FRANK JAMES ARAÚJO PINHEIRO. QUEBRA DA DORMÊNCIA DE SEMENTES DE Stylosanthes humilis H.B.K. POR COMPOSTOS SELÊNICOS

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1 FRANK JAMES ARAÚJO PINHEIRO QUEBRA DA DORMÊNCIA DE SEMENTES DE Stylosnthes humilis H.B.K. POR COMPOSTOS SELÊNICOS Tese presentd à Universidde Federl de Viços, omo prte ds exigênis do Progrm de Pós-grdução em Fisiologi Vegetl, pr otenção do título de Dotor Sientie VIÇOSA MINAS GERAIS - BRASIL 24

2 Fih tlográfi preprd pr Seção de Ctlogção e Clssifição d Biliote Centrl d UFV T P654q 24 Pinheiro, Frnk Jmes Arújo, 196- Quer d dormêni de sementes de Stylosnthes humilis H.B.K. por ompostos selênios / Frnk Jmes Arújo Pinheiro. Viços : UFV, : il. ; 29m Inlui nexo Orientdor: Rimundo Sntos Brros Tese (Doutordo) Universidde Federl de Viços Referênis iliográfis: f Semente Dormêni. 2. Semente Efeito dos ompostos selênios. 3. Fisiologi vegetl. 4. Stylosnthes humilis. I Universidde Federl de Viços. II. Título CDD 2.ed

3 FRANK JAMES ARAÚJO PINHEIRO QUEBRA DA DORMÊNCIA DE SEMENTES DE Stylosnthes humilis H.B.K. POR COMPOSTOS SELÊNICOS Tese presentd à Universidde Federl de Viços, omo prte ds exigênis do Progrm de Pós-grdução em Fisiologi Vegetl, pr otenção do título de Dotor Sientie APROVADA: 29 de jneiro de 24 Prof. Luiz Edson Mot de Oliveir Prof. Mrelo Ehlers Loureiro Prof. Murílio Alves Moreir Prof. Rosne Mri de Aguir Eulydes Prof. Rimundo Sntos Brros

4 (Orientdor) A minh fmíli Isel Cristin Leão Pinheiro (espos) e Crolin Leão Pinheiro e Filipe Leão Pinheiro (filhos)

5 AGRADECIMENTOS A Deus, pel vid. Aos meus pis, irmãos e demis fmilires, pelo rinho e inentivo. À minh espos Isel Cristin Leão Pinheiro, pel inondiionl jud. À Universidde Federl de Rorim (UFRR), pel oportunidde de perfeiçomento e à Universidde Federl de Viços (UFV), que proporionou os meios pr relizção do urso de Pós-Grdução. À Cpes-PICDT, pel onessão d ols de estudo. Ao Professor Rimundo Sntos Brros, pel ompreensão e pelos ensinmentos. Aos Professores do Depto de Biologi Vegetl e outros Deptos reliondos o urso de Fisiologi Vegetl - UFV, e em espeil, Pulo Roerto Mosquim, Rolf Pushmnn e Fernndo Luíz Finger, pel mizde e ensinmentos. Aos Professores Simone Mri de Mores (Depto de Mtemáti) e Pulo Roerto Ceon (Depto de informáti ) d UFV, pelos ensinmentos. Aos migos do urso, pelo onvívio e olorção. Aos olegs de lortório, pel mizde e jud e, em espeil, Cludinéi Regin Pelni, Dims Mendes Rieiro, Alerto Mour de Cstro, Eline Cristin Crini e An Mri Mpeli. Aos estudntes de Iniição Científi Gustvo Augusto Moreir Guimrães e Tles Grino Coelho, pel mizde e jud. Aos servidores do Depto de Biologi Vegetl d UFV e, em espeil, Reginldo Custódio dos Sntos, José Mri Sores, José Antônio ds Grçs Cornélio, Oswldo dos Sntos Filho, Elizeth Alves Pen, Gerldo João d Silv, Crlos Rimundo Alves de Souz, Mri Merês de Souz Gomes, Antônio Teixeir Cordeiro, José Antônio Bhering e Rit de Cássi d Silv. A todos queles que diret ou indiretmente ontriuírm pr relizção deste trlho.

