KIT DE TESTE DE ELISA PARA BORDETELLA PERTUSSIS IgG-TP

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1 SSI BORDETELLA PERTUSSIS IgG-PT ELISA KIT for in vitro diagnostic use KIT DE TESTE DE ELISA PARA BORDETELLA PERTUSSIS IgG-TP para uso de diagnóstico in vitro Indicação O Bordetella pertussis IgG-PT ELISA Kit ( kit de teste de ELISA para Bordetella pertussis IgG-PT) do SSI Diagnostica é para uso unicamente de diagnóstico in vitro e serve para testes quantitativos na detecção dos anticorpos IgG contra a toxina pertussis (TP) pelo método de Ensaio de ligação Imune Enzimática (ELISA) em amostras de soros humanos. Descrição O Bordetella pertussis IgG-PT ELISA kit contém: 1 Microplaca (placa de microtitulação) Maxisorp ELISA (1 Maxisorp ELISA plate NUNC )- guarde a microplaca em temperatura 15 C a 25 C. 5 Películas de filme aderente para tapar a placa durante a incubação (5 Plate Seals NUNC )- guarde as películas em temperatura 15 C a 25 C. 75 µl da altamente purificada toxina pertussis (TP) µg/ml (Pertussis toxin µg/ml) * - conserve a toxina na temperatura de 2 C a 8 C. 50 µl do antissoro padrão humano ( Standard Human Antisserum) ( NIBSC padrão internacional PT IgG 335 UI/mL) para a construção da curva padrão. Conserve na temperatura de 2 C a 8 C. 16 ml de tampão de cobertura/recobrimento (Coating Buffer) que deve ser conservado na temperatura de 2 C a 8 C. 100 ml de tampão de lavagem (Wash Buffer) com concentração 10x- conserve o tampão de lavagem na temperatura 15 C a 25 C 2,5 g de leite em pó desnatado (Skim Milk Powder)- deve serconservado em temperatura 15 C a 25 C 100 µl de anticorpos conjugados coelho anti- humano IgG a horseradish peroxidase (HRP) (HRP Rabbit-Anti- Human IgG ) deve ser conservado na temperatura de 2 a 8 C 16 ml de ácido sulfúrico (1M) (Sulphuric Acid 1M) com solução de paragem (stop)- o ácido sulfúrico deve ser conservado ema temperatura 15 C a 25 C. 16 ml de um substrato TMB (TMB One Substrate) que deve ser conservado na temperatura de 2 C a 8 C. *Rotulado com o símbolo de material perigoso. Veja a folha de dados de segurança no site Príncipio A pertussis (coqueluche ou tosse espasmódica/seca/convulsiva/com guincho) é uma doença respiratória altamente infecciosa causada pela bactéria Bordetella pertussis que é patogênica exclusivamente para humanos. A coqueluche é mais comum em crianças que em adultos e é caracterizada por paroxismos de tosse espasmódica severa seguida de convulsão e/ou vômitos. A severidade e os sintomas clínicos da pertussis variam muito, mas as complicações mais severas tais como: apneia, encefalopatia e pneumonia são mais comuns em indivíduos menores de 1 ano de idade. Por isso, há incentivos de combater a doença com programas de vacinação contra a coqueluche (pertussis) nos primeiros meses de vida, onde a vacinação já se inicia com < 6 meses de idade. A imunidade após a vacinação dura de 4 a 12

