NOVA Lite HEp-2 External EB Kits Para Diagnóstico In Vitro
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- Lucas Gabriel Martins Arruda
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1 NOVA Lite HEp-2 External EB Kits Para Diagnóstico In Vitro Código do Produto: , Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica Este produto (kit ou as lâminas com substrato) é utilizado para a pesquisa e quantificação dos auto anticorpos anti nucleares circulantes por intermédio de um teste de imunofluorescência. É utilizado como um suplemento para o diagnóstico e tratamento do Lúpus eritematoso sistémico (SLE), Sindroma de Sjögren, artrite reumatóide e outras desordens do tecido conjuntivo. Resumo e Explicação do teste Anticorpos anti-nucleares (ANA) é um termo que descreve vários auto anticorpos contra os componentes do núcleo das células incluindo o ADN, ARN e várias proteínas nucleares 1. Estes ANA encontram-se, com muita frequência, em doentes que sofram de disfunções reumáticas ou do tecido conjuntivo, em particular, em casos de SLE. Existe uma elevada correlação de positividade para ANA com SLE, e a negatividade para ANA significa a ausência da doença 2. No entanto, em casos de outras doenças do tecido conjuntivo tais como a artrite reumatóide, escleroderme e dermatomiosite são frequentemente positivos para ANA sendo os títulos mais baixos para ANA encontrados em outros estados patológicos. Resultados positivos para ANA podem também ser encontrados em pessoas idosas, ainda que saudáveis. Apesar da imunofluorescência indirecta ser o método preferencial para o despiste dos ANA circulantes, é aconselhável que as amostras positivas para ANA sejam totalmente quantificadas e posteriormente analisadas por testes mais específicos contra os auto anticorpos de cadeia dupla de ADN (dsdna) e os antigénios nucleares extraíveis (ENA). No passado, a demonstração preferencial para os ANA era feita através da utilização de um substrato de secções congeladas de fígado de ratazana que foram entretanto substituídas por vários tipos de linhas celulares. As células HEp-2 3 são linhas celulares epiteliais tendo como principal característica os seus grandes núcleos, comparativamente a outras linhas celulares. Quando utilizadas no despiste dos ANA, as vantagens das células HEp-2 são: em primeiro lugar, apresentam menor variabilidade entre lotes diferentes do que o tecido de roedores; em segundo lugar, as células HEp-2 permitem uma visualização mais facilitada da morfologia da célula com um consequente aumento na sensibilidade do teste em comparação com as secções de fígado de ratazana e finalmente, muitas células HEp-2 dividem-se activamente, expondo antigénios que normalmente não se exprimem em outras células das secções de fígado de ratazana 3. Princípio do Procedimento É utilizada uma técnica de imunofluorescência indirecta 4 quando as amostras dos doentes e os respectivos controlos são incubados com o substrato de HEp-2. Os anticorpos que não reagem são eliminados por lavagem sendo, de seguida, aplicado um conjugado marcado com fluoresceína. O conjugado não ligado é também eliminado por lavagem. As lâminas são visualizadas num microscópio de fluorescência, onde as amostras positivas desenvolvem uma fluorescência verde-maçã que corresponde ás áreas da célula HEp-2 onde o anticorpo se ligou. Composição do dispositivo 1. Lâminas de substrato HEp-2 ANA; 12 poços/lâmina ou 6 poços/lâmina 2. Soro controlo positivo (padrão homogéneo, marcação 3+) contém 0,09% de azida de sódio. Prédiluído, pronto a usar. 3. Soro controlo positivo (padrão centrómero, marcação 3+) contém 0,09% de azida de sódio. Prédiluído, pronto a usar. 4. Soro controlo negativo (universalmente negativo para todos os auto anticorpos) contém 0,09% de azida de sódio. Pré-diluído, pronto a usar. 5. FITC IgG (H+L), conjugada com fluoresceína, contém 0,09% de azida de sódio. Pré-diluída, pronta a usar. 6. 1% de Evans Blue (contrastante opcional). 7. Tampão fosfato (PBS II), concentrado 40x na forma líquida. 8. Meio de montagem, com agente que evita a perda de fluorescência 9. Lamelas 1
