QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada

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1 QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Para utilização em diagnóstico In Vitro Complexidade CLIA: Elevada Aplicação diagnóstica QUANTA Lite TM H. pylori IgG é um ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção qualitativa de anticorpos IgG da H. pylori (Helicobacter pylori) no soro humano. Este teste pretende ajudar no diagnóstico de infecções provocadas pela H. pylori nos adultos com sinais e sintomas clínicos de doença gastrintestinal. Resumo e Explicação do teste A relação causal entre a infecção da H. pylori e a úlcera péptica ficou bem esclarecida desde a sua primeira apresentação em A infecção provocada pela H. pylori está presente em cerca de 95% dos doentes com úlceras duodenais, 80% com úlceras gástricas, estando associada ao carcinoma gástrico e linfoma. 2-5 A erradicação da infecção H. pylori reduz a recidiva de úlceras. 2-5 Tem sido aconselhado o tratamento da infecção provocada pela H. pylori nos doentes com úlceras duodenais ou gástricas e recentemente na dispepsia funcional. 5,6 O diagnóstico da infecção H. pylori inclui métodos invasivos e não invasivos. Os testes invasivos incluem endoscopia para observação directa da mucosa gástrica antral e realização de biópsias para o teste urease, coloração histológica (Warthin-Starry) e cultura. 5,7 A cultura é considerada o padrão ouro ; contudo, é o teste de menor sensibilidade (70-80% sensibilidade). Os testes histológicos e urease possuem sensibilidade e especificidade acima dos 90% 5. As principais desvantagens dos métodos invasivos são o risco e o desconforto dos doentes, o custo elevado e os falsos resultados negativos obtidos através da distribuição por zonas localizadas da H. pylori no estômago. Os testes não invasivos incluem o teste de respiração, usando ureia marcada 14 C ou 13 C e testes serológicos. O teste de respiração é sensível e específico, mas é dispendioso. A serologia é uma alternativa de baixo custo, sensível e específica aos métodos invasivos e/ou dispendiosos como é o caso da endoscopia e do teste de respiração da ureia 14 C. 2,3,5,8,9 O kit QUANTA Lite TM H. pylori IgG faz parte do grupo QUANTA Lite TM dos kits ELISA. Os kits ELISA para detecção do anticorpo H. pylori mostraram ser sensíveis e específicos. Princípio do método O antigénio purificado H. pylori é ligado aos poços da placa de micropoços de poliestireno sob condições que vão preservar o antigénio no seu estado nativo. Os controlos pré-diluídos e o soro diluído dos doentes são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos H. pylori IgG presentes se liguem ao antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG antihumano marcado a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controlo. Reagentes 1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno revestidos com antigénios purificados de H. pylori, (12-1 x 8 poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes. 2. Controlo negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem anticorpos humanos de H. pylori IgG, pré-diluído, 1,2 ml 3. Positivo baixo H. pylori IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos H. pylori IgG, pré-diluído, 1,2 ml 4. Positivo alto H. pylori IgG ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano com anticorpos H. pylori IgG, pré-diluído, 1,2 ml 5. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor-de-rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml 6. Concentrado de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método. 7. Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humana, 1 frasco de cor azul com solução tampão, estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml 8. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml 9. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M, 1 frasco incolor, 10 ml Advertências 1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia. 2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos de HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo baixo H. pylori IgG ELISA, o Positivo alto e o Controlo Negativo ELISA devem ser manipulados como se fossem material potencialmente infeccioso. 10 1

