de anticorpos frente a HTLV-I/II na amostra. Um resultado NÃO REATIVO indica a provável ausência de anticorpos frente a HTLV-I/II detectáveis na amostra. Entretanto, não existem dados suficientes para descartar a transmissão de HTLV-I/II em amostras de sangue onde se determinou a não reatividade com o teste bioelisa HTLV-I+II 5.0. Portanto, um resultado NEGATIVO não descarta a possibilidade de exposição a HTLV-I/II nem de infecção por estes vírus. Em um kit de teste deste tipo pode-se suspeitar de resultados falsamente reativos. A proporção de falsos reativos depende da sensibilidade e da especificidade do kit de teste. Na maioria dos testes de triagem, quanto maior for a prevalência de anticorpos frente a HTLV-I/II em uma população, menor será a proporção de amostras falsamente reativas. Cláusula de isenção de responsabilidade A única garantia expressa conferida pelo fabricante é que o kit de análise funcionará como teste diagnóstico in vitro, de acordo com as especificações e limitações descritas no Manual de Instruções do produto, quando se usar de acordo com as instruções citadas no mesmo. O fabricante exime-se de qualquer garantia, expressa ou implícita, incluída a garantia expressa ou implícita relativa à comercialização, adequação para o uso ou suposta utilidade para outros fins. O fabricante só se responsabiliza pela troca do produto ou reembolso do preço de compra do mesmo. O fabricante não será responsável perante o comprador ou terceiros por quaisquer danos, prejuízos ou perdas econômicas decorrentes da utilização ou aplicação do produto. Problemas técnicos Em caso de problemas técnicos ou se desejar apresentar uma reclamação, proceda da seguinte maneira: 1. Anote o número de lote do kit e sua data de validade. 2. Conserve os kits e os resultados obtidos. 3. Entre em contato com seu distribuidor local.

12 bioelisa: Guia de problemas Problema Possíveis causas Solução 1. Controles fora de validação. 2. Sem cor ou pouca cor ao final do ensaio. 1a. Temperatura, incubação ou pipetagem incorreta. 1b. Preparação incorreta de reativos, erro de diluição. Reativos não homogeneizados. 1c. Contaminação cruzada entre controles. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio. Pipetar cuidadosamente. Não intercambiar as tampas dos frascos. Repetir o ensaio. 1d. Filtro de leitura incorreto. Comprovar que o filtro de leitura seja de 450 nm. Se não se usa filtro de referência de nm, as absorbâncias aumentam aproximadamente 50 miliunidades. 1e. Interferência no caminho ótico. 1f. Foram utilizados componentes de lotes diferentes. Verificar o leitor. Limpar ou secar o fundo dos pocinhos. Comprovar que não haja bolhas de ar. Repetir a leitura. Não utilizar componentes de lotes diferentes já que os mesmos são ajustados para cada lote. 1g. Reativos vencidos. Verificar a data de validade do kit e de seus componentes. Não utilizar kits ou reativos vencidos. 2a. Um ou mais reativos não adicionados ou adicionados em seqüência incorreta. 2b. Conjugado inativo: diluição incorreta, conservação incorreta. 2c. Microplaca inativa: conservação incorreta. 2d. Substrato inativo: conservação incorreta, o recipiente utilizado afeta a estabilidade do substrato, contaminação cruzada com a solução de bloqueio. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio. Verificar se há contaminação, verificar o procedimento. Repetir o ensaio. Manter sempre as tiras não utilizadas na bolsa de plástico, bem fechada, com o dessecante dentro. Repetir o ensaio. Utilizar recipientes descartáveis ou lavados com ácido ou etanol e enxaguados com água deionizada. Verificar o procedimento. Repetir o ensaio.

13 bioelisa: Guia de problemas Problema Possíveis causas Solução 3. Demasiada cor em todos os pocinhos da microplaca. 4. Reprodutibilidade pobre ou elevado número de amostras reativas que não se repetem. 3a. Substrato contaminado ou oxidado. 3b. Reativos contaminados ou preparados incorretamente. 3c. Solução de lavagem (1x) contaminada. 3d. Lavagem insuficiente ou não uniforme: volume dispensado ou aspiração insuficiente ou não uniforme, número de ciclos de lavagem insuficiente. Lavador contaminado. 3e. Foi utilizada solução de lavagem de outro fabricante. Comprovar que o substrato preparado seja incolor, descarte-o caso se torne azul. Utilizar recipientes descartáveis ou lavados com ácido ou etanol. Repetir o ensaio. Verificar se há contaminação (aspecto turvo). Comprovar as diluições. Repetir o ensaio. Verificar a qualidade da água destilada/deionizada utilizada para preparar a diluição. Repetir o ensaio. Verificar o lavador. Encher totalmente e aspirar completamente os pocinhos. Aumentar o número de ciclos de lavagem e o tempo de molho. Bater a placa invertida sobre papel absorvente. Repetir o ensaio. Utilizar somente a solução de lavagem de biokit. 4a. Problemas de lavagem. Ver itens 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetas mal calibradas ou ponteiras mal encaixadas. Técnica de pipetagem incorreta. 4c. Reativos e/ou amostras muito frios ou não homogeneizados antes de usar. 4d. Correntes de ar sobre a microplaca durante as incubações. 4e. Demasiada demora na adição de amostras e/ou reativos. Inconsistência nos intervalos de tempo. Bolhas de ar. 4f. Interferência no caminho ótico. Utilizar pipetas calibradas, com ponteiras bem encaixadas. Pipetar cuidadosamente sem fazer bolhas nem salpicar. Repetir o ensaio. Deixar que os reativos e amostras alcancem a temperatura ambiente e misture-os bem antes de usar. Manter a microplaca protegida de correntes de ar. Desenvolver uma técnica uniforme e reprodutível. Ver 1e.