ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit REF M1990

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1 Sanquin Reagents Plesmanlaan CX Amsterdam The Netherlands Phone: Fax: Website: M1990 / January 2011 ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit REF M Dispositivo ELISA para análise quantitativa in vitro da lectina ligadora da manose no soro (ou plasma) humano (pt) Ab BLANC BUF CAL COAT CONJ pt Anticorpos contra Reagentes em branco Tampão Calibrador Cobertura Conjugado CONTROL DIL HUM MANNAN MOU SPE STOCK pt Controlo Diluição Humano Manano Ratinho Amostra Stock WASH pt Lavagem Gama - 1

2 pt I. Introdução A lectina ligadora da manose (MBL - Mannose binding lectin), também designada por proteína ligadora da manose ou do manano, é um factor importante na imunidade inata. A MBL pertence à classe das colectinas da superfamília da lectina tipo C, cuja função parece ser o reconhecimento do padrão na primeira linha de defesa no hospedeiro pré-imune. A MBL reconhece os padrões de carbohidratos que se encontram na superfície de um grande número de microrganismos patogénicos, incluindo bactérias, vírus, protozoários e fungos (1,2,3). A ligação da MBL a um microrganismo resulta na activação do complemento pela via clássica, muito antes de se formarem anticorpos específicos. A MBL possui uma estrutura oligomérica ( kda), composta por subunidades que contêm três cadeias peptídicas idênticas, de 32 kda cada. Embora a MBL possa formar diversos oligómeros, existem indícios de que os dímeros e trímeros não são biologicamente activos e que é necessário, no mínimo, a forma tetramero para a activação do complemento. As cadeias peptídicas são compostas por uma parte do tipo colagénio e por uma parte de lectina. A parte de lectina liga-se através dos "domínios de reconhecimento de carbohidratos" (CRDs - carbohydrate recognition domains) a diferentes grupos de açúcares como a manose, a maltose, a N-acetilglicosamina, a N-acetilgalactosamina, a fucose e a glucose. Esta ligação possui baixa afinidade (Kd 10-3 ) e é essencial que mais do que uma parte de lectina duma molécula MBL se ligue simultaneamente para se obter uma ligação funcional (4). Em circulação, a MBL forma um complexo funcional com MASPs (serina protease associada à lectina ligadora da MBL) 1, 2 e 3, que se torna enzimaticamente activa, após a sua ligação a um microrganismo. A MASP-2 é idêntica à esterase C1 na activação do complemento pela via clássica, provocando a clivagem entre C4 e C2, o que dá origem à formação de C4b2a. A C4b2a actua como convertase C3 e provoca a clivagem da C3 e a consequente formação de C3b, o que por sua vez causa a opsonização do micróbio (2). Existem ainda indícios de que a MBL se liga directamente aos receptores da colectina existentes na superfície dos fagócitos, tendo sido sugerido que a MBL se liga ao receptor C1q dos granulócitos, monócitos e macrófagos neutrófilos. A ligação às células efectoras pode estimular a produção de citoquinas pró-inflamatórias. A MBL é uma proteína de fase aguda sintetizada pelos hepatócitos. Imediatamente após o parto, a concentração de MBL no plasma aumenta de 1000 ng/ml até um máximo de 2500 ng/ml, no espaço de algumas semanas, descendo posteriormente a concentração para o nível de 1700 ng/ml nos adultos. As concentrações individuais de MBL variam consideravelmente e podem aumentar até vinte vezes durante uma reacção de fase aguda. Na qualidade de componente do sistema imunitário inato, a MBL é importante no período subsequente ao parto, quando as concentrações de anticorpos maternos descem e a autoprodução de IgG tem que se iniciar. A MBL desempenha ainda um papel importante em qualquer idade aquando do contacto primário com microrganismos, antes do aumento das concentrações de IgM. Importância clínica da MBL A incidência da deficiência de MBL é relativamente elevada, comparativamente a outras deficiências do sistema do complemento, em cerca de 20 a 25% do total da população. A deficiência de MBL está associada à crescente susceptibilidade para infecções, tais como otite média, pneumonia, gastroenterite, meningite, osteomielite