2 3. A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 4. O conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou absorvido pela pele. Evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele e os olhos para evitar lesões. 6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a ocorrência de queimaduras químicas. 7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes. 8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a aspiração insuficiente dos líquidos dos poços ELISA pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços das tiras ELISA, o fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. 7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados. 8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do mesmo frasco de conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as recomendações de preparação e manipulação do conjugado HRP para evitar estas ocorrências. 9. A contaminação química do conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação do conjugado HRP. Lavar bem todo o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. As tiras dos micropoços revestidas com antigénios que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora original com dessecantes e conservadas a 2-8º C. 3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C. Colheita da amostra Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados. Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A2 da NCCLS recomenda as seguintes condições de conservação para as amostras: 1) Não conservar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a 20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. Procedimento Material fornecido 1 Placa de micropoços H. pylori IgG ELISA (12-1 x 8 poços), com suporte 1 1,2 ml Controlo negativo ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo baixo H. pylori IgG ELISA, pré-diluído 1 1,2 ml Positivo alto H. pylori IgG ELISA, pré-diluído 1 50 ml Diluente da amostra HRP 2

3 1 25 ml Concentrado de lavagem HRP, 40x concentrado 1 10 ml Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humana 1 10 ml Cromogénio TMB 1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M Material adicional necessário mas não fornecido Micropipetas de 5, 100, e 500 µl Pontas descartáveis para as micropipetas Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml Água destilada ou desionizada Recipiente de 1 L para concentrado de lavagem HRP diluído Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm (e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda) Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir o Concentrado de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco do concentrado de lavagem HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantém-se estável durante uma semana a 2-8º C. 3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µl de amostra a 500 µl de diluente de amostras HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a sua preparação. NÃO DILUIR o Positivo baixo H. pylori IgG ELISA, o Positivo alto H. pylori IgG ELISA e o Controlo negativo ELISA. 4. A determinação da presença ou ausência de H. pylori IgG utilizando unidades arbitrárias requer o uso de dois poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra. Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado. Técnica 1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante, selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água. 2. Adicione 100 µl pré-diluídos do Positivo baixo H. pylori IgG ELISA, do Positivo alto H. pylori IgG ELISA, do Controlo negativo ELISA e das amostras diluídas aos poços. Tape os poços e efectue, numa superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se após a adição da última amostra. 3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione µl de solução de lavagem HRP diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na adição das amostras. 4. Adicione 100 μl do Conjugado HRP IgG a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos, usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a quantidade necessária para o ensaio. PARA EVITAR UMA POTENCIAL CONTAMINAÇÃO MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no passo Lavagem: Repita o passo Adicione 100 µl do cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e à temperatura ambiente. 7. Adicione 100 µl de solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e contagem de tempo na adição da Solução de paragem HRP, tal como efectuado para o Cromogénio TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços. 8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de 620 nm. Controlo de qualidade 1. O Positivo baixo H. pylori IgG ELISA, o Positivo alto H. pylori IgG ELISA e o Controlo negativo ELISA devem ser processados com todos os lotes de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos actuam correctamente. 2. Note que uma vez que o Positivo baixo H. pylori IgG ELISA, o Positivo alto H. pylori IgG ELISA e o Controlo negativo ELISA se encontram pré-diluídos, estes não controlam o procedimento associado à diluição das amostras. 3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros controlos adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando a < -20ºC. 3

