NOVA Gel TM Sm/RNP T Para Diagnóstico In Vitro
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- Vasco Santiago Estrela
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1 NOVA Gel TM Sm/RNP T Para Diagnóstico In Vitro Aplicação Diagnóstica NOVA Gel TM Sm/RNP é um sistema de teste de dupla difusão para a titulagem e a determinação semiquantitativa de auto-anticorpos para Sm/RNP, um antigénio nuclear extraível (ENA), no soro humano. A presença de anticorpos para Sm/RNP pode ser usada em conjunto com outros testes serológicos e descobertas clínicas para ajudar no diagnóstico de Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE) e de outras doenças do tecido conjuntivo. Resumo e Explicação do teste O termo "Anticorpos antinucleares" (ANA) descreve uma diversidade de auto-anticorpos que reagem com constituintes do núcleo de células, incluindo DNA, RNA e várias proteínas e ribonucleoproteínas. 1 Estes auto-anticorpos ocorrem com elevada frequência em doentes com doenças do tecido conjuntivo ou reumáticas, especialmente SLE. Virtualmente todos os doentes de SLE são ANA positivos. Esta sensibilidade do diagnóstico conduziu à incorporação dos testes de ANA nos Critérios Revistos de 1982 para a Classificação do Lúpus Eritematoso Sistémico por uma subcomissão da Associação de Artrite e Reumatismo. 2 Enquanto o teste ANA é um teste de rastreio excelente para SLE (um resultado negativo exclui virtualmente o SLE activo 3 ) não é de modo algum um teste específico. A tendência actual para diagnosticar e gerir doenças do tecido conjuntivo é combinar um teste de rastreio sensível de ANA com testes de seguimento mais específicos tais como dsdna e/ou ENA. Os testes de ENA são especialmente importantes visto que eles fornecem tanto informações de diagnóstico como de prognóstico. Os auto-anticorpos para o antigénio Sm são altamente específicos para SLE e, tal como os anticorpos para dsdna, são considerados um anticorpo marcador. Os anticorpos para Sm foram incluídos nos critérios da subcomissão de Artrite e Reumatismo para a classificação de SLE. 2 Os auto-anticorpos para RNP são encontrados em doentes com SLE e também em algumas outras doenças do tecido conjuntivo. 1,2,4 Os autoanticorpos para RNP estão associados com o desenvolvimento de uma doença relativamente benigna, com menor incidência de doença renal, enquanto que os pacientes com anticorpos Sm possuem uma maior incidência de doença renal e de envolvimento do sistema nervoso central. 5-7 Princípio do Procedimento O teste de dupla difusão, descrito por Ouchterlony, 8 permite que uma solução de antigénio se difunda passivamente através de uma matriz de suporte de gel em direcção a uma amostra e/ou controlo contendo anticorpo. Os poços, com forma especial, fixados na matriz de gel, funcionam como reservatórios a partir dos quais as soluções de antigénio e de anticorpo difundem em direcção uma da outra. No ponto de equivalência antigénio-anticorpo, forma-se no gel uma linha visível de precipitação. O estado imunológico de um doente pode então ser determinado através da observação de padrões de linhas de precipitação adjacentes formadas no gel por uma amostra controlo, de especificidade conhecida, e por um soro desconhecido de um doente. A técnica de dupla difusão pode ser usada com uma preparação purificada de Sm/RNP, uma amostra controlo de auto-anticorpos Sm ou RNP conhecida e um soro de um doente suspeito de conter autoanticorpos Sm e/ou RNP para mostrar identidade imunológica, não identidade ou identidade parcial. A confirmação de actividade de auto-anticorpos Sm e/ou RNP no soro do doente pode ser feita se a sua linha de precipitação combinar caracteristicamente com a linha formada por uma amostra controlo conhecida. Em certos casos, uma determinação semi-quantitativa da quantidade de auto-anticorpos de Sm e/ou RNP num soro do doente é desejada. Nestes casos, a placa NOVA Gel T pode ser utilizada para ensaiar uma amostra do doente diluída em série. O recíproco da diluição mais elevada que forma uma linha de precipitação pode então ser relatada como o título do auto-anticorpo de Sm e/ou RNP para o doente. O procedimento de teste de dupla difusão correcta requer o ensaio de razões de concentração de antigénios - anticorpos múltiplos de forma a impedir o excesso de antigéniso ou de anticorpos. A formação de linha de 1