6 BIOGRAFIA DO AUTOR Frnk Jmes Arújo Pinheiro, filho de Leontino Mesquit Pinheiro e Ivnir Arújo Pinheiro, nseu em Bo Vist, Estdo de Rorim, no di 3 de ril de 196. Formdo omo Ténio em Edifições pel Esol Téni Federl do Amzons, período , Engenheiro Agrônomo pel Universidde Federl de Goiás, período , e Lienido em Ciênis (hilitção em Físi) pel Universidde Federl de Goiás, período Cursou Lienitur Plen de formção espeil do Curríulo do 2º Gru Esquem I, pel Universidde Federl do Amzons, período Espeilizou-se em Edução, n áre de Ciênis Biológis, pelo onvênio firmdo entre o Governo do Território Federl de Rorim e Universidde Federl do Cerá, período Cursou o Mestrdo em Biologi, n áre de Ciênis Fisiológis, pel Universidde Federl de Goiás, período Em 2, iniiou o urso de Doutordo em Fisiologi Vegetl n Universidde Federl de Viços.

7 RESUMO PINHEIRO, Frnk Jmes Arújo, D. S., Universidde Federl de Viços, Jneiro de 24. Quer d dormêni de sementes de Stylosnthes humilis H.B.K. por ompostos selênios. Orientdor: Rimundo Sntos Brros. Conselheiros: Fernndo Luíz Finger e Rolf Pushmnn A quer d dormêni fisiológi de sementes de estilosnte (Stylosnthes humilis H.B.K.), leguminos tropil forrgeir de ilo nul, foi promovid por diversos ompostos selênios. A exposição ds sementes dormentes esrifids os ompostos selênios em solução, por 18 h, foi sufiiente pr promoção de germinção ótim. So exposição prolongd ds sementes o selênio, oorreu redução d germinção, sugerindo oorrêni de dnos o emrião. Oservouse um trso de proximdmente 18 h pr o iníio do proesso germintivo estimuldo pelos ompostos selênios, em relção às sementes não-dormentes. Ns sementes trtds, germinção se ompletou om 36 h de inução. A germinção estimuld por Se foi iniid pelos iniidores d iossíntese de etileno minoetoxivinilgliin, Co 2+ e áido sísio e, tmém, por Ag +, iniidor d ção do reguldor. Os efeitos iniitórios dos loquedores d iossíntese do etileno form revertidos pelo áido 2-loroetilfosfônio ou pelo áido 1- roxílio-1-minoilopropno (ACC). A iniição provod por Ag + foi revertid por solução de HCl de ixo ph. O trtmento ds sementes dormentes om os ompostos selênios tmém provoou umento d produção de etileno, em níveis semelhntes os de sementes nãodormentes, orrelionndo-se om o umento d germinção. Níveis ltos de ACC livre form oservdos em sementes dormentes trtds om Se. Os pios de produção de ACC livre oinidirm om oorrêni ds miores txs de produção de etileno. O K m prente d oxidse do ACC in vitro, de 75 mmol m -3 de ACC, e o K m prente in vivo, de 44 mmol m -3 de ACC, mostrrm-se omptíveis om os d litertur. A tividde d oxidse do ACC foi iniid in vitro por áido α-minoisoutírio, áido sliílio, áido etil-sliílio e n-propil glto e, in vivo, por Co 2+ e n-propil glto. O Se fez umentr tividde d oxidse do ACC in vitro, orrelionndo-se tmém om o umento d germinção.