e sepsis. Nas crianças, a mutação do gene MBL heterozigótico duplica o risco de hospitalização devido a doença infecciosa, comparativamente a crianças com níveis normais de MBL. Em caso de mutação do gene heterozigótico, o risco de infecções é ainda superior e a evolução da doença é pior comparativamente a doentes com níveis normais de MBL. Doentes com fibrose cística que sofram uma mutação do gene MBL apresentam maior susceptibilidade para infecções por Pseudomonas aeruginosa ou Burkholderia cepacia e têm uma esperança de vida menor do que os doentes com fibrose cística sem mutação (5). Os doentes oncológicos sujeitos a quimioterapia e que desenvolvam neutropenia em consequência do tratamento, apresentam maior susceptibilidade para períodos longos de febre se tiverem concentrações baixas de MBL. Nas crianças com menos de um ano de idade que sofram da doença de Kawasaki, a deficiência de MBL constitui um factor de risco para aneurisma das veias coronárias. Nos doentes com HIV positivo, a progressão da SIDA ocorre mais rapidamente se existir uma deficiência da MBL. A deficiência de MBL está associada à repetição de abortos espontâneos, possivelmente devido a infecções intra-uterinas. A deficiência de MBL está associada às doenças autoimunes como o lúpus eritomatoso sistémico (SLE) e a artrite reumatóide (RA). A correlação entre a deficiência de MBL e a incidência destas duas infecções e doenças autoimunes levou a um aumento no diagnóstico da MBL e demonstrou a necessidade da aplicação terapêutica de MBL purificada. II. Princípio técnico Trata-se de um teste em formato ELISA, efectuado em microrecipientes cobertos com manano. A MBL presente num volume medido de amostra ou calibrador ligar-se-á ao manano coberto na placa de microtitulação. Os componentes não ligados são removidos por lavagem. Em seguida, será adicionado um anticorpo de MBL (MBL/1-HRP anti-humano) conjugado com peroxidase de rábano (HRP). Após a remoção por lavagem do conjugado não ligado de HRP, é adicionada solução substrato aos recipientes. A cor que se desenvolve é proporcional à quantidade de MBL presente na amostra ou no calibrador. A reacção enzimática é interrompida quimicamente e a intensidade da cor é lida aos 450 nm num leitor ELISA. A partir da absorvência das amostras e da curva de calibração, a concentração de MBL é determinada por interpolação. III. Armazenamento e estabilidade O dispositivo MBL ELISA deve ser armazenado a uma temperatura entre -18 C e -32 C. O desempenho do dispositivo é garantido até à expiração do prazo de validade constante do rótulo. As condições de transporte podem diferir das condições de armazenamento. Não congelar e descongelar mais do que três vezes. IV. Conteúdo do dispositivo O dispositivo MBL ELISA contém material suficiente para 288 testes (três placas), incluindo calibradores, controlos e reagentes em branco. Consultar o quadro incluído no final do folheto na embalagem. O manano a ser utilizado como cobertura é purificado a partir da Saccharomyces cerevisiae. O anticorpo monoclonal foi purificado a partir de meio de cultura de tecido, utilizando cromatografia de coluna (troca de iões e cromatografia por afinidade). O calibrador e o soro de controlo são soros humanos. 2

3 V. Materiais adicionais necessários Materiais adicionais: Água destilada para diluição de tampões de lavagem, diluição e substrato. Copos, frascos e tubos necessários para a preparação de reagentes. Dispositivos de pipetagem para uma distribuição exacta de volumes. Um dispositivo de lavagem standard ELISA ou uma garrafa de esguicho de 500 ml, em plástico, para a lavagem automática ou manual das tiras. Um leitor ELISA standard para a medição da absorvência aos 450 nm. Papel milimétrico. Tampões e soluções adicionais: Tampão de cobertura: tampão carbonato/bicarbonato 0,1 M ph 9,6 Tampões e soluções para o desenvolvimento enzimático da cor: Tampão de substrato: tampão de acetato 0,11 M ph 5,5 Dissolver 15,0 g de acetato de sódio (CH3COONa.3H2O) em 800 ml de água destilada. Ajustar o ph a 5,5 com ácido acético glacial, adicionar água destilada até ao