INSTRUÇÕES DE USO. BINDAZYME Human ASCA IgG EIA Kit - MK053 BINDAZYME Human ASCA IgA EIA Kit - MK054. (Anticorpos anti-saccharomyces cerevisiae)

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1 INSTRUÇÕES DE USO BINDAZYME Human EIA Kit - MK053 BINDAZYME Human EIA Kit - MK054 (Anticorpos anti-saccharomyces cerevisiae) Para diagnóstico in vitro Portuguese Produto fabricado por The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. 1 UTILIZAÇÃO Telefone: +44 (0) Fax: +44 (0) info@bindingsite.co.uk Estes testes destinam-se a determinação in-vitro semi quantitativa de ASCA IgG (Cod: MK053) ou IgA (Cod: MK054) anticorpos anti-saccharomyces cerevisiae em soro humano. A presença de ASCA pode ajudar no diagnóstico de doentes com a doença de Crohn. Os resultados do teste devem ser utilizados em conjunto com outros dados clinicos e testes laboratoriais. O não deve ser utilizado sozinho como teste de despiste de ASCA. Em vez disso, este deve ser utilizado como complemento, sem substituir o teste ASCA de anticorpos IgG visto que existe um subgrupo de portadores da doença de Crohn que podem não ter anticorpos IgA. Cada kit contém reagentes suficientes para testar até 41 amostras em duplicado ou 8 amostras simples, com a curva de calibração e os controlos positivo e negativo, com prioridade a resultados semi-quantitativos. Se este for utilizado com teste de despiste, 45 amostras em duplicado ou 3 simples podem ser testadas juntas com o controlo cut-off, positivo e negativo. 2 RESUMO E EXPLICAÇÃO A doença inflamatória do intestino (DII) é uma condição inflamatória intestinal recorrente. Os seus sintomas variam entre diarreias, dores abdominais e perda de peso. As duas formas principais de DII são a doença de Crohn e a Colite Ulcerosa. A doença de Crohn afecta mulheres e homens praticamente da mesma forma e pode surgir em qualquer idade. Contudo, a Colite Ulcerosa ocorre com mais frequência nas mulheres, que atingem o auge da actividade doença por volta dos vinte anos. Os que sofrem de doença de Crohn podem ter os dois auto anticorpos, IgG e IgA, directamente a combater os epitopes oligomanosídicos derivados das Saccharomyces cerevisiae 1. A quantificação combinada entre os p-anca (perinuclear anticorpos antineutrófilos citoplasmáticos) e os ASCA fornece um melhor diagnóstico de diferenciação entre a doença de Crohn e a Colite Ulcerosa (Rutgeerts e Vermeire) 2. Num outro estudo, Peeters et al 3 deparou-se com uma sensibilidade de 60%, 86% especificidade e 2% de valor positivo previsível (VPP) de ASCA para a doença de Crohn, e contrastando, 50% de sensibilidade, 4% especificidade e 76% de VPP de panca para a Colite Ulcerosa Combinando estes dois métodos, tanto a especificidade como o VPP aumentam. Os mesmos valores de ASCA+/pANCA para a doença de Crohn são 56%, 2% e 5% respectivamente, e de panca+/asca- para Colite Ulcerosa 44%, 8% e 88% respectivamente. Existe um subgrupo de doentes com doença de Crohn que não têm anticorpos ASCA. Num estudo realizado com 0 doentes com doença de Crohn, a prevalência foi relativamente baixa, a 61% (Quinton et al 18) 4, limitando assim a sua utilidade clínica neste estudo. Em doentes com colite indeterminada, doença de Crohn ASCA+/pANCA prevista em 80% dos doentes e Colite Ulcerosa panca+/asca prevista em 63%. Contudo, 48% dos doentes com colite indeterminada não possuem anticorpos contra ASCA ou panca, sugerindo que estes doentes formam uma entidade clínica distinta das outras (Joossens et al 2002) 5. Títulos positivos de ASCA foram também associados à doença celíaca em 14-43% dos casos. (Conrad et al 6, Damoiseaux et al 7 ) Por isso, combinando os anticorpos tranglutaminase (ttga) com ASCA e ANCA pode atingir-se uma precisão ainda melhor. Os ASCA+/ANCA-/tTGA dão origem a 60% sensibilidade, 0% especificidade, 0% valor positivo previsível e 0% valor negativo previsível para doença de Crohn. 