Instruções de Uso. Inmunofluor ANA HEp-2. Para a determinação qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos antinucleares (ANA), em soro humano.
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1 Instruções de Uso Inmunofluor ANA HEp-2 Para a determinação qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos antinucleares (ANA), em soro humano determinações USO DIAGNOSTICO IN VITRO Fundamentos do método O termo "anticorpos antinucleares descreve uma variedade de autoanticorpos que reagem com constituintes do núcleo celular, incluindo DNA, RNA, várias proteínas e proteínas ribonucleicas. Estes anticorpos são encontrados freqüentemente em pacientes com doenças reumáticas ou do tecido conectivo, principalmente no Lupus Eritematoso Sistêmico (LES). Virtualmente, todos os pacientes com LES são ANA positivos. Em 1982, um sub-comitê do "American College of Rheumatology revisou os critérios de classificação do LES devido à incorporação do ANA ao diagnóstico. Esta prova é um excelente teste de "screening" para LES (um resultado negativo, virtualmente descarta um LES), mas não é específica. Os pacientes com outras doenças do tecido conectivo, tais como artrite reumatóide, escleroderma e dermatomiosite são freqüentemente ANA positivos e são encontrados títulos baixos de ANA em portadores de outras doenças e na população normal. Os resultados positivos ANA podem ser detectados logo após queimaduras severas ou infecções virais; tem sido encontrado na população sadia, principalmente os de idade avançada. Por estes motivos e para aumentar a especificidade, recomenda-se que as amostras ANA positivas sejam tituladas até seu ponto final e que sejam confirmadas com testes mais específicos para anticorpos, como o anti-dna (para anticorpos anti- DNA de cadeia dupla) e o ENA (para antígenos nucleares extraíveis). A imunofluorescência indireta é o método de referência para ANA. Como substrato utilizam-se cortes de tecidos ou vários tipos de linhagens celulares. É um fato reconhecido que os substratos de linhagens celulares são mais adequados que os cortes de tecidos, porque as rápidas divisões celulares apontam antígenos de importância clínica, incluindo-se centrômero, SSA (Ro), Scl-70 e PCNA/Ciclin. Além do tipo de substrato, existem outros três fatores críticos na realização de uma determinação de ANA: 1) O fixador usado na preparação, 2) A relação fluoresceína proteína (F/P) e 3) As subclasses de imumoglobulina específica do conjugado. É sabido que alguns fixadores, ou combinações de destes, destroem determinados antígenos nucleares e seu uso deve ser evitado. A sensibilidade e as imagens de fundo, não específicas, dos conjugados se determinam pela relação F/P, tanto que a especificidade do conjugado é determinada pela reatividade das subclasses de imunoglobulinas. Virtualmente, os autoanticorpos clinicamente significativos apresentam sub-classes de lgg específicos, niveladas com a presença de lgm e IgA ANA específicas; pelo contrário, em alguns doadores de sangue sadios são encontrados anticorpos ANA, unicamente em subclasses de lgm e IgA. Por este motivo, os conjugados específicos para lgg são mais adequados para o diagnóstico. O substrato usado no teste Imunofluor ANA HEP-2 é uma linhagem celular e o conjugado é uma lgg anti-humana, altamente purificada com uma relação F/P cuidadosamente selecionada. Os reagentes deste teste estão ajustados para detectar anticorpos clinicamente relevantes incluindo-se SSA e Scl-70, os quais podem não ser detectado por outros testes comerciais para ANA. Além disso, o conjugado lgg específico elimina resultados falso positivos fisiológicos que normalmente ocorrem devido a títulos baixos de lgm específica. Resumo e explicação do teste Na técnica de imunofluorescência indireta, as amostras são incubadas com o substrato antigênico e a seguir, lavam-se os anticorpos que não reagiram. A seguir, o substrato é incubada com a antigamaglobulina específica marcada com fluoresceína, e a seguir, procede-se à lavagem do reagente não úmido. A leitura é realizada com microscópios de fluorescência. As amostras positivas para anticorpos irão apresentar uma fluorescência verde-maçã nas áreas das células ou núcleos que os unem aos anticorpos. Procedimento 1. Preparação do tampão Colocar o conteúdo de um frasco em um recipiente de 1 litro, dissolver em água destilada e elevar a volume até 1 litro. Obtém-se uma solução 0,01 M com ph 7,2 ± 0,2. Se necessário, ajustar com NaOH 1N ou HCl 1N. Conservar em geladeira (2-8ºC), em um recipiente limpo e tampado. Descartar no caso de alteração de ph, turbidez da solução ou formação de precipitados. 2) Diluição das amostras 1