2 precipitação incorrecta ou ilusória pode ocorrer devido ao excesso de antigénio ou de anticorpo. Para impedir isto, as diluições do soro do doente deverão ser ensaiadas em comparação com a mesma preparação de antigénio. Isto é conseguido simultaneamente enquanto faz a titulagem da amostra do doente na placa de NOVA Gel T. Composição do Dispositivo 1. Placas de gel de rastreio Nova Gel T com 7 poços cada, contendo estabilizadores e 0,09% de azida de sódio 2. 0,4 ml de antigénio Sm/RNP (de timo de vitelo), liofilizado em tampão, contendo estabilizadores e 0,09% de azida de sódio 3. 0,7 ml de controlo Sm, soro humano contendo auto-anticorpos para Sm em tampão contendo 0,09% de azida de sódio 4. 0,7 ml de controlo RNP, soro humano contendo auto-anticorpos para RNP em tampão contendo 0,09% de azida de sódio Advertências 1. Todo o material de origem humana usado na preparação de controlos para este produto foi testado e considerado negativo para anticorpos anti HIV, HBsAg, e HCV pelos métodos aprovados pela FDA. No entanto, nenhum teste pode garantir segurança total em relação à ausência de HIV, HBV, HCV ou de outros agentes infecciosos. Assim, o Controlo Sm e o Controlo RNP deverão ser manuseados como material potencialmente infeccioso A Azida de Sódio é usada como um conservante. A Azida de Sódio é um veneno e pode ser tóxica se for ingerida ou absorvida através da pele ou dos olhos. A azida de sódio pode reagir com chumbo ou com canalizações de chumbo para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Lave as bacias, se forem usadas para despejar reagentes, com grandes volumes de água para impedir a formação de azida. 3. Use equipamento de protecção pessoal apropriado enquanto trabalhar com os reagentes fornecidos. 4. Os reagentes derramados deverão ser limpos imediatamente. Cumpra todos os regulamentos ambientais federais, estatais e locais quando descartar detritos. Precauções 1. Este produto é para Uso de Diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo, por componentes diferentes dos fornecidos neste sistema pode conduzir a resultados inconsistentes. 3. É recomendado que água estéril destilada ou desionizada seja usada para re-hidratar o antigénio. 4. Uma variedade de factores influencia o desempenho do ensaio. Estes incluem a temperatura de início dos reagentes, prevenir o enchimento excessivo dos poços com reagentes ou amostras dos doentes e a qualidade da água usada para re-hidratar o antigénio. Deverá ser prestada uma atenção cuidadosa à consistência para obter resultados precisos e reprodutíveis. 5. É recomendado um cumprimento rigoroso do protocolo. Condições de Armazenamento Armazene todos os reagentes a 2-8 C. Não congele. Os reagentes ficam estáveis até à data de validade quando armazenados e manuseados conforme indicado. Após re-hidratado, o antigénio é estável durante 2 semanas a 2-8 C. Se for desejado, alíquotas de 100 μl de antigénio podem ser preparadas e armazenadas a < -70 o C. O antigénio armazenado nesta forma é estável durante pelo menos 1 ano. Colheita de Amostras Este procedimento deverá ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras podem afectar negativamente os resultados. Amostras com contaminação microbiana, tratadas termicamente ou contendo partículas visíveis não deverão ser usadas. As amostras de soro com hemólise macroscópica ou altamente lipémica deverão ser evitadas. 2