4 4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o ensaio repetido. a. A absorvância do Positivo alto H. pylori IgG ELISA pré-diluído deve ser superior à absorvância do Positivo baixo H. pylori IgG ELISA pré-diluído, que deve ser superior à absorvância do Controlo negativo ELISA pré-diluído. b. O Positivo alto H. pylori IgG ELISA pré-diluído deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto o Controlo negativo ELISA pré-diluído não pode ter uma absorvância superior a 0,2. c. A absorvância do Positivo baixo H. pylori IgG ELISA deve ser superior em mais do dobro da absorvância do Controlo negativo ELISA ou superior a 0,25. d. O Controlo negativo ELISA e o Positivo alto H. pylori IgG ELISA servem para monitorizar falhas substanciais dos reagentes. O Positivo alto H. pylori IgG ELISA não consegue assegurar a precisão no cut-off do ensaio. e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A da NCCLS para obter instruções suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas. Cálculo dos resultados Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica média (DO) para cada conjunto de duplicados. A reactividade de cada amostra pode ser calculada dividindo a DO média da amostra pela DO média do Positivo baixo H. pylori IgG ELISA. O resultado é multiplicado pelo número de unidades do Positivo baixo H. pylori IgG ELISA que se encontram no rótulo. D.O. da amostra Valor da amostra = x Positivo baixo H. pylori IgG ELISA (unidades) DO do Positivo baixo H. pylori IgG ELISA (unidades) A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num correspondente aumento ou diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de anticorpos não duplica a reactividade). Se for necessária uma quantificação mais exacta dos anticorpos do doente, será necessário efectuar diluições em série das amostras do doente, e a última diluição com resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o título de anticorpos do doente. Interpretação dos resultados O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças nas populações de doentes. Os valores abaixo indicados são apenas valores sugeridos. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência, com base nas suas técnicas, controlos, equipamentos e população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos. As amostras têm interpretações negativas (para anticorpos H. pylori IgG), ambíguas ou positivas (detectados anticorpos H. pylori IgG) de acordo com a seguinte tabela. Unidades Negativo <20 Ambígua 20,1 24,9 Positivo >25 As amostras com resultados ambíguos devem ser testadas novamente antes dos resultados serem apresentados. 1. Um resultado positivo indica apenas que houve exposição imunológica prévia à H. pylori. Este resultado não pode distinguir uma infecção activa da H. pylori de uma inactiva. A infecção activa é determinada pela cultura de material da biópsia, pelo teste de respiração da ureia 13 C, ou por outros métodos de detecção urease. 2. Uma amostra com níveis ambíguos de H. pylori IgG não pode ser determinada para os níveis de anticorpos. Se o resultado permanecer ambíguo depois de repetido o teste, o resultado deve ser apresentado como ambíguo e/ou deve ser feita uma amostra adicional. 3. Um resultado negativo indica ausência de anticorpos H. pylori ou níveis abaixo do limite de detecção do teste. As amostras recolhidas no estágio inicial da infecção primária podem não apresentar níveis de detecção de anticorpos IgG. Se há suspeita de uma infecção primária, deve ser retirada outra amostra após 4-6 semanas e testada em concordância com o mesmo teste da primeira amostra. 4. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório devem incluir a declaração: Os resultados apresentados foram obtidos com o INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Os valores de H. pylori IgG obtidos através de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis de IgG descritos não pode ser correlacionada com um título final. Limitações do método 1. Este teste pretende ajudar no diagnóstico de infecções da H. pylori. 2. O teste deve apenas ser utilizado nos indivíduos com sintomas sugestivos de doença gastrintestinal e não em indivíduos assintomáticos. 3. Um resultado negativo do anticorpo não exclui a presença de anticorpos H. pylori porque a concentração de anticorpos pode estar abaixo do limite de detecção do ensaio. 4