3 PRINCÍPIO DO MÉTODO Os poços da microplaca estão revestidos com mannan (polimeros de manose) isolado de Saccharomyces cervesiae. Os calibradores, controlos e amostras diluídas dos doentes são pipetados nos poços, os autoanticorpos que reconhecem o mannan (polimeros de manose) ligam-se a eles durante a primeira incubação. Após a lavagem dos poços, para a remoção das proteínas que não se ligaram, é adicionado o conjugado de coelho IgG ou IgA antihumana (específico para a cadeia γ e α), marcado com um peroxidase purificado. O conjugado liga-se ao anticorpo humano capturado e o excesso de conjugado é removido através de lavagens. Após a adição do substrato 3,3,5,5 Tetrametilbenzidina (TMB) forma-se um produto de cor azul, cuja intensidade é proporcional à concentração de anticorpo na amostra. É adicionado ácido fosfórico a cada poço produzindo uma cor amarela que indica o final da reacção. A leitura é realizada a um comprimento de onda de 450nm. 4 PRECAUÇÕES 4.1 AVISOS Todos os soros de doadores humanos fornecidos no kit foram testados ao nível do dador e deram resultados negativos para os antigénios de Hepatite B, anticorpos HIV 1 e 2 e vírus de Hepatite C através da utilização de produtos com marcação CE de acordo com a directiva Europeia 7/7/EC em Aparelhos de Diagnóstico Médico in vitro (Anexo II, Lista A). No entanto, estes testes não podem garantir a ausência de agentes infecciosos. Deve estabelecer-se métodos adequados de manuseamento e tratamento das amostras bem como só deve ser permitido o uso deste kit a pessoal qualificado no manuseamento de material potencialmente infeccioso. A azida de sódio pode reagir com cobre e/ou chumbo formando azidas metálicas explosivas. Aquando do descartamento dos reagentes já utilizados adicionar grandes quantidades de água de modo a prevenir a formação das azidas. Os tampões e soros fornecidos neste kit contêm vários inibidores de enzimas, indicados na tabela seguinte, que devem ser manuseados com cuidado. INIBIDOR Kathon Azida de Sódio Proclin 300 Bromonitrodioxano Metillisotiazona CONCENTRAÇÃO 0,02% 0,0% 0,045% 0,002% 0,002% Proclin é produto registado por Rohm e Haas Corp. Philadelphia, PA O inibidor Kathon pode causar irritação em contacto com a pele. A solução de paragem da reacção contém ácido fosfórico de concentração 3M, evitar o contacto com os olhos e a pele. Qualquer salpico de reagente deve ser limpo de modo apropriado, de acordo com as regras locais e ambientais. 4.2 PRECAUÇÕES Este produto deverá ser usado somente por pessoal qualificado. Deve seguir-se as instruções com rigor. Qualquer alteração pode ter efeito na prestação do teste, e nos resultados obtidos. Tomar atenção a Notas específicas e avisos ao longo das instruções de uso. Utilizar sempre os reagentes do mesmo lote. Caso se realize um número elevado de testes dever-se-á verifcar se todos os reagentes pertencem ao MESMO lote. As tiras devem ser provenientes do mesmo invólucro. A substituição de qualquer componente do kit pode induzir a resultados incorrectos. Para evitar quaisquer contaminações dos reagentes utilizar pontas descartáveis de plástico/vidro. Nunca repor nos frascos originais reagentes não utilizados. Não deixar os recipientes dos reagentes destapados, qualquer evaporação ou contaminação pode levar a resultados inconsistentes. O substrato TMB não dever ser exposto ao contacto com a luz ou água. Não devem ser utilizados soros contaminados, hemolisados ou lipémicos e amostras que contenham partículas em suspensão. As amostras diluídas incorrectamente não podem ser testadas, já que os controlos do kit são fornecidos prontos-a-usar. Recomenda-se a utilização de pipetas calibradas e de soro de Controlo de Qualidade interno (CQ). A utilização de sistemas automáticos para o teste, diluição das amostras e outros aparelhos automáticos pode conduzir a diferenças nos resultados quando comparados com o procedimento manual. É da responsabilidade de qualquer laboratório a validação do sistema com o qual está a trabalhar, e assegurar que os resultados se encontram dentro dos limites definidos pelas instruções de uso e pelo certificado de CQ associado. Todo o equipamento utilizado deve ser calibrado e conservado de acordo com as instruções do fabricante. 