volume de 1 litro. Não adicionar quaisquer conservantes (por ex. mertiolato, azido sódico) pois isso poderia afectar a qualidade da evolução enzimática da cor. Solução stock 3,5,3',5'-tetrametilbenzidina (TMB): 6 mg/ml de TMB em DMSO. Dissolver 30 mg de 3,5,3',5'-tetrametilbenzidina (TMB) em 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Solução stock de peróxido de hidrogénio: solução H2O2 a 3% em água destilada. Solução de paragem: solução H2SO4 a 1,8 M em água destilada. Para uma placa de microtitulação, preparar 12 ml de solução de substrato juntando: 12 ml de tampão de substrato 200μL de solução stock de TMB 12μL de solução stock de H2O2 VI. Manipulação da amostra a testar Proceder à colheita de sangue de forma asséptica. O soro é a amostra preferencial, mas a heparina ou plasma anticoagulado com EDTA são igualmente adequados para uso no presente teste. No caso dos plasmas, deve ser adicionado 10 U/mL de heparina ao tampão de diluição. As amostras devem ser tão frescas quanto possível, ou ser armazenadas por congelação. VII. Protocolo de ensaio No dia do teste, aguardar até que todos os reagentes estejam à temperatura ambiente (18-25ºC) e misturar cuidadosamente. Evitar a formação de bolhas ou espuma. O tampão de diluição concentrado 5 vezes pode ser colocado num banho de água a 37 C e misturado normalmente. O calibrador e o controlo podem ser descongelados na mão. Centrifugar todos os frascos antes da utilização (1 minuto a 3000 g). Recomendamos que todas as diluições de amostras, controlos e calibradores sejam testadas em duplicado. Consultar o Quadro 4 no folheto da embalagem para sugestões de um esquema de placas Placa de microtitulação O dispositivo contém três placas de microtitulação. Consoante o número de amostras a testar, devem ser cobertas com manano uma ou mais placas no dia anterior à realização do teste. No dispositivo é fornecido manano em concentração de 100 vezes. O tampão de cobertura deve ser fresco. Adicionar 120 μl de manano a 12 ml de tampão de cobertura por placa de microtitulação. Adicionar 100 μl a todos os recipientes, cobrir a(s) placa(s) de microtitulação com a tampa e incubar durante a noite à temperatura ambiente (18 25 C). Tampões Calcular a quantidade de tampão de lavagem necessária e preparar uma solução de titulação de trabalho diluindo 20 vezes o tampão em água destilada (aproximadamente 300 ml por placa). O tampão de lavagem diluído deve ser armazenado a uma temperatura entre 2-8 C e permanece estável durante 1 semana. Tampão de diluição: Calcular a quantidade de tampão de diluição necessária e preparar uma solução de titulação de trabalho diluindo 5 vezes o tampão em água destilada. Preparação do calibrador e do controlo (in duplo) Para mais informações sobre as concentrações, consultar os Quadros 2 e 3 no folheto da embalagem. Descongelar o calibrador e o controlo segurando-os nas mãos e misturar cuidadosamente. Etiquetar quatro tubos, dois para o controlo (in duplo) e dois para o ponto de calibração mais elevado (350 ng/ml) (in duplo). Calibrador: Consultar o Quadro 1 do folheto informativo para mais informações sobre a preparação do ponto de calibração mais elevado. Etiquetar oito tubos, um tubo para cada diluição de curva de calibração (in duplo): 140; 56; 22,4 e 9,0 ng/ml. Em seguida, pipetar 150 μl de tampão de diluição para dentro desses tubos. Transferir 100 μl do tubo do ponto de calibração mais elevado para o segundo tubo, com a etiqueta 140 ng/ml, e misturar bem. Repetir a diluição em série mais três vezes adicionando 100 μl do tubo anterior de calibrador diluído aos 150 μl de diluente nos tubos etiquetados. A curva de calibração contém 350; 140; 56; 22,4; 9,0 ng/ml (in duplo). Usar tampão de diluição como reagente em branco (0 ng/ml). Controlo: Pipetar 380 μl de tampão de titulação de trabalho para os tubos de controlo (in duplo), adicionar 20 μl do controlo e misturar bem. 3