3 Após colheita, o soro deverá ser separado do coágulo. O Documento H18-A2 da NCCLS recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Armazene as amostras à temperatura ambiente durante um período não superior a 8 horas. 2) Se o ensaio não estiver concluido dentro de 8 horas, guarde a amostra a 2-8 C. 3) Se o ensaio não for efectuado em 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congele a -20 C ou a temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem misturadas após descongelação e antes do teste. Procedimento Material fornecido 8 placas de rastreio NOVA Gel "T" 2 0,4 ml de antigénio Sm/RNP, liofilizado 1 0,7 ml de controlo Sm 1 0,7 ml de controlo RNP Material Necessário Não Fornecido Micropipetas de μl de volume Pontas descartáveis para micropipetas Solução salina 0,85% Água destilada ou desionizada (preferencialmente estéril) Fonte de luz ou caixa de visualização de gel Método Antes de começar 1. Re-hidratar o Antigénio Sm/RNP Abra cuidadosamente um frasco de antigénio e adicione 0,4 ml de água destilada ou desionizada para o antigénio liofilizado. A água estéril destilada ou desionizada é recomendada para um desempenho óptimo do produto. Deixe que o antigénio re-hidratado descanse durante 5 minutos, depois agite para misturar completamente antes de usar. 2. Encher a Placa de Gel. Prepare uma dupla diluição em série da amostra do doente em 0,85% de salina. Carregue os poços da placa de gel com antigénio (aproximadamente 80μL), com controlo (aproximadamente 80μL), e com diluições de amostra do doente (aproximadamente 80μL) conforme mostrado. As quantidades exactas de enchimento não são críticas; no entanto, NÃO ENCHA EXCESSIVAMENTE OS POÇOS. O controlo pode ser enchido directamente a partir dos frascos de pressão de plástico ou das micropipetas. Se usar os frascos de pressão, coloque uma ponta distribuidora no poço e aperte suavemente até o nível de controlo se aproximar do cimo do poço. Cubra a placa imediatamente após encher. 3. Incubação Deixe que a(s) placa(s) coberta(s) faça(m) incubação à temperatura ambiente numa superfície estável, plana durante 24 horas. Inspeccione a(s) placa(s) e anote quaisquer linhas de precipitação que se formem entre a amostra do doente e o antigénio. Examine a relação desta linha com qualquer linha de precipitação do controlo. Reinspeccione a(s) placa(s) novamente às 48 horas para verificar a existência de quaisquer linhas desenvolvidas recentemente antes da interpretação final dos resultados. 3
4 Controlo de Qualidade Os Controlos Sm e RNP deverão ser corridos em todas as placas para assegurar que todos os reagentes e procedimentos foram efectuados correctamente. Outros soros de controlo adequados adicionais podem ser preparados aliquotando amostras de soro humano combinado e armazenando a < -70 o C. De forma a que os resultados do teste sejam considerados válidos, uma linha de precipitação deve estar visível entre os Controlos Sm e RNP e os poços de antigénio de Sm/RNP. Interpretação de Resultados Para uma observação óptima das linhas de precipitação são recomendados os seguintes procedimentos: 1. Remova a tampa da placa. 2. Segure a placa numa posição que minimize o reflexo na superfície do gel. 3. Ilumine a placa do gel lateralmente (i.e. paralela à superfície do gel). Nota: Certifique-se de que a fonte de luz está protegida da vista directa. 4. As linhas de precipitação vêem-se melhor quando existe contraste com um fundo escuro e vistas de um ângulo. 5. Um amplificador pode ajudar na observação de linhas ténues ou para distinguir a não identidade de amostras. Reacção Negativa. Uma amostra é considerada negativa se não se formarem linhas de precipitação visíveis entre os poços do doente e o poço do antigénio após 48 horas. Interpretação de Especificidade. Na dupla difusão, a especificidade é determinada anotando a relação das linhas de precipitação da amostra com as linhas de controlo conhecidas. Podem ocorrer as seguintes possibilidades com o teste NOVA Gel TM Sm/RNP: Fig. 1: Não Identidade Fig. 2: Identidade Sm A linha de precipitacção do doente 1 atravessa ou apresenta não identidade com ambos os controlos Sm e RNP. Isto indica que o doente reage com um antigénio ENA diferente do Sm ou do RNP. A linha de precipitacção do doente 1 combina ou apresenta identidade com a linha de controlo Sm. Neste caso o doente tem autoanticorpos para Sm. O título da amostra é equivalente ao recíproco da diluição mais elevada que forma uma linha de precipitacção com o antigénio. Neste caso pode dizer-se que o doente tem um anticorpo para Sm e um título de 8. 4