4.3 CONSERVAÇÃO E ESTABILIDADE O kit deve ser conservado entre 2-8ºC e não deve ser congelado. A conservação a temperaturas impróprias s irá afectar os resultados. O tampão de lavagem diluído num recipiente limpo pode ser conservado à temperatura ambiente (20-24ºC) até 4 semanas. A data de validade do kit está mencionada no rótulo exterior. 5 COLHEITA E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS As amostras de sangue devem ser colhidas por punção venosa de modo a permitir a formação do coágulo naturalmente e a separação do soro. O soro pode ser conservado a 2-8 C até 7 dias antes do teste 8, ou em aliquotas a -20 C ou menos, para períodos mais prolongados. Devem evitar-se o descongelamento e congelamento sucessivo. As amostras de soro não podem ser inactivadas pelo calor, pois poder-se-á obter resultados falsos positivos. 6 MATERIAIS 6.1 MATERIAL FORNECIDO-Componentes comuns aos dois kits Instruções de uso: Fornece instruções detalhadas do teste. Insert Codes: E053.P, Version: 20th July 2006, Page 1 of 5

2 Certificado CQ: Indica a performance esperada para o lote. Mannan Coated Wells (Microplaca revestida com mannan): 12 tiras fraccionáveis constituídas por 8 poços cada revestidos com mannan. Cada microplaca é embalada num invólucro hermeticamente fechado e contém dois pacotes de exsicante. Type III Sample Diluent (Diluente da amostra, tipo III): 2 frascos contendo 50mL de tampão para a diluição da amostra. Com coloração amarela no formato pronto a usar. Wash Buffer (Tampão de lavagem, concentrado 20 vezes): 1 frasco contendo 50mL de tampão de lavagem dos poços da microplaca concentrado 20 vezes. TMB Substrate (Substrato TMB): 1 frasco contendo 14mL de substrato TMB. Stop Solution (Solução de paragem): 1 frasco contendo 14mL de ácido fosfórico a 3M. 6.2 MATERIAIS FORNECIDOS QUE SÃO ESPECIFICOS DO PRODUTO (OU OU IgA, RESPECTIVAMENTE) BINDAZYME (MK053) Calibrators (Calibradores IgG ASCA): 5 frascos cada um com 1,2mL de soro humano diluído, com as seguintes concentrações de autoanticorpos IgG ASCA: 0; 33,3; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL. Cut-off Control (Controlo cut-off IgG ASCA): 1 frasco com 1,2mL de soro humano diluído. Positive Control (Controlo positivo IgG ASCA): 1 frasco com 1,2mL de soro humano diluído. O valor de referência está no certificado de CQ. ASCA Negative Control (Controlo negativo ASCA): 1 frasco com 1,2mL de soro humano diluído. O valor de referência está no certificado de CQ. Pronto a usar. Conjugate (Conjugado IgG ASCA): 1 frasco com 12mL de anticorpo marcado com peroxidase purificado anti-igg humana. Com coloração vermelha BINDAZYME (MK054) Calibrators (Calibradores IgA ASCA): 5 frascos cada um com 1,2mL de soro humano diluído, com as seguintes concentrações de autoanticorpos IgA ASCA: 0; 33,3; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL. Cut-off Control (Controlo cut-off IgA ASCA): 1 frasco com 1,2mL de soro humano diluído. Positive Controls (Controlo positivo IgA ASCA): 1 frasco com 1,2mL de soro humano diluído. O valor de referência está no certificado de CQ. ASCA Negative Control (Controlo negativo ASCA): 1 frasco com 1,2mL de soro humano diluído. O valor de referência está no certificado de CQ. Pronto a usar. Conjugate (Conjugado IgA ASCA): 1 frasco com 12mL de anticorpo marcado com peroxidase purificado anti-iga humana. Com coloração verde. 6.3 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS Lavador automático de microplacas: É o mais recomendado, no entanto a lavagem pode ser efectuada manualmente. Leitor de microplacas: Para efectuar leituras de densidade óptica a 450nm contra o ar. Àgua destilada ou desionisada: A água deve ser de elevada qualidade. Micropipetas calibradas: Para a pipetagem de 00, 0 e μl. Pipeta multicanal: Recomendado para a pipetagem volumes de 0μL do conjugado, substrato e solução de paragem. Pontas de plástico/vidro: Para a diluição da amostra. 