8 ABSTRACT PINHEIRO, Frnk Jmes Arújo, D. S., Universidde Federl de Viços, Jnury 24. Dormny rekge in seeds of Stylosntes humilis H.B.K. y selenium ompounds. Adviser: Rimundo Sntos Brros. Advisory Committee: Fernndo Luíz Finger nd Rolf Pushmnn Dormny rekge in response to severl selenium ompounds ws oserved in seeds of Townsville stylo (Stylosnthes humilis H.B.K.), n nnul tropil forge legume. Exposure of seeds to solutions of those ompounds for 18 h suffied to ttining n optiml germintion perentge. Prolonged exposures led to dereses in germintion inditing the ourrene of dmges to seed emryos. A dely of 18 h for the onset of germintion ourred in treted seeds in reltion to untreted non-dormnt seeds. The germintion proess of treted seeds took out 36 h inution time to omplete. Se-stimulted germintion ws loked y the inhiitors of ethylene iosynthesis 2-minoethoxyvinylglyine (AVG), Co 2+ nd sisi id (ABA) nd y Ag +, n inhiitor of ethylene tion. The inhiitory effets of AVG were reverted y 1- minoylopropne-1-roxyli id (ACC), nd those of Co 2+ nd ABA y 2- hloroethylphosphoni id; inhiition y Ag + ws reverted y low ph HCl solutions. Selenium ompounds indued lrge inrese in ethylene prodution in dormnt seeds tht ws omprle to the mounts emnted from non-dormnt seeds, nd whih showed orrelted to the inrese in their germintion. High mounts of free ACC were found in Se-treted seeds, their peks ourring simultneously with the highest rtes of ethylene emntion. In vitro pprent K m 75 mmol m -3 ACC nd in vivo pprent K m 44 mmol m -3 ACC for ACC oxidse were within the rnge found in the literture. In vitro tivity of ACC oxidse ws inhiited y α-minoisoutyri id, sliyli nd etylsliyli ids nd n-propyl gllte. Inhiition in vivo ws oserved with Co 2+ nd n-propyl gllte. Selenium ompounds lso used inreses in ACC oxidse tivity in vitro wih were ompnied y inreses in ethylene prodution nd germintion.

9 CONTEÚDO 1 INTRODUÇÃO Quer d dormêni de sementes pelo etileno Iniição d síntese e d ção do etileno Selênio em plnts Metolismo do selênio Selênio e germinção de sementes Inter-relções entre selênio e produção de etileno Biossíntese de etileno OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS Condições de ultivo e ensios de germinção Quer d dormêni por ompostos selênios Tempo de exposição soluções de ompostos selênios Ténis de tro ds soluções de ompostos selênios pel solução-ontrole Toxiidde dos ompostos selênios Cinéti d germinção ds sementes Iniição d síntese e d ção do etileno Reversão d ção dos iniidores em relção o efeito dos ompostos selênios Quntifição do etileno Quntifição do ACC Atividde d oxidse do ACC Iniição d tividde d oxidse do ACC Delinemento experimentl RESULTADOS E DISCUSSÃO Efeito dos ompostos selênios n quer d dormêni Efeito do tempo de exposição ds sementes os ompostos selênios Efeito ds ténis de tro d solução-teste Toxiidde dos ompostos selênios sore germinção e sorevivêni ds sementes Cinéti de germinção ds sementes Efeito dos iniidores d síntese e d ção do etileno em relção os ompostos

10 selênios Reversão do efeito dos iniidores Produção de etileno por sementes de estilosnte Efeito dos ompostos selênios n produção de etileno Produção de etileno por sementes dormentes estimulds por seleno-l-metionin e seleno-dl-etionin Níveis de ACC livre em relção à germinção de sementes dormentes exposts os ompostos selênios Níveis de ACC onjugdo e totl em sementes dormentes exposts os ompostos selênios Crterizção d tividde d oxidse do ACC in vitro Cinéti d oxidse do ACC in vitro Iniição d tividde d oxidse do ACC in vitro Cinéti d oxidse do ACC in vivo Efeito de iniidores d tividde d oxidse do ACC sore produção de etileno in vivo Efeito do ACC n solução de germinção sore tividde d oxidse do ACC in vitro Efeito do tempo de exposição o ACC n solução de germinção sore tividde d oxidse do ACC in vitro Atividde d oxidse do ACC in vitro em sementes dormentes trtds om ompostos selênios Atividde in vivo d oxidse do ACC em sementes dormentes trtds om ompostos selênios CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 74