4 Preparação das amostras Diluir as amostras de teste 1:20 em tampão de diluição, semelhante ao soro de controlo. Para os resultados situados fora das gamas de valores indicadas (ver Quadro 1 do folheto informativo incluso), o teste deve ser repetido com uma diluição diferente da amostra a testar. 1. Primeira etapa de lavagem Aspirar a solução de manano dos recipientes da(s) placa(s) de microtitulação, encher por completo os recipientes (> 300 μl) com tampão de lavagem e rejeitar, repetir este processo três vezes. No final, os recipientes devem ser esvaziados por completo. O reagente subsequente deve ser adicionado de imediato, não devendo os recipientes ser deixados secos por um período de tempo prolongado. 2. Etapa da primeira incubação Adicionar 100 μl de calibrador diluído, de controlo e de amostras aos recipientes apropriados. Cobrir a placa com película aderente, agitar suavemente batendo no bordo da placa de microtitulação durante alguns segundos, para misturar o conteúdo de cada recipiente. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente (18-25ºC). Imediatamente antes da lavagem, preparar o reagente da incubação seguinte conforme descrito no ponto Segunda etapa de lavagem Aspirar o sobrenadante dos recipientes e lavar a placa conforme descrito no ponto Incubação com MBL-HRP anti-humano Diluir o conjugado 1:100. Adicionar 120 μl de conjugado de HRP a 12 ml de tampão de diluição por placa de microtitulação. Adicionar 100 μl a cada recipiente. Cobrir a placa com película aderente, agitar suavemente batendo no bordo da placa durante alguns segundos, para misturar o conteúdo de cada recipiente. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente (18-25ºC). Imediatamente antes da lavagem, preparar o reagente da incubação seguinte, substrato de TMB, conforme descrito no ponto V (Materiais adicionais necessários). 5. Terceira etapa de lavagem Aspirar o sobrenadante dos recipientes e lavar a placa conforme descrito no ponto Incubação com substrato de TMB Adicionar 100 μl de solução de substrato de TMB a todos os recipientes. Agitar suavemente batendo no bordo da placa de microtitulação durante alguns segundos, para misturar o conteúdo de cada recipiente. Incubar durante, no máximo, 30 minutos à temperatura ambiente (18-25ºC) num local escuro. Nota: A velocidade da evolução enzimática da cor é influenciada por muitos factores, incluindo a temperatura e a qualidade do TMB utilizado. 7. Reacção enzimática de paragem Adicionar 100 μl de solução de paragem a todos os recipientes. 8. Leitura da placa Ler num prazo de 30 minutos a 450 nm num leitor ELISA. VIII. Resultados e interpretação dos dados Registar a absorvência a 450 nm para cada recipiente e estabelecer a média dos valores dos duplicados. Para cada amostra, os duplicados não devem divergir mais do que 15% em relação ao valor médio. Se os duplicados apresentarem uma variação superior, o teste deverá ser repetido. Registar as absorvências médias dos calibradores (eixo y) versus a MBL correspondente ng/ml (eixo x) no papel milimétrico e desenhar a curva mais adequada. Os níveis de MBL no controlo devem situar-se dentro da(s) gama(s) de valor(es) indicada(s) no Quadro 3 do folheto informativo incluso. Para cada amostra, inserir o valor médio das absorvências na curva referência. As amostras a testar que apresentem uma absorvência média fora da gama de diluições da curva de referência devem ser adequadamente diluídas. IX. Gama de valores de ensaio Consultar o Quadro 1 do folheto informativo incluso para informações sobre as gamas de valores de ensaio específicas do dispositivo. X. Gamas de valores de referência As medições realizadas num grupo normal de dadores de sangue saudáveis na Holanda (n=244) permitiram obter os seguintes valores de MBL: percentil de 10% percentil de 25% percentil de 50% percentil de 75% percentil de 90% <0,04 μg/ml 0,4 μg/ml 1,1 μg/ml 2,0 μg/ml 3,3 μg/ml Como as gamas de valores de referência estão sujeitas à influência de muitas variáveis, que podem divergir em função da população investigada, cada laboratório deverá estabelecer a sua própria gama de valores de referência. XI. Características específicas de desempenho Reprodutibilidade Variação intra-ensaio: Duas diluições diferentes da mesma amostra de soro foram medidas onze vezes cada uma num único ensaio. Variação inter-ensaio: Em seis a dez ensaios diferentes, a quantidade de MBL foi medida em três amostras diferentes de soro. 4