2 A) "Screening" inicial: Diluir a 1/40 as amostras dos pacientes, com tampão PBS (Por exemplo, adicionar 20 µl de soro a 0,78 ml de tampão (PBS)). NOTA: Em meninos menores de 10 anos sugere-se uma diluição de "screening" inicial de 1/20. B) Titulação: Diluir todas as amostras positivas com PBS, preparando diluições seriadas a partir da diluição inicial (Por exemplo, 1/80,1/160,...,1/2560). 3) Semeadura das amostras Deixar as lâminas à temperatura ambiente, antes de retirar de sua embalagem. Identificar e colocar em uma câmara úmida adequada e adicionar uma gota de controle positivo e controle negativo nos locais 1 e 2, respectivamente. Adicionar uma gota (50-75 µl) de soro desconhecido diluído 1/40 nos locais remanescentes (um local por paciente). Incubar as lâminas durante 30 minutos, em câmara úmida (recipiente de plástico ou vidro, de fundo plano, com um papel de filtro molhado, para manter as condições de umidade adequadas). NOTA: As incubações de amostra e conjugado podem reduzir-se até 10 minutos cada uma (principalmente durante o ""screening" inicial), sem perda da sensibilidade. IMPORTANTE: Não permitir a dessecação das áreas reagentes durante as etapas seguintes. 4) Lavagem Após a incubação com a diluição de soro, deve-se lavar com PBS, empregando um frasco conta-gotas plástico ou uma pipeta. Inclinar as lâminas e dirigir às mesmas uma corrente de PBS, minimizando o contato das amostras entre os poços. Não dirigir diretamente a corrente sobre os locais reagentes, prevenindo-se danos ao substrato. Colocar as lâminas em uma jarra de Coplin ou similar e lavar 2 a 3 vezes com tampão (5 minutos cada vez), agitando suavemente durante cada lavagem. 5) Aplicação do conjugado Diluir a antigamaglobulina marcada fornecida no kit reagente (diluição sugerida: adicionar 10 µl de Azul de Evans por cada ml de diluição da gamaglobulina preparada). Retirar as lâminas da lavagem uma de cada vez, bater delicadamente sobre papel absorvente para retirar o excesso de PBS e secar ao redor das áreas reagentes (se for necessário). Recolocar cada lâmina na câmara úmida. Aplicar imediatamente uma gota (50-75 µl) de conjugado em cada área tomando cuidado para que cada zona fique totalmente coberta. Incubar 30 minutos em câmara úmida e à temperatura ambiente. Proteger do excesso de luz. 6) Lavagem Repetir a etapa 5. 7) Montar Retirar as lâminas da lavagem uma de cada vez, bater delicadamente para retirar o excesso de PBS sobre papel absorvente e agregar de 3 a 4 gotas do meio de montagem às lâminas. Apoiar suavemente a lâmina sobre as lâminas evitando a formação de bolhas. Secar o excesso de meio de montagem dos bordos da preparação, usando papel absorvente. Limpar o verso das lâminas. 8) Leitura Ler as lâminas em um microscópio de fluorescência, o mais pronto possível. É conveniente examinar o mesmo dia de seu procedimento. Se não for possível, conservar em geladeira (2-8ºC), ao abrigo de a luz e ler no dia seguinte. O meio de montagem entre a lâmina e lamínula não deve secar. Se isto ocorrer, adicionar meio de montagem adicional. Composição do kit reagente Para 36 determinações 1. 3 lâminas com 12 áreas reagentes de células HEp Antigamaglobulina lgg marcada com isotiocianato de fluoresceína (0,15 ml). 3. Soro humano Controle Positivo (1,0 ml). Pronto para uso. 4. Soro humano Controle Negativo (1,0 ml). Pronto para uso. 5. Tampão fosfato-salina (PBS) - 2 frascos. Cada frasco deve ser dissolvido em 1 litro de água destilada. 6. Meio de montagem (5,0 ml) 7. Azul de Evans (5,0 ml). Pronto para uso. 8. Lâmínulas 9. Instruções para seu uso. Para 60 determinações 1. 5 lâminas com 12 áreas reagentes de células HEp Antigamaglobulina lgg marcada com isotiocianato de fluoresceína (0,20 ml). 3. Soro humano controle Positivo (1,0 ml). Pronto para uso. 4. Soro humano controle Negativo (1,0 ml). Pronto para uso. 5. Tampão Fosfato-salina (PBS): 3 frascos. Cada frasco deve ser dissolvido em 1 litro de água destilada. 6. Meio de montagem (5,0 ml). Pronto para uso. 7. Azul de Evans (5,0 ml) 8. Lamínulas 9. Instruções para seu uso. 2