5 4. Os resultados obtidos podem ser negativos se as amostras forem colhidas no estágio inicial da infecção, anterior ao aparecimento de anticorpos detectáveis. Se há suspeita de infecção da H. pylori, devem ser obtidas posteriormente novas amostras após 4-6 semanas e testadas em paralelo com a primeira amostra. 5. Um resultado positivo do teste não permite distinguir a infecção activa da colonização da H. pylori. 6. Um resultado positivo do teste indica apenas a presença do anticorpo H. pylori e não indica, necessariamente, a presença da doença gastrintestinal. 7. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros testes serológicos. 8. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do soro. Valores esperados Estima-se que aproximadamente 50% da população mundial esteja infectada com a H. pylori. Nos países não desenvolvidos, 50% da população ou mais, é infectada aos 10 anos de idade, enquanto nos países desenvolvidos a infecção na infância é pouco frequente. A seroprevalência aumenta de 0,5 a 1,0% por ano com o envelhecimento (isto é, aproximadamente 60% de seroprevalência no grupo etário dos 60 anos). 3,7,12,13 Intervalo de valores normais Dois grupos de indivíduos saudáveis assintomáticos (idades compreendidas entre 18-75), um de San Diego, Califórnia, e outro de Buffalo, Nova Iorque, foram testados com QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Os resultados das amostras de soro para os anticorpos H. pylori IgG foram positivos, o grupo de San Diego com 1,8% (1/53) e o grupo de Buffalo com 11,3% (11/97). Como era esperado, os dados apresentaram um aumento na seropositividade, com o envelhecimento. Sensibilidade e Especificidade Relativa Amostras de estudo Foi testado o desempenho de QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA num painel de 295 amostras retrospectivas, clinicamente confirmadas, de doentes submetidos a endoscopia. A presença da infecção H. pylori foi determinada através da cultura, histologia e testes CLO. Consideraram-se positivas as amostras para H. pylori que fossem de cultura positiva ou quando 2 dos 3 ensaios fossem determinados positivos. Tabela 1: Sensibilidade e especificidade no painel clínico n= 295 H.pylori IgG INOVA POS AMBIG NEG Clínico POS* n= NEG n= *Considerou-se positiva a amostra, se fosse de cultura positiva, ou de CLO e histologia positivas Sensibilidade: 94,0% (141/150) Especificidade: 92,0% (126/137) Concordância: 93,0% (267/287) Nota: os resultados ambíguos foram excluídos dos cálculos Embora as amostras dos doentes tenham sido consideradas negativas, aquando da colheita, por meio de teste CLO, cultura e histologia, há suspeita de alguns desses doentes terem estado expostos à H. pylori, com base na forte reactividade IgG observada em algumas amostras negativas. Por conseguinte, 7 das 11 amostras clínicas negativas, consideradas positivas pelo QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA da INOVA, foram testadas novamente por um dispositivo H. pylori IgG semelhante, aprovado para diagnóstico in vitro. O kit comercializado detectou 6 amostras positivas e 1 indeterminada. Resultados do teste ao painel clínico cego em três locais Os resultados obtidos no painel de 40 amostras clínicas cegas, realizadas em 3 locais de teste, encontramse resumidos na Tabela 2. A especificidade foi de 100% (10/10) nos três locais. A sensibilidade foi de 96,3% no local 1, 96,6% no local 2 e 93,1% no local 3 Tabela 2: Sensibilidade e especificidade de QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA obtidas nos 3 locais com painel clínico cego. Local 1 Local 2 Local 3 Sensibilidade N=30 96,3% (26/27) 96,6% (28/29) 93,1% (27/29) Especificidade N=10 100% (10/10) 100% (10/10) 100% (10/10) Concordância Total 97,3% (36/37) 97,4% (38/39) 94,9% (37/39) Nota: A ambiguidade foi excluída. Validação do cut-off O cut-off deste ensaio foi validado através do teste das amostras clínicas do painel, utilizando a análise ROC (Característica do Receptor Operante) do cut-off 11. 5

6 Análise ROC A análise ROC dá uma estimativa da precisão de diagnóstico do ensaio H. pylori IgG INOVA, comparando, simultaneamente, o estado clínico observado no doente. Permite ainda a validação do ponto cut-off do ensaio 11. A análise é compatível com os valores de interpretação determinados para este dispositivo. Estudo de reactividade cruzada Foi efectuado um estudo de adsorção, para avaliar a reactividade cruzada de antigénios bacterianos, com o ensaio QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA da INOVA. Em resumo, o soro com níveis diferentes de anticorpos H. pylori foi adsorvido, não só com H. pylori, C. jejuni, C. coli, C. fetus, como com antigénios E. coli, e as amostras de soro tratado e não tratado foram testadas no ensaio H. pylori IgG. Todas as amostras H. pylori seropositivas