2 anos. Tem sido observado mundialmente que vem crescendo o número de casos com pertussis em grupos de indivíduos mais velhos, isso é em crianças mais velhas e em adultos. Todavia os sintomas da infecção para indivíduos mais velhos são normalmente brandos, tendo como sintoma típico clínico tosse prolongada, a qual pode durar até 3 meses. Apesar dos sintomas da pertussis serem normalmente brandos nesses grupos de indivíduos (crianças mais velhas e adultos), é muito importante diagnosticar os casos de pertussis justamente nesses grupos de indivíduos, já que são eles frequentemente as fontes de transmissão da pertussis infantil. Sorologia da toxina pertussis no diagnóstico da Bordetella pertussis O diagnóstico definitivo da pertussis tem sido tradicionalmente feito por cultura da B. pertussis cultivada no meio de ágar Bordet-Gengou, contudo, esse método é relativamente insensitivo e vagaroso (o resultado pode durar até 1 semana). O método de reação em cadeia polimerase (RCP, conhecido como PCR) demostrou uma significante avanço tecnológico para diagnosticar a pertussis se comparado com o método de cultura. O PCR em tempo real é indicado para um diagnóstico rápido e definitivo especialmente em crianças na fase inicial da pertussis, sendo por tanto o método atualmente mais conhecido no mundo inteiro para diagnose de casos recentes da doença. A sorologia tem a grande vantagem por ser útil especialmente para diagnose em casos de pacientes com tosse prolongada. A toxina pertussis (TP) é específica para Bordetella pertussis e somente os anticorpos IgG são úteis para a diagnose da infecção. Grupos de indivíduos como crianças mais velhas e adultos, os quais frequentemente apresentam sintomas brandos da pertussis, procuram o atendimento médico após a primeira fase da doença. Considerando que os métodos de cultura e PCR são úteis apenas na primeira fase da doença (fase catarral), a diagnose da doença nesses grupos de indivíduos (crianças mais velhas e adultos) com esses dois métodos (cultura e PCR) são frequentemente ineficientes, sendo dessa forma a sorologia o método mais correto para fazer o diagnóstico nesse caso. O método sorológico combinado com o método de PCR aumenta claramente a quantidade de casos com diagnose correta. Mas vários estudos sobre comparações entre o método combinado de sorologia e o de PCR e o método unicamente de sorologia (IgG para TP) mostraram que em inúmeros casos a sorologia baseada como a única forma de medição é o melhor método de diagnose, em parte devido ao tempo (prazo) da amostragem. O B. pertussis IgG-PT ELISA Kit oferece um método capaz de analisar soros tratados com calor sem o risco de resultado falso positivo. Dados da Dinamarca usando o ponto de corte (cut-off) a 75 UI/ml mostraram sensibilidade de 81% e especificidade de 96%. O ponto de corte dever ser determinado em cada país/região, já que o nível geral de anticorpos pode variar entre populações. Contudo o ponto de corte num âmbito de 62 UI/mL a 125 UI/mL são frequentemente usadas no mundo inteiro. Limitação Não é possível a diagnose de indivíduos recentemente vacinados (< 2 anos). Não é possível fazer a avaliação do status da vacinação e/ou seus níveis protetivos pelo teste de ELISA. Não é possível também fazer a detecção de respostas dos anticorpos para B. parapertussis. Material necessário, mas não fornecido: Leitor (espectrofotômetro) de microplaca de ELISA de densidade ótica de 450nm e 620nm. Procedimento 1-Ordem das reações na microplaca (placa de micro titulação) de ELISA: O kit de teste de ELISA para Bordetella pertussis IgG-PT segue a tradicional ordem para o teste de ELISA que é: as 4 amostras de antissoros humano padrão, as amostras de pacientes que devem ser feitos em serie de duplicatas.