3 Instabilidade das substâncias reconstituídas O tampão fosfato salino reconstituído é estável até 15 dias, se conservado entre 2-8 C. Para períodos mais prolongados de armazenamento, adicionar 0,1% de azida sódica para evitar sua contaminação. Material requerido (não fornecido) 1. Pipetas de Pasteur 2. Frasco conta-gotas 3. Óleo de imersão não fluorescente (opcional) 4. Pipetas de precisão 5. Uma cubeta para lavagem das lâminas. 6. Microscópio de fluorescência com sistema de filtros para FITC (comprimento de onda de excitação máxima de 490 mm, comprimento de onda de emissão média 530 mm, aumentos) Precauções e advertências sobre seu uso 1. Utiliza-se azida sódica à 0,1% como conservante. Ao se descartar os reagentes, enxaguar com grandes volumes de água, para evitar o acúmulo destas azida nos encanamentos. A azida sódica é um veneno e pode ser tóxica se for ingerida. 2. Todos os materiais humanos usados na preparação dos controles deste produto foram testados e apresentaram resultado negativo para anticorpos anti-hiv e antígeno de superfície do vírus da Hepatite B (HBs Ag), pois, como nenhum método diagnóstico oferece uma completa segurança a respeito da ausência destes e outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar os controles humanos como materiais potencialmente infecciosos. 3. A substituição dos componentes por outros não previstos neste sistema, pode causar resultados inconsistentes. 4. As áreas reagentes devem ser mantidas úmidas durante toda a técnica (evitar qualquer técnica de secagem artificial como: secagem ao ar, em estufa e/ou secadores). Após as etapas de lavagem, recomenda-se remover o excesso de umidade com papel absorvente apenas nos bordos laterais externos das lâminas, sem necessidade de secagem entre áreas. Cobrir generosamente logo a seguir com a diluição conveniente de antigamaglobulina e/ou com o meio de montagem, de acordo com a etapa correspondente. Limitações do procedimento 1) Um alto título de DNA sugere uma doença do tecido conectivo, pois os resultados não devem ser considerados com um diagnóstico. Os resultados de DNA devem ser considerados em combinação com outros resultados sorológicos e com o histórico clínico do paciente. 2) As patentes de DNA podem mudar se a amostra for titulada até seu ponto final. Este fenômeno é causado por baixos títulos de anticorpos, os quais alcançam a sensibilidade do sistema, ao testar amostras mais diluídas. 3) A sensibilidade do teste pode ser influenciada por uma variedade de fatores externos, incluindo o tipo de microscópio usado, intensidade da lâmpada e seu tempo de uso, sistema de lentes, sistema de filtros e o técnico. Instruções para sua conservação Conservar em geladeira 2-8 C. Os componentes deste kit reagente mantêm-se estáveis até a data de validade indicada nos seus rótulos externos e internos. A exposição dos reagentes a luz e/ou o seu congelamento podem produzir sua deterioração. Amostra a serem empregadas Tratar todas as amostras de sangue, plasma e soro como se fossem capazes de transmitir doenças infecciosas. Extrair assepticamente, 5-8 ml de sangue venoso. Deixar que o sangue alcance a temperatura ambiente até a separação do soro, para evitar a hemólise, a qual interfere nos resultados do teste. Coletar o sangue após um jejum de 8 horas. Esta prova só pode ser realizada com soro. Não processar amostras com contaminação bacteriana, hemolisadas ou lipêmicas. Os soros podem ser conservados em geladeira (2-8 C) até 72 horas. Se for necessária uma conservação por um espaço de tempo maior, armazenar em freezer a -20 C. Evitar os ciclos de congelamento e descongelamento repetidos. Interpretação dos resultados Reação negativa Uma amostra é considerada negativa se a imagem nuclear específica for menor ou igual ao do controle negativo. As amostras podem apresentar graus diferentes de fluorescência inespecífica devido aos anticorpos heterófilos ou a níveis baixos de autoanticorpos constituintes do citoplasma, tais como as proteínas contráteis. Reação positiva Uma amostra é considerada positiva se a imagem nuclear específica observada for maior que a do controle negativo. Interpretação de patentes De acordo com os tipos e das quantidades relativas de autoanticorpos presentes na amostra, podem ser encontrados vários modelos de imagens nucleares e citoplasmáticas, de acordo com o abaixo especificado: Modelo homogêneo: observa-se uma imagem de coloração nuclear sólida com ou sem mascaramento aparente do nucléolo. Antígenos nucleares: ds DNA, ss DNA, histonas. Doenças associadas: Títulos elevados sugerem LES; os títulos baixos sugerem LES ou outras doenças do tecido conectivo. Modelo periférico: observa-se uma imagem de coloração sólida, ao redor da membrana nuclear com coloração fraca do centro do núcleo. 3