7 METODOLOGIA 7.1 PRE-EXECUÇÃO DO TESTE 1. Conduzir o kit à temperatura ambiente O kit foi desenvolvido para a realização dos testes à temperatura ambiente (20-24 C). Retirar o kit do frigorifico e deixa-lo à temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. As microplacas não devem ser retiradas do invólucro antes deste se encontrar à temperatura ambiente. Nota: Este kit pode ser conservado à temperatura ambiente até uma semana. 2. Componentes do kit Agitar suavemente todos os componentes do kit, antes de usar. 3. Diluição do tampão de lavagem Adicionar 50mL de tampão de lavagem concentrado a 50mL de água destilada (diluição de 1:20) e misturar. Podem ser diluídos volumes mais pequenos, respeitando a proporcionalidade. A solução de tampão de lavagem diluida pode ser conservada à temperatura ambiente até 4 semanas. Diluir apenas as quantidades necessárias. 4. Diluição da amostra Diluir μl de cada amostra com 00μL de diluente da amostra (1:0) e misturar bem. Nota: Após a sua diluição a amostra deve ser utilizada nas 8 horas seguintes. 3. Manuseamento das tiras e do moldura das tiras Colocar o número de tiras necessárias na moldura da microplaca e fixá-las pelas extremidades, posicionar-se no poço A1 e preencher as colunas da microplaca da esquerda para a direita. Nota: Repor, de imediato, as tiras não utilizadas, no invólucro com os dois sacos de exsicante e fecha-los novamente de modo a minimizar a exposição ao ar. Cuidado para não furar ou romper o invólucro de alumínio, ver aviso em baixo. AVISO: A exposição das tiras à humidade ou a contaminação pelo ar ou por outras partículas pode resultar na deterioração do antigénio, conduzindo à perda de precisão do teste bem como a resultados falsos. 7.2 EXECUÇÃO DO TESTE Manter durante o teste a mesma sequência de pipetagem. 1. Amostra Pipetar 0μL dos cinco calibradores (teste semi-quantitativo), ou 0μL de controlo cut-off (teste de despiste), controlos e amostra diluída (1:0) nos poços da microplaca. Nota: As amostras devem ser pipetadas de imediato para a placa com o objectivo de minimizar as alterações aos resultados do teste, o tempo começa a contar após a pipetagem da última amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. 2. Lavagem Os passos de lavagem são passos críticos e requerem uma atenção especial. A lavagem dos poços quando realizada de modo inadequado, pode conduzir a resultados pouco precisos e a um elevado background. Após a incubação lavar a microplaca 3 vezes com μL tampão de lavagem, por poço. A microplaca deve ser lavada com um lavador automático de microplacas ou manualmente de acordo com as indicações abaixo. Após a lavagem de modo automático, inverter a microplaca sobre papel absorvente, batendo suavemente, de modo a secar os poços completamente. Lavagem manual das microplacas: a. Deitar fora o conteúdo dos poços. b. Bater suavemente com a microplaca invertida sobre papel absorvente. c. Encher cada poço com μL de tampão de lavagem utilizando uma pipeta multicanal. d. Agitar suavemente a microplaca numa superfície plana. e. Repetir os passos de a-d duas vezes. f. Repetir a e b. 3. Adição do conjugado Pipetar 0μL de conjugado em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modo a remover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso de conjugado no frasco correspondente. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. 4. Lavagem Repetir o descrito no passo Adição do substrato (TMB) Pipetar 0μL de substrato (TMB) em cada poço, limpar o topo dos poços com papel absorvente de modo a remover qualquer salpico. Nota: Para evitar qualquer contaminação, não recolocar o excesso de substrato (TMB) no frasco correspondente. Incubar, no escuro, à temperatura ambiente durante 30 minutos. 