2 Advertências/Precauções Este produto (kit) é para Uso de Diagnóstico In Vitro. Este produto deve ser utilizado apenas por pessoal treinado e para o objectivo indicado nesta literatura. Recomenda-se que seja seguido o procedimento indicado. Todos os dadores do soro que é fornecido nos kits foram examinados e determinados negativos para o antigénio da Hepatite B, anticorpos contra o vírus da Hepatite C e para o Vírus de Imunodeficiência Humana (HIV 1 & 2). No entanto estes testes não garantem a ausência de agentes infecciosos. Devem ser estabelecidas medidas adequadas para o manuseamento e eliminação de material potencialmente infeccioso e o procedimento deverá ser efectuado apenas por pessoal treinado nestes métodos. Alguns componentes do kit contém 0,09% de azida de sódio como conservante e devem ser manuseados com cuidado não ingerir nem permitir o contacto com a pele ou membranas mucosas. Em caso de contacto, lavar abundantemente com água e consultar um médico. Podem formar-se azidas metálicas explosivas nas canalizações de cobre e alumínio, quando eliminar o reagente lavar abundantemente com água para impedir a formação das azidas. Condições de Armazenamento Os kits ou as lâminas fechados devem ser armazenados a 2-8ºC e podem ser utilizados até à data de validade inscrita. NÃO CONGELAR. Utilizar as lâminas imediatamente após estas terem sido retiradas do respectivo invólucro. O PBS II diluído pode ser armazenado até um mês a 2-8ºC. O conjugado com fluoresceína deve ser mantido longe de luz solar, fluorescente ou U.V. sempre que possível. Todos os reagentes devem ser armazenados a 2-8ºC. Colheita de Amostras As amostras de sangue devem ser colhidas por venipunctura, deixar coagular naturalmente e separar o soro o mais rápido possível para prevenir a hemólise. O soro pode ser conservado de 2-8 C até 7 dias antes do teste 11, ou em aliquotas a -20 C ou menos, para períodos mais prolongados. NÃO congelar e descongelar o soro mais do que uma vez. Evitar a utilização de soros lipémicos, hemolisados e/ou contaminados com microorganismos dado que poderá ocorrer uma diminuição do títulos ou um padrão de marcação pouco claro. Procedimento Material Fornecido Lâminas com Substrato HEp-2 ANA, 6-poços 1 1mL Hom. Ptn. (use w/conj or ) (Controlo positivo para ANA, Homo. Ptn (uso com Conj ou ) pré-diluído) 1 1mL Centromere Positive Control (Controlo positivo para ANA, centromero, pré-diluído) 1 1mL IFA System Negative Control (Controlo negativo, pré-diluído) 1 7mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (fluorescein), (Conjugado de IgG FITC (H&L), marcado com fluoresceína) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1% Contrastante Azul de Evans) 2 25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II concentrado (x40) 1 3mL Mounting Medium (Meio de montagem) 1 10 Coverslips (Lamelas) Lâminas com Substrato HEp-2 ANA, 12-poços 1 1mL Hom. Ptn. (use w/conj or ) (Controlo positivo para ANA, Homo. Ptn (uso com Conj ou ) pré-diluído) 1 1mL Centromere Positive Control (Controlo positivo para ANA, centromero, pré-diluído) 1 1mL IFA System Negative Control (Controlo negativo, pré-diluído) 1 7mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (fluorescein) (Conjugado de IgG FITC (H&L), marcado com fluoresceína) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1% Contrastante Azul de Evans) 2 25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II concentrado (x40) 1 10mL Mounting Medium (Meio de montagem) 1 20 Coverslips (Lamelas) Material Necessário Não Fornecido 1. Água destilada ou desionizada para diluir o PBS II concentrado. 2. Recipiente para o tampão PBS II e esguicho de plástico para a lavagem com o PBS II. 3. Micropipetas e pontas descartáveis para aplicação das amostras dos doentes. 4. Câmara húmida para os passos de incubação. 5. Microscópio de fluorescência com filtro excitador de 495nm e um filtro de barreira de 515nm. No caso de utilização apenas das lâminas, o seguinte material pode ser adquirido à INOVA: controlos positivos, ex. Homo. Ptn (uso com Conj ou ) (504090), centromero (508184), controlo negativo (508186), conjugado de IgG (H+L) anti-humana purificado por afinidade, marcado com FITC (504088, , pré-diluído pronto a usar, ou (diluído 1/50 1/200), PBS II (508998), Azul de Evans ( opcional), meio de montagem (504076, ), lamelas. 2