3 Exemplo da ordem das amostras e o controle branco na microplaca: Além do exemplo acima recomendamos também fazer pelos menos 4 duplicadas de amostras de pacientes ao mesmo tempo para aproveitar ainda mais o teste. 2. Preparação das Soluções: Solução A: solução de antígeno para cobertura (recobrimento) da microplaca A toxina de pertussis (Pertussis Toxin ou PT) é misturada com a solução fria de tampão de cobertura (Coating Buffer) para obtenção de uma concentração final de 0,6 µg/ml. A concentração está indicada no rótulo do produto (por exemplo: para obter uma concentração de 20 µl é necessário misturar 309 µg/ml de PT com 10,3 ml da solução tampão de cobertura). Solução B: solução de tampão de lavagem 100 ml de tampão de lavagem de concentração 10x (Wash Buffer) é misturado com 900mL de água deionizada é suficiente para 1 litro de solução de tampão de lavagem. Lavagem manual unicamente.. Solução C: solução de tampão bloqueador Misture O,5g de leite em pó desnatado (Skim Milk Powder) com 50 ml do tampão de lavagem (Wash Buffer), a mistura deve ser agitada durante 30 minutos. A solução C deve ser preparada e usada no mesmo dia da análise. Solução D: solução de tampão de diluição 20 ml do tampão bloqueador (solução C) é misturado com 180mL do tampão de lavagem (Wash Buffer). Pode ser adicionado para uma concentração final de 0,1% para uma inspeção visual melhor ao vermelho fenol. A solução D deve ser preparada e usada no mesmo dia da análise. Solução E: solução de anticorpos secundária O HRP de coelho anti- humano IgG (HRP labelled Rabbit Anti-Human IgG ) é diluído no fator de 1:2500 num tampão de lavagem (Wash Buffer), por exemplo: 10µL de HRP de coelho anti-humano IgG é adicionado a 25mL de tampão de lavagem. A solução E deve ser preparada e usada no mesmo dia da análise. Solução F: Solução de amostras de paciente Cada amostra de paciente deve ser diluída na solução tampão de diluição (solução D) no fator de 1:1000, o mínimo por amostra de paciente é de 5 µl. Solução G: Solução de Soro Padrão (controle) Humano Cada amostra de antissoro padrão (controle) humano (Standard Human Antiserum) deve ser diluída no tampão de diluição no fator de 1:1000. Dessa diluição são feitos duas séries de diluições de fatores: 1:2000,1:4000, 1:8000 e 1:16000.

4 3- ETAPAS DO TESTE DE ELISA: 1ª ETAPA Adicione 100 µl da solução A em cada poço da microplaca. Cubra a microplaca com a película e a coloque num saco plástico, em seguida a incuba (sem agita-la) durante 1 hora a +37 C. Alternativamente incuba a microplaca na temperatura ambiente durante a noite. Não se deve incuba-la na temperatura ambiente em 1 hora. poços (1 min. por vez) com 250 µl da solução B. 2ª ETAPA Adicione 200 µl da solução C em cada poço da microplaca. Incuba a microplaca (sem cobri-la e nem agitá-la) na temperatura ambiente durante 30 minutos. poços da placa (1min. por vez) com 250 µl da solução B. 3ª ETAPA Adicione 100 µl da Solução F (sol. amostra padrão) em cada um dos seus exclusivos poços. Adicione 100 µl da Solução G em cada um dos seus respectivos poços (Veja o exemplo da ordem reações na microplaca ELISA). Incuba a microplaca (sem cobri-la e nem agitá-la) durante 1 hora na temperatura ambiente. poços da placa (1 min. por vez.) com 250 µl da solução B. 4ª ETAPA Adicione 100 µl da Solução E (anticorpos secundário com HRP) em cada poço da microplaca. Incuba a microplaca cuidadosamente (sem cobri-la e nem agitá-la) durante 30 minutos na temperatura ambiente. poços (1 min. por vez) com 250 µl da solução B. 5ª ETAPA Adicione 100 µl do TMB One Substrate em cada poço da microplaca. Incuba a microplaca (sem cobri-la e nem agitá-la) durante precisamente 15 minutos na temperatura ambiente. 6ª ETAPA Adicione 100 µl de ácido sulfúrico 1M (Sulphuric Acid) em cada poço da microplaca. Coloque a microplaca num leitor (espectrofotômetro) de ELISA e leia o resultado de absorbência da reação dentro de 10 minutos. Calcule o resultado final da 620 absorbância encontrando o valor delta da densidade ótica OD ( OD= DO OD 450 ), isso é subtraia o valor de DO do valor de DO 650.