6. Paragem da reacção Pipetar 0μL de solução de paragem em cada poço. Dá-se uma mudança de cor de azul para amarelo. 7. Leitura da densidade óptica Ler a densidade óptica (DO) de cada poço a 450nm, num leitor de microplacas até 30 minutos após a adição da solução de paragem. 8 RESULTADOS E CONTROLO DE QUALIDADE 8.1 TESTES SEMI-QUANTITATIVOS / DESPISTE 1. Controlo de qualidade Para que o teste seja válido, tem que obedecer aos seguintes critérios: Os controlos positivos e negativos, cut-off / calibradores caso aplicável, devem estar incluídos em cada série. Os valores/do obtidos para os controlos devem encontrar-se dentro do intervalo especificado pelo Certificado de CQ. A curva obtida deve ser similar à curva de calibração evidenciada no Certificado CQ apenas no teste semi-quantitativo. Caso os critérios acima referidos não sejam respeitados o teste é considerado inválido e o teste deve ser repetido. 2. Cálculo da media das densidades ópticas (somente para os testes realizados em duplicado) Para cada calibrador, controlo ou amostra calcular a média da DO das leituras em duplicado. A percentagem do coeficiente de variação (%CV) para cada DO em duplicado deverá ser inferior a 15%. 8.2 TESTE DE DESPISTE INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 1. Gerência da qualidade das densidades ópticas A DO do controlo positivo deverá ser maior do que 0,6 e superior à DO do controlo cut-off. A DO do controlo negativo deve ser inferior a 0,3. A DO do controlo cut-off deve ser superior à do controlo negativo. 2. Interpretação dos resultados Interpretar os resultados de acordo com a seguinte tabela, utilizando o controlo cut-off: Insert Codes: E053.P, Version: 20th July 2006, Page 2 of 5

3 RESULTADO INTERPRETAÇÃO ACÇÃO DO maior que controlo cut-off DO menor ou igual a controlo cut-off Suspeita da existência de ASCA Negativo 8.3 TESTE SEMI-QUANTITATIVO CÁLCULO DOS RESULTADOS Testar de forma quantitativa caso um valor é necessário Considerar como negativo 1. Traçar curva de calibração A curva de calibração pode ser traçada automaticamente ou manualmente, colocando o valor das concentrações dos autoanticorpos ou IgG na escala logarítmica e as DO de cada calibrador na escala linear. Automaticamente utilizar um software adequado. Manual utilizar um papel log/linear, traçar a melhor curva através dos pontos obtidos. (não traçar uma linha recta, ou unir ponto por ponto). 2. Tratamento de pontos anómalos Caso algum ponto se encontre fora da curva de calibração, este poderá ser retirado. A ausência deste significa que a curva tem uma forma diferente da curva de calibração ou caso exista mais que um ponto fora da curva, o teste deverá ser repetido. 3. Cálculo dos valores dos controlos Determinar o nível dos autoanticorpos ASCA dos controlos directamente a partir da curva de calibração. O valor obtido deverá estar dentro dos limites referidos no certificado de CQ. 4. Cálculo dos níveis de auto anticorpos nas amostras diluídas Determinar o nível dos autoanticorpos ASCA das amostras directamente a partir da curva de calibração. Nota: Os valores dos calibradores foram ajustados por um factor de 0 de acordo com o factor de diluição da amostra (1:0). Não é necessário mais nenhum tipo de correcção. 5. Calibração do teste O teste foi calibrado U/mL de acordo com um calibrador interno arbitrário de referência, já que não se conhecem outros padrões reconhecidos internacionalmente. 6. Limitações Um resultado negativo de ou IgA não exclui a presença da doença de Crohn. Um resultado negativo de anticorpos ou IgA não exclui a presença de anticorpos ASCA porque o nivel pode estar abaixo do limite de detecção do teste. As amostras de doentes com doença celíaca podem conter anticorpos ASCA IgG. Um resultado positivo apenas indica a presença de anticorpos contra S. cerevisiae o que não indica, necessariamente, a presença da doença de Crohn. A performance do teste foi estabelecida apenas para amostras de soro. A performance do teste não foi estabelecida para amostras de doentes com doença de Crohn ou Colite Ulcerosa pediatricas Este kit é utilizado somente para diagnóstico. Um resultado positivo deve ser confirmado através de outros dados clínicos e outros testes serológicos. Informação da FDA (EUA) - ver folha de rosto do Folheto de Instruções em Inglês. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Foram determinados os níveis de autoanticorpos em 200 amostras de soro fornecidas por doadores saudáveis, os resultados estão representados no gráfico abaixo como intervalos de referência. Os testes de ELISA apresentam elevada sensibilidade sendo capazes de detectar pequenas diferenças em populações de amostras. É recomendável que cada laboratório determine os seus próprios intervalos normais, baseados em técnicas e equipamentos utilizados. Resultado negativo 22,0 U/mL 7,0 U/mL Resultado positivo >22,0 U/mL >7,0 U/mL CARACTERÍSTICAS DO TESTE.1 PRECISÃO PRECISÃO INTRA-ENSAIO A precisão intra-ensaio foi determinada utilizando seis amostras testadas em duplicado vinte vezes cujos valores se encontram no intervalo da curva de calibração. Os valores de %CV para cada amostra são apresentados na tabela seguinte. n=20 Concentração % CV Amostra 1 12,1 3,7 Amostra 2 14,2 4,2 Amostra 3 33,0 4,1 Amostra 4 46,8 2,3 Amostra 5 67,1 6,4 Amostra 6 81,3 6,7 Nºde amostras Nºde amostras n=20 Concentração % CV Amostra 1 2, 7,3 Amostra 2 3,1 4,7 Amostra 3,5 4,1 Amostra 4 15,0 2,0 Amostra 5 30, 4,7 Amostra 6 67,8 2, PRECISÃO INTER-ENSAIO A precisão inter-ensaio foi determinada utilizando oito amostras testadas em duplicado seis vezes durante três dias. Os valores de %CV para cada amostra são apresentados na tabela seguinte. n=6 % CV n=6 IgG ASCA valores normais IgG ASCA U/mL das amostras, ou 5%, ficaram acima do valor de cut-off a 22 U/mL (aprox. média + 2DP). 3 amostras com valores de,2; 643,1 e 30, U/mL testaram positivas num outro kit alternativo, enquanto que as restantes 7 obtiveram valores entre os 23,0 e 34,8 U/mL. IgA ASCA valores normais IgA ASCA U/mL % CV Amostra 1,2 8, Amostra 5 38,4 7,8 Amostra 2 12,7,4 Amostra 6 48,7 6,6 Amostra 3 28,7 7,5 Amostra 7 67, 7, Amostra 4 37,0 8,8 Amostra 8 80,0 4,7 n=6 % CV n=6 % CV Amostra 1 2, 5, Amostra 5,2 4,7 Amostra 2 3,0 7,7 Amostra 6 14, 7,2 Amostra 3 6,5,2 Amostra 7 63,2 7,3 Amostra 4 6,6 12,0 Amostra 8 8,4 7,3.2 INTERVALO DE REFERÊNCIA Os níveis de IgG e IgA ASCA foram determinados em soro de 200 dadores de sangue normais. Os resultados estão demonstrados nos gráficos abaixo. Nenhuma das amostras esteve acima do valor cut-off a 7,0 U/mL. (aprox. média + 5DP). Os valores de referência apresentados são apenas um exemplo. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores normais. Insert Codes: E053.P, Version: 20th July 2006, Page 3 of 5

4 .3 ESPECIFICIDADE, SENSIBILIDADE E CONCORDÂNCIA A especificidade, sensibilidade e concordância relativas foram determinadas contra kits alternativos e IgA EIA utilizando 120 amostras normais e 5 de soro com doença de Crohn. 6 soros de doentes com Colite Ulcerosa confirmada foram incluidos num estudo de incidência GI..6 SUBSTÂNCIAS INTERFERENTES Foram inseridos, nas amostras ASCA elevadas e baixas, vários tipos de substâncias interferentes, subsequentemente re testadas. O método utilizado para a verificação destas substâncias foi baseado no kit Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku, Japão. Enquanto que para FR foi utilizado material da Cliniqa, CA, USA. EIA Alternativo + Dúbios* - BINDAZYME Concordância positiva % 70,2% Concordância negative % 6,8% Concordância total % 88,7% Substancia Bilirubina F (livre) Bilirubina C (conjugada) Hemoglobina hemolisada Quilo Factor reumatóide Não se verificou quaisquer interferências. Concentração 18,6mg/dL 22,4mg/dL 480mg/dL 1670 unidades 113,5 IU/mL EIA Alternativo + Dúbios* - BINDAZYME Concordância positiva % 1,4% Concordância negative % 5,7% Concordância total % 