3 Procedimento Controlo de Qualidade Os controlos positivos e negativos devem ser utilizados sempre que sejam testadas amostras. 1. Meio de montagem: Retirar o meio de montagem do frigorífico para que este atinja a temperatura ambiente (18-28ºC) antes de ser utilizado. 2. Diluir o PBS II concentrado. Diluir o PBS II concentrado em água destilada ou desionizada (1 parte de PBS II concentrado + 39 partes de água destilada ou desionizada) e misturar bem. Nota: Só diluir todo o conteúdo de PBS II se o kit completo for utilizado dentro de um mês. O PBS II é utilizado para diluir as amostras dos doentes e como tampão de lavagem. 3. Diluição das amostras. Despiste: Diluir as amostras a 1/40, adicionando 25µL de soro a 975µLde tampão PBS II. Quantificação: Efectuar diluições sucessivas das amostras positivas com o tampão PBS II (ex.: 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 e 1/640 etc). Por exemplo: Uma amostra de 500µL, com uma diluição de 1/40, misturar com 500µL de PBS II para obter uma diluição de 1/80. Repetir este procedimento para as diluições seguintes. 4. Lâminas substrato. Deixar as lâminas com substrato à temperatura ambiente (18-28ºC) durante 30 minutos aproximadamente, antes de estas serem retiradas dos respectivos invólucros. Rotular as amostras de forma correcta, colocar na câmara húmida e adicionar uma gota dos 2 controlos positivos e do controlo negativo nos poços 1, 2 e 3 respectivamente. Adicionar 25µL de amostra nos restantes poços. 5. Incubação das lâminas. Incubar as lâminas durante 30 minutos na câmara húmida à temperatura ambiente (18-28ºC). (Toalhetes de papel húmidos colocados no fundo da câmara ajudam a manter a humidade.) 6. Lavagem com PBS II. Remover as lâminas da câmara húmida e lavar abundantemente mas com cuidado com o esguicho de PBS II. Não deitar directamente nos poços. Coloque as lâminas num frasco Coplin de PBS II diluído ou o rack imerso em PBS II até 5 minutos. 7. Adição do conjugado fluorescente. Colocar novamente as lâminas na câmara húmida e colocar imediatamente uma gota de conjugado fluorescente em cada poço. NÃO DEIXAR OS POÇOS SECOS POR MAIS DE 15 SEGUNDOS. SE O SUBSTRATO SECAR OS RESULTADOS SERÃO AFECTADOS COM GRAVIDADE. 8. Incubação da lâmina. Incubar as lâminas durante 30 minutos na câmara húmida à temperatura ambiente (18-28ºC) no escuro. 9. Lavagem com PBS II. Lavar novamente como descrito no passo 6. Contraste opcional: Adicionar 2-3 gotas de 1% de Azul de Evans por 100mL de PBS II antes da imergir a lâmina. 10. Montagem com a lamela. Remover uma lâmina de cada vez da solução de PBS II. Secar rapidamente em volta dos poços e adicionar uma gota de meio de montagem a cada poço. Colocar cuidadosamente a lamela na lâmina, evitando a formação de bolhas de ar, no entanto, caso estas se formem não é recomendável tentar removê-las. 11. Visualização das lâminas num microscópio de fluorescência. Por fim as lâminas devem ser visualizadas o mais rápido possível mas podem ser armazenadas a 2-8ºC, em espaço escuro durante 1 mês, sem perda significativa da fluorescência. Controlo de Qualidade O controlo positivo homogéneo do kit deve apresentar um padrão 3+ bem homogéneo e marcado, de cor verde maçã viva, nos núcleos das células. O controlo positivo centromero deve apresentar um padrão 3+ mosqueado discreto (geralmente em múltiplos de 46). O controlo negativo deverá apresentar uma marcação em verde baço em todas as células HEp-2, sem qualquer fluorescência. Se os controlos não se apresentarem como descrito o teste é inválido, e deve