5 Intra-ensaio Média Variação Diluição 1 (1:10) Diluição 2 (1:50) 1,46 μg/ml 1,53 μg/ml 6,0% 6,1% Inter-ensaio Média Variação Amostra 1 1,52 μg/ml 7,9% Amostra 2 1,49 μg/ml 4,8% Amostra 3 1,60 μg/ml 11,2% Nota: Os valores citados para as características de desempenho específico do teste representam os resultados típicos e não devem ser vistos como especificações para este dispositivo. Sensibilidade Este dispositivo possui um nível mínimo de detecção de 9,0 ng/ml e uma gama de concentração mensurável de 9,0 a 350 ng/ml. Nota: Os valores citados para a sensibilidade do teste representam os resultados típicos e não devem ser vistos como especificações para este dispositivo. Especificidade A ausência de reacção cruzada com outros componentes do plasma ou soro é apoiada pelo facto de as leituras indistinguíveis de zero serem obtidas em alguns dadores com deficiência de MBL, mas normais em todos os restantes parâmetros. Valores esperados Ver X (Gamas de valores de referência). XII. Restrições 1. O utilizador deve ter tido treino e estar familiarizado com os testes ELISA e com o procedimento de teste. 2. As amostras muito hemolisadas ou lipémicas devem ser rejeitadas. Podem ser obtidos resultados inesperados em amostras contendo factor reumatóide, níveis elevados de bilirrubina ou outros complexos imunes circulantes. Estas amostras devem ser analisadas por outro método. 3. As amostras que não se enquadrem na gama de valores devem ser repetidas utilizando diluições diferentes. 4. O aparecimento dum nível diminuído de MBL nunca pode fornecer um diagnóstico definitivo, devendo antes ser considerado como uma indicação para uma perturbação do sistema imunitário, exigindo o prosseguimento da investigação diagnóstica. 5. Utilize sempre soros de controlo para verificar a validade da curva de calibração. Quando o controlo não se enquadra na gama de valores, os resultados das amostras a testar não são fiáveis. O teste deverá ser repetido. 6. Os reagentes dos diferentes lotes não são permutáveis. 7. Não se devem misturar restos de reagentes (por ex. volume morto) com os conteúdos de frascos acabados de abrir. 8. As tampas e os frascos não são permutáveis. As tampas devem ser recolocadas nos frascos respectivos. 9. Se bem que o calibrador humano e os soros de controlo tenham sido testados para os marcadores de agentes transmissores de doenças específicas, de acordo com as directrizes da UE em vigor em matéria de Boas Práticas Médicas, e tidos como não reactivos, devem-se considerar todos os componentes de origem humana como potencialmente infecciosos. 10. Conservante: mertiolato 0,001%. 11. Utilizar novos selos para as placas em cada passo de fixação/incubação no ensaio ELISA, a fim de evitar uma contaminação cruzada. Não utilizar folha de alumínio. 12. Utilizar pontas de pipeta descartáveis para cada transferência, a fim de evitar contaminações cruzadas. 13. De cada vez que o kit for utilizado, devem ser preparadas diluições frescas de calibradores, conjugados e tampões. 14. Não utilizar outros reagentes ou placas de microtitulação para além dos que são fornecidos com o dispositivo. 15. O azido sódico inactiva HRP; não utilizar soluções com teor de azido sódico, nem adicionar azido sódico aos tampões fornecidos. Não utilizar mertiolato, pois isso poderia afectar a qualidade da evolução enzimática da cor. 16. A eliminação de resíduos deve ser tratada de acordo com o regulamento do seu laboratório. 17. Não deixar os recipientes destapados nem secar por um período de tempo prolongado entre as etapas de incubação. XIII. Bibliografia 1. Turner, M.W. (1996) Immunol Today 17: Gadjeva, M. Thiel, S. Jensenius, J.C. (2001) Curr Opin Immunol 13: Klabunde, J. et al (2002) Parasitol Res 88(2): Thielens, N.M. et al (2001) J Immunol 166: Garred, P. (1999) J Clin Invest 104: ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit μl COAT MANNAN STOCK 1: μl CAL μl CONTROL μl HRP MOU Ab HUM MBL CONJ 1: ml BUF DIL STOCK 1: ml BUF WASH STOCK 1: x8 WELL 10 SEALS 5