mantiveram-se assim, quando absorvidas por outros antigénios, além dos H. pylori. A percentagem média de inibição para o antigénio H. pylori foi 82,1% e 2,9% para os antigénios provenientes de outros organismos utilizados. Foi também testada a presença de anticorpos anti-nucleares (5 soros), factor reumatóide (5 soros) e anticorpos anti-adn (5 soros), não afectando a especificidade do ensaio QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA, da INOVA. Interferência Foram efectuados dois estudos, para determinar se a presença de níveis altos de bilirrubina, colesterol, ou triglicéridos nas amostras de soro interfere com o ensaio QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. No primeiro estudo, foram testadas 20 amostras de soro (6 H. pylori positivas e 14 negativas) com e sem a adição de bilirrubina (40x nível normal) ou hemoglobina (66x normal). O segundo estudo consistiu em adicionar soro positivo H. pylori com soro com níveis altos de colesterol, triglicéridos ou bilirrubina. Os resultados demonstraram que nenhuma destas substâncias interferiu com o ensaio QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Precisão e Reprodutibilidade A variação do inter-ensaio foi determinada testando em duplicado um painel cego de 14 amostras, incluindo duas negativas, 3 baixas, duas moderadas, 1 positiva alta, e os controlos negativos, positivo baixo e positivo alto do dispositivo, duas vezes por dia (uma de manhã e outra à tarde), durante 3 dias em cada um dos três locais. Tabela 4: Desempenho combinado do inter-ensaio para os três locais Soro R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 NC LPC HPC SRU 46,7 23,8 30,2 46,5 45,6 25 4,2 24, ,6 3,5 4,0 25,8 3,4 4, ,6 DP 2,4 2,3 4,9 2,3 2,5 3,4 2,6 2,9 3,0 8,8 2,7 3,0 2,5 2,8 3,2 0 5 CV% As técnicas do intra-ensaio foram avaliadas através do teste de 6 amostras, incluindo 15 vezes amostras negativas, ambíguas, no limite do positivo, baixas positivas, moderadamente positivas e altas positivas. Os resultados são resumidos na Tabela 5. Tabela 5: Desempenho do intra-ensaio QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Soro 1 Soro 2 Soro 3 Soro 4 Soro 5 Soro 6 Média 84,03 99,28 31,98 25,96 21,12 2,98 D.P. 3,09 4,21 1,44 1,52 0,91 0,30 C.V.% 3,6 4,2 4,5 5,9 4,3 10,1 Linearidade Para determinar a linearidade de QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA, foram diluídas 4 amostras, em série, de 1:50 a 1:51,200 e avaliadas relativamente ao QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. As análises demonstraram que o ensaio foi linear, de aproximadamente unidades na extremidade baixa a, pelo menos, 121 unidades na extremidade alta. Os valores de R 2 das 4 amostras diluídas foram 0,99 ou superiores. SRU QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA Linearidade 1:50 1:200 1:800 1:3200 Diluição SRU BL - 63 SRU BL - 77 SRU BL - 95 SRU BL - 96 Linear (SRU BL - 95) Linear (SRU BL - 96) Linear (SRU BL - 63) Linear (SRU BL - 77) y = -18,159x + 138,35 R 2 = 0,9934 y = -10,639x + 86,575 R 2 = 0,9937 y = -13,894x + 119,42 R 2 = 0,9903 y = -15,844x + 120,41 R 2 = 0,9885 6

7 Referências 1. Marshall BJ Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, ii: Walsh JH and Peterson WL The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. N.Engl. J. Med. 333(15): Blaser MJ Helicobacter pylori: its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15: The Eurogast Study Group An international association between H. pylori infection and gastric cancer. Lancet 341(8857): NIH Concensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease JAMA 272: Malfertheiner P, et al Current European concept in the mangement of Helicobacter pylori infection- the Maastricht concensus report. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 9: Hirschl AM, et al Kinetics of specific IgG antibodies for monitoring the effect of anti- Helicobacter pylori chemotherapy. J. Infect. Dis. 168: Bourke B, Jones N, and Sherman P Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in children. Ped. Infect. Dis. J. 15: Patel P, et al Prospective screening of dyspeptic patients by Helicobacter pylori serology. Lancet 346: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests using receiver operating characteristic (ROC) Plots; approved guideline (NCCLS document GP10-A), Wayne, PA. 12. Megraud F, et al Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J. Clin. Microbiol. 27: Veldhuyzen SJO, et al Increasing prevalence of H. pylori infection with Age: Continuous risk of infection in adults rather than cohort effect. J. Infect. Dis. 169: Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service PRT November 2009 Revision 4 7