ser repetido. Nota: Se o Azul de Evans for utilizado como contrastante, uma amostra negativa dará uma coloração vermelha-alaranjada baça. Quando positivos, os núcleos apresentam uma marcação de cor verde intensa de acordo com o padrão de ANA demonstrado; as áreas da célula sem marcação apresentarão um vermelho baço. Interpretação dos Resultados Reacção Negativa. Uma amostra é considerada negativa se a marcação nuclear específica for equivalente ou inferior à do poço com o controlo negativo. Reacção Positiva. Uma amostra é positiva se a marcação nuclear for superior à do poço com o controlo negativo, e se observar um padrão claramente perceptível na maioria das células HEp-2. Os controlos do kit têm uma intensidade de 3+. A tabela seguinte sintetiza uma variedade de padrões nucleares que podem ser observados dependendo do tipo e da quantidade relativa dos anticorpos presentes na amostra: 3
4 PADRÃO Homogéneo Mosqueado Nucleolar Centrómero Mitocondrial Jo-1 APARÊNCIA ANTIGÉNIOS INVOLVIDOS Marcação nuclear sólida ds DNA (Scl-70 pode ss DNA ter uma Histonas aparência Scl-70 manchada). Manchas finas ou granulares (grosseiras), geralmente sem marcação nos nucléolos. Manchas grandes grosseiras (geralmente mais de 6 manchas por núcleo, com ou sem manchas finas). Manchas discretas (geralmente múltiplos de 46). Padrão mosqueado citoplasmátic o filamentoso granular grosseiro que se estende à volta do núcleo e por todo o citoplasma. Coloração de manchas ténues concentradas à volta do núcleo. SS-A SS-B Sm RNP + outros Pm-Scl Nucleolina Ku e outros antigénios desconhecidos Centrómero cromossomal M2 9,10 Jo-1 (hisyl-trna síntese) PRINCIPAIS DOENCAS ASSOCIADAS Títulos elevados: SLE Títulos baixos: SLE ou outras disfunções do tecido conjuntivo 5 Títulos elevados: Sindroma de Sjögren - complexo sicca SLE Doença do tecido conjuntivo desordenado Escleroderme Títulos baixos: Outras doenças do tecído conjuntivo Títulos elevados: Escleroderma & Sindroma de Sjögren 6 Sindroma de CREST 7 Cirrose biliar primária (comum) Escleroderma (40%) e ocasionalmente em sindromas sobrepostos Polimiosite, dermatomiosite associada com doença pulmonar intersticial Limitações do Procedimento 1. Títulos elevados de ANA são fortes indícios de doença do tecido conjuntivo mas a história clínica do doente e outros resultados serológicos devem ser considerados antes do diagnóstico ser pronunciado. 2. Uma pequena percentagem de doentes com SLE podem ser negativos para ANA por imunofluorescência indirecta mas apresentarem ANA através de outros métodos Doentes com SLE induzido por drogas podem ter ANA positivos homogéneos ou periféricos. Em contraste, os doentes sujeitos a terapia com esteroides podem ser negativos para ANA e por outros métodos Pode estar presente mais do que um auto anticorpo na amostra de um doente. Ao diluir o soro, os vários padrões podem se discernir facilmente. Similarmente, com títulos muito elevados, um efeito prozona pode mascarar o grau de intensidade. Todas as amostras que apresentem títulos aparentemente baixos devem ser novamente diluídas. 5. A fonte de luz, os filtros e os diferentes tipos de oculares dos microscópios de fluorescência podem influenciar na sensibilidade do teste. A qualidade do microscópio é significativamente influenciada pela manutenção correcta especialmente no que diz respeito ao címbre da lâmpada de vapor de mercúrio. Substituir a lâmpada após o período de tempo recomendado. 6. Nos doentes que se encontrem em outras condições clínicas, que excluam as doenças reumatóides e de tecido conector, podem ser detectados níveis de ANA ainda que baixos. A incidência da positividade para ANA aumenta com a idade, em indivíduos saudáveis. 4