4 Antígenos nucleares: ds DNA, ss DNA, DNP, histonas. Doenças associadas: títulos elevados sugerem LES; os títulos baixos sugerem LES ou outras doenças do tecido conectivo. Modelo salpicado: observa-se uma imagem de coloração fina ou granulosa nos núcleos, geralmente sem fluorescência no nucléolo. Antígenos nucleares: Sm, RNP, Scl-70, SSA, SSB e outros sistemas antígeno-anticorpo, mesmo não caracterizados. Doenças associadas: títulos elevados sugerem LES (anticorpo Sm), doença mista do tecido conectivo (anticorpo RNP), escleroderma (anticorpo Scl-70), ou síndrome de Sjögren (anticorpo SSB) e títulos baixos podem sugerir outras doenças do tecido conectivo. Modelo nucleolar: observa-se uma imagem de coloração ampla e espessa das granulações internas dos núcleos, em geral menos que 6 por célula com ou sem granulações ocasionais finas. Antígenos nucleares: RNA 4-6S e outros antígenos nucleares desconhecidos. Doenças associadas: os altos títulos prevalecem em escleroderma e na síndrome de Sjögren. Modelo centromérico: observa-se uma imagem de coloração ligeiramente granular. Estas granulações são muito discretas e geralmente apresenta-se em um número múltiplo de 46. Antígenos nucleares: centrômero cromossômico (kinetochore). Doença associada: altamente sugestivo de CREST, síndrome variante da esclerose sistêmica progressiva (PSS). O CREST é uma forma de PSS com calcinose proeminente, assim como o fenômeno de Raynaud, ausência de motilidade esofágica e lesões limitadas na pele (freqüentemente confinadas a dedos ou rosto), telangestasia. Modelo mitocondrial: observa-se uma imagem de coloração discreta de granulação no citoplasma, com relativa carência na área nuclear. Antígenos: vários tipos de antígenos mitocondriais. Doença associada: títulos elevados indicam cirrose biliar primaria. É importante ter precaução ao usar os modelos para determinar os autoanticorpos específicos, exceto para as imagens nucleolar e centromérica onde os antígenos estão muito bem definido, e a patente é característica, considerando que muitos autoanticorpos ou combinações dos mesmos podem induzir imagens homogêneas ou salpicadas; nestes casos recomenda-se realizar testes específicos para os autoanticorpos (tais como a-dna e ENA). Características de desempenho do teste Foram estudados com este kit reagente uns grupos de pacientes com doenças do tecido conectivo e 200 doadores de sangue normais. Foram obtidos os seguintes resultados: Grupo de pacientes Nº Nº de pacientes positivos com Inmumofluor ANA Hep2 LES Lupus induzido por drogas Artrite reumatóide Escleroderma Dermatomiosite Síndrome de Sjogren Normais A. Sensibilidade Foi realizado um estudo com soros de pacientes com doenças do tecido conectivo e 200 doadores de sangue normais para a avaliação da sensibilidade, especificidade e exatidão relativa contra um outro kit disponível comercialmente. Os resultados obtidos foram os seguintes: N de Positivos Grupo de Pacientes N de Biocientífica Outro soros LES Lupus induzido por drogas Artrite Reumatóide Esclerodermia Dermatomiositis Síndrome de Sjögren Normais Sensibilidade relativa 100% Especificidade relativa 98% Exatidão relativa 100 % Os dados duvidosos não foram levados em conta no cálculo. B. Precisão Foram testadas 4 lâminas do mesmo lote e uma lâmina de quatro lotes diferentes com uma amostra controle conhecida que foi diluída até o fim. Todas as oito lâminas deram um título final de 1/ O que demonstra que não existe diferença significativa na performance entre lâminas do mesmo lote ou de lotes diferentes. 4
5 C. Especificidade Foram testados 80 soros positivos para ANA (vários padrões) no kit de Hep-2 da Biocientífica e em um kit equivalente comercialmente disponível 48 amostras obtiveram o mesmo padrão em ambos os kits, com a mesma intensidade de marcação. As duas amostras restantes foram negativas em ambos os kits. ESTABILIDADE Foram realizados estudos de estabilidade com envelhecimento acelerado dos reagentes e sob condições normais. Os resultados apresentados foram satisfatórios. Bibliografia 1) Tan E: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their inmumobiology and medicine. Advances in Inmumology 33: , ) Tan E, et al: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus, Arthritis and Rheumatism 25: , ) Casalo SP, Friou GJ, Meyers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , ) Gonzalez E, Rothfield N: Inmumoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England J. of Medicine 274: , ) Wilk A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiol Scand. 84: , ) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/ National Institute of Health, 1984 (HHS Pub. # (CDC) ). Fabricado por: Biocientifica S.A. Iturri 232/4 - Caixa Postal C1427ADD Buenos Aires - ARGENTINA "SOMENTE PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO" POTENCIALMENTE INFECTANTE Conservar entre +2 e +8ºC. Para maiores informações, vide Instruções de Uso. Reg. ANVISA N : Revisão Setembro/2004 5
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