5 Fig. 3: Identidade RNP Fig. 4: Identidade Sm e RNP A linha de precipitacção do doente une ou apresenta identidade com a linha de controlo RNP. Neste caso pode dizer-se que o doente tem um anticorpo para RNP e um título de 4. Note o esporão com o controlo Sm. Isto é não identidade para Sm. Apresenta uma identidade parcial com a porção RNP do controlo Sm. O doente tem duas linhas de precipitacção. Uma das linhas apresenta identidade com o Controlo Sm e a outra com o Controlo RNP. Este doente tem auto-anticorpos tanto para Sm como para RNP e um Sm título de 2 e um RNP título de 4. Limitações do Procedimento 1. Embora não seja provável com este teste devido à geometria única do poço, o prozoneamento é uma possibilidade. O prozoneamento ocorre quando uma enorme quantidade de auto-anticorpos do doente está presente em relação ao antigénio (excesso de anticorpo), fazendo com que a linha de precipitação se forme na face do poço de antigénio. Nestes casos, são recomendados novos testes de possíveis amostras positivas numa diluição de 1:2 ou de 1:4 em solução salina para impedir uma interpretação falsa negativa do teste. 2. Se for usada água não estéril ou contaminada para re-hidratar o antigénio, o antigénio pode sofrer degradação imediata ou progressiva. Neste caso pode resultar uma linha de precipitação muito leve ou nenhuma linha. 3. O Controlo Sm não é monoespecífico e pode conter algum RNP. O Controlo Sm apresentará identidade parcial com um doente RNP ou controlo RNP. 4. Pode ser possível observar um esporão que aponta na direcção do poço de controlo RNP com um soro que mostra identidade com o controlo Sm. Isto pode indicar a presença de anticorpos RNP no soro do doente anti-sm. 5. Os resultados deste ensaio deverão ser usados em conjunto com descobertas clínicas e outros testes serológicos. 6. As características de desempenho do ensaio não foram estabelecidas para matrizes diferentes das do soro. Valores Esperados O teste de dupla difusão NOVA Gel TM Sm/RNP foi usado para avaliar doentes com várias doenças do tecido conjuntivo bem como 200 dadores aleatórios de sangue. Os resultados são os seguintes: Grupo de Doente Número Número Positivo Teste NOVA Gel ENA Sm Positivo RNP Positivo SLE Lúpus Induzido por Medicamento Artrite Reumatóide Escleroderma Dermatomiosite Síndroma de Sjogren Normais
6 Referências 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan E, et al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Reichlin M, Maddison PJ. Soluble tissue autoantigens which precipitate with sera of patients with connective tissue diseases. In Immunopathology of the Skin, 2nd ed. (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds) John Wiley and Sons, NY, pp , Reichlin M, Mattioli M. Correlation of a precipitin reaction to an RNA protein antigen and a low prevalence of nephritis in patients with systemic lupus erythematosus. New England Journal of Medicine 286: , Barada FA, Andrews BS, Davis JS, Taylor RP. Antibodies to Sm in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 24: , Winn DM, Wolfe JF, Lindberg DA, Fristoe FH, Kingsland L, Sharp GC. Identification of a clinical subset of systemic lupus erythematosus by antibodies to the Sm antigen. Arthritis and Rheumatism 22: , Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999 Fourth Edition (HHS Pub. # (CDC) ). Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service December 2007 Revision PRT11 6
Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados.
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