5 7. Quando se interpretam os padrões, deve ser considerada a hipótese da presença de especificidade para mais do que um auto anticorpo. A combinação de auto anticorpos pode induzir padrões homogéneos ou manchados e é recomendável que sejam efectuados testes específicos para dsdna e ENA em todas as amostras homogéneas. 8. O surgimento de uma coloração não específica do núcleo pode ocorrer em amostras muito diluídas, ainda que, as diluições de soro a 1/40 são utilizadas frequentemente para efeitos de rastreio. 9. O teste para pesquisa de ANA é apenas um complemento ao diagnóstico, não sendo um diagnóstico, por si só. Os resultados do teste devem ser interpretados como fazendo parte de um quadro clínico completo. As lâminas vendidas em separado têm a classificação de Reagentes específicos de analitos. Excepto como componente do kit, as características analíticas e de desempenho não foram estabelecidas. Características especiais Precisão O controlo de qualidade para cada lote passa pela testagem de várias lâminas com um controlo conhecido diluído a end-point. Cada lote origina um título de end-point pré-determinado. Isto demonstra que não há diferenças de performance significativas entre lâminas do mesmo lote ou entre outras de lotes diferentes. Sensibilidade A sensibilidade dos testes e o limite de detecção é dependente da utilização do microscópio. Não existe nenhum calibrador padrão internacional para estes casos. Especificidade Foram testadas 50 amostras apresentando várias especificidades, incluindo pelo menos 10 negativas, com o kit HEp-2 da The Binding Site e com outro kit equivalente de HEp-2, disponível no mercado. A performance do kit da The Binding Site foi comparada com a do kit equivalente, em termos de especificidade e intensidade. Resumo da Técnica 1. Estabilizar o meio de montagem à temperatura ambiente. 2. Diluir o PBS II 1/40 em água destilada ou desionizada. 3. Diluir o soro do doente 1/40 em PBS II. 4. Retirar as lâminas do frio e estabilizar à temperatura ambiente (18-28ºC). 5. Retirar a lâmina do invólucro e colocar na câmara húmida. Adicionar 25µL dos controlos e de soro diluído dos doentes. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente (18-28ºC). 6. Lavar as lâminas com o esguicho de PBS II. Lavar as lâminas durante 5 minutos no rack ou frasco Coplin. 7. Absorver o excesso em volta do poço, e adicionar imediatamente uma gota de conjugado fluorescente. 8. Incubar as lâminas durante 30 minutos. 9. Lavar novamente como descrito no ponto Adicionar o meio de montagem a cada poço e a lamela. 11. Visualizar as lâminas num microscópio de fluorescência. 5
6 Referências 1. Tan, E.M. (1982): Autoantibodies to nuclear antigens: Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology. 33: Tan, E.M. et al (1982): The 1982 revised criteria for classification of systemic lupus erythematosus. Arth and rheum. 25: Miyachi, K., Fritzler, M.J., Tan, E.M. (1978): Autoantibody to nuclear antigen in proliferating cells. J. Immunol. 121: Weller, T.H., Coons, A.H. (1954): Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Prov. Soc. Exp. Biol. Med. 86: Notman, D.D., Kurata, N., Tan, E.M. (1975): Profiles of antinuclear antibodies in systemic rheumatic diseases. Ann. Int. Med. 83: Ritchie, R.F. (1970): Antinuclear antibodies. Their frequency and diagnostic application. N. Enr. J. Med. 282: Tan, E.M., Rodman, G.P., Garcia, I. (1980) et al: Diversity of antinuclear antibodies in progressive systemic sclerosis. Arthritis Rheum. 23: Gladman, D.D., Chalmers, A., Urowitz, M.B. (1978): Systemic lupus erythematosus with negative LE cells and anitnuclear factors. J. Rheum.: MacKay, I.R., Gershwin, M.E. (1989): Molecular basis of mitochondrial autoreactivity in primary biliary cirrhosis. Immunol.Today: 10: 9: Laung, P.S.C., MacKay, I., Gershwin, M.E. (1994): Mitochondrial autoantigens. Man Biol. Mark; B8.1,1-14. Eds W.J.Van Venrooij and R.N. Maini. Kluwer Academic Pubs. Netherlands. 11. Protein Refence Unit Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) Ed A Milford Ward. J Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT Rev. 5 January 2014 NOVA Lite e INOVA Diagnostics, Inc. são marcas comerciais registadas. Copyright Todos os Direitos Reservados 6
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