5 Calculação dos Resultados A equação de regressão da curva é usada para calcular a concentração de anticorpos IgG contra a toxina pertussis em amostra de paciente, baseando-se para isso no valor delta de densidade ótica ( DO) onde DO = OD DO 450. O ponto de corte (cut-off) de 75 UI/ml pode ser usado se não houver nenhum critério de valor especifico determinado no país. Exemplo da construção de uma curva padrão Um exemplo dos valores padrão de DO e da concentração correspondente em unidade internacional por ml (UI/ ml) pode ser os seguintes: Soro Padrão Concentracão DO 1) 1: ,5 1,43 2) 1: ,75 0,87 3) 1: ,88 0,5 4) 1: ,94 0,3 A curva padrão com a concentração como uma função de DO é mostrada abaixo. A linha de regressão dos pontos deve ser linear, a qual é encontrada usando a linha de tendência (UI/mL = A*OD^B). Concentrações devem ser calculadas usando a equação de regressão em vez da curva padrão gráfica. Standard curve (example) IU/mL y = 103,17x 1,3225 R² = 0, , OD Interpretações dos Resultados Os resultados são válidos se os valores do coeficiente de variância (CV%) em amostras duplicadas forem menores que 20%. Todavia valores de CV% maiores que 20% são aceitos se a diferença entre as amostras duplicadas forem menores que 0,05 de DO. Resultados com valores de DO acima de 2,0 ou abaixo de 0,1 estão fora do âmbito da curva padrão linear logarítmica, esses valores devem consequentemente ser interpretados como maiores que ou menores que correspondentes aos valores de UI/ml da curva padrão a esses dois valores de DO mencionados. Os pontos de corte (cut-off) usados na Dinamarca são: 75 UI/mL: Positivo para a infecção com B. pertussis 50 e < 75 UI/mL: Indeterminado < 50 UI/mL: Negativo Referencias bibliográficas Guiso, N., G. Berbers, N. K. Fry, Q. He, M. Riffelmann, and C. H. Wirsing von König. What to do and what not to do in serological diagnosis of pertussis: recommendations from EU reference laboratories. Eur J Clin Microbiol Infect Dis Mar;30(3): Dalby T, Seier-Petersen M, Kristiansen MP, Harboe ZB, Krogfelt KA. Problem solved: a modified enzyme-linked immunosorbent assay for detection of human antibodies to pertussis toxin eliminates false-positive results occurring at analysis of heat-treated sera. Diagn Microbiol Infect Dis Apr;63(4):354-60

6 Armazenamento e Prazo de Validade Os seguintes produtos: HRP Rabbit Anti-Human IgG, TMB-One Substrate, Coating Buffer, Human Antiserum e o Pertussis Toxin (PT) devem ser guardados na temperatura de refrigeração 2 C a 8 C. Os outros produtos de reagentes podem ser guardados em temperatura ambiente. O prazo de validade está impresso na embalagem. Advertencia: O B.pertussis IgG-PT ELISA kit não deve ser congelado. O kit de teste de ELISA para Bordetella pertussis IgG-PT deve ser descartado, se congelado. Certificado de Qualidade Os nossos produtos têm alta qualidade, eles são certificados de acordo com DS/EN ISO e DS/EN 9001, têm o certificado dinamarquês de qualidade para dispositivos médicos (DGM) e o rótulo de qualidade da União Europeia (CE). Informação e Solicitação dos Produtos Para solicitar os produtos contate, por gentileza, um dos nossos distribuidores no seu país ou visite o nosso web site: Para informações adicionais, por favor, nos contate: Statens Serum Institut SSI Diagnostica Herredsvejen Hillerød Dinamarca T F shop.ssi.dk 1ª Edição Agosto Based on 2 nd Edition. August

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