5,0% * As amostras dúbias em kits alternativos (4 amostras) foram excluidas do teste..4 INCIDÊNCIA DA POSITIVIDADE E IgA EM GRUPOS DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS GI A incidência de ASCA foi determinada em 5 amostras de doentes com a doença de Crohn (DC) e com Colite Ulcerosa (CU), confirmados clinicamente, e que são comparadas no quadro seguinte com o que foi observado no intervalo normal (ver acima). Das 31 amostras positivas para ambos os ASCA IgG e IgA, 27 (87%) originaram do grupo da doença de Crohn. Resultado BINDAZYME ASCA EIA Grupo N = Doença de Crohn Pos IgG Pos IgA Pos IgG ou IgA Pos IgG e IgA 5 44% (46) 37% (3) 55% (58) 26% (27) CU 6 14% (13) 6% (6) 17% (16) 3% (3) Normais 120 5% (6) 3% (4) 8% () 1% (1) A incidência de resultados positivos no grupo de amostras normais apoia a incidência que é mencionada no estudo do intervalo normal..5 INCIDÊNCIA DE POSITIVIDADE E IgA EM OUTROS GRUPOS DE DOENÇAS 11 BIBLIOGRAFIA 1. Vermeire S et al. Comparative study of ASCA (Anti-Saccharomyces cerevisiae antibody) assays in inflammatory bowel disease: Gastroenterology. 2001;120: Rutgeerts P, Vermeire S. Serological diagnosis of inflammatory bowel disease Lancet. 2000;356; Peeters M et al. Diagnostic value of Anti-Saccharomyces cerevisiae and antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in inflammatory bowel disease. Am J Gastroenterol.2001;6: Quinton J-F et al Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies combined with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role Gut.18;42: Joossens S et al. The value of serologic markers in indeterminate colitis: a prospective follow-up study. Gastroenterology. 2002;122: Conrad K et al. Serological differentiation of inflammatory bowel diseases. Eur J Gastroenterol Hepatol 2002 ;14: Damoiseaux JGMC et al. Diagnostic value of anti-saccharomyces cerevisiae and antineutrophil cytoplasmic antibodies for inflammatory bowel disease: high prevalence in patients with celiac disease. J Clin Immunology. 2002;22: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Muratori P, Muratori L, Guidi M, Maccariello S, Pappas G, Ferrari R, Gionchetti P, Campieri M, Bianchi FB.Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) and autoimmune liver diseases. Clin exp Med : Riente L, Chimenti D, Pratesi F, Delle Sedie A, Tommasi S, Tommasi C, Bombardieri S, Migliorini P.Antibodies to tissue transglutaminase and Saccharomyces cerevisiae in ankylosing spondylitis and psoriatic arthritis. J Rheumatol :5: ESQUEMA DA MICROPLACA Ver na última página das instruções de uso, sff. Doença Hepatite autoimune 23% tipo 1 (7/30) Hepatite autoimune 11% tipo 2 (4/37) Cirrose biliar 7% primária (7/6) AMA* positiva Cirrose biliar 35% primária (6/17) AMA* negativa Colangite primária 28% esclerosante (7/25) Espondilite 12% anquilose (5/43) Artrite psoriatica 5% (4/75) Artrite Reumatóide % (8/7) Doença celíaca 32% (12/37) *AMA, anticorpos anti-mitocondrial..6 SENSIBILIDADE ANALITICA 20% (6/30) 5% (2/37) 16% (17/6) 35% (6/17) 32% (8/25) 23% (/43) % (7/75) 18% (14/7) 30% (11/37) e IgG 17% (5/30) 5% (2/37) 4% (4/6) 18% (3/17) 16% (4/25) 1% (7/37) Ref. 7 Sumário do procedimento 1. Pipetar 0μL de cada calibrador, controlo e amostra diluída (1:0) nos poços. Lavar. 2. Adicionar 0μL de conjugado em cada poço. Lavar. 3. Adicionar 0μL de substrato em cada poço. 4. Adicionar 0μL de solução de paragem em cada poço. Ler as absorvências a 450nm. BINDAZYME é uma marca registada da The Binding Site Ltd. P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB. England A sensibilidade foi determinada calculando a concentração média + 2 DP dada por 20 determinações do diluente da amostra. Teste Sensibilidade 0,61 U/mL 0,3 U/mL.7 INTERVALO DE LEITURA O intervalo de leitura do teste é de 1,23-0 U/mL. Insert Codes: E053.P, Version: 20th July 2006, Page 4 of 5

5 Esquema da Microplaca A B C D E F G H Insert Codes: E053.P, Version: 20th July 2006, Page 5 of 5