11 1 INTRODUÇÃO Leguminos tropil de ilo nul, o estilosnte (Stylosnthes humilis H.B.K.) destse omo importnte espéie n formção de pstgens (Mott et l 1976, Thoms e Sumerg 1995). O gênero Stylosnthes (Leguminose-Ppilionoide) é originário de regiões tropiis d Améri do Sul e Centrl, onde mostr mpl distriuição geográfi e extens vriilidde genéti. Como plnt forrgeir, foi iniilmente introduzid n Austráli, pís de desenvolvimento ds primeirs ultivres de S. guinensis e S. humilis (Hopkinson e Wlker 1984). No Brsil, pode ser enontrdo ns regiões entrl e nordeste (Lovto et l 1994), espndo ds estções ses pel dormêni de sus sementes (Lovto et l 1999). Adpt-se em os solos de ix fertilidde e ixo ph, omo os do Cerrdo (Crvlho et l 1988). A germinção ds sementes de estilosnte é reguld por dois menismos, um de nturez tegumentr e outro de dormêni fisiológi, estrtégis que grntem sorevivêni d espéie, impedindo germinção qundo s ondições de resimento d plântul são desfvoráveis (Argel e Humpreys 1983). A rreir tegumentr difiult entrd de gses e águ no emrião (Grdener 1975), e pode ser querd filmente por esrifição físi ou quími ds sementes (Arújo et l 2). A dormêni fisiológi ds sementes de estilosnte é muito entud logo pós su mturção e vi sendo perdid grdulmente, té tornrem-se ompletmente germináveis, em torno de meses pós olheit (Vieir e Brros 1994). 1.1 Quer d dormêni de sementes pelo etileno A dormêni de sementes de lgums espéies pode ser querd pelo etileno, omo em mendoim (Arhis hypoge) vr Virgíni (Ketring e Morgn 197) e vr Ntl Comum (Whitehed e Nelson 1992), lfe (Ltu stiv) vr Grng Rpids (Aeles 1986), Amrnthus udtus L. (Kępzyński 1986), Chenopodium lum (Mhée e Sini 1991) e Cylopi spp. (Whitehed e Sutliffe 1995). As sementes desss espéies germinm qundo dquirem pidde de sintetizr o etileno ou qundo sumetids trtmentos que, possivelmente, tmém umentem su sensiilidde o reguldor (Whitehed e Sutliffe 1995). A dormêni fisiológi ds sementes de estilosnte é querd por ondições de estresse omo lts temperturs (Holm 1973), metis pesdos, omo ádmio, zino e ore (Deltorre e Brros 1996), tiouréi em elevds onentrções (Burin et l 1987), e ixo ph do meio de germinção (Frigeri 1998, Pelni 21). Com os resultdos de mnipulção dos ompostos áido 2-loroetilfosfônio (Ethrel, que lier etileno no meio elulr) e enzildenin (BA), plidos omindos ou seprdmente, Burin et l (1987) e Vieir e Brros (1994) sugerirm que um itoinin e o etileno serim neessários pr querr dormêni de sementes de estilosnte. O áido 1-roxílio-1-minoilopropno (ACC), preursor imedito do etileno 1

12 em su rot iossintéti, tmém quer prilmente dormêni (Brros e Deltorre 1998). Íons prt, ntgonists d ção do etileno (Knee 1992), loqueim germinção de sementes não-dormentes (Vieir e Brros 1994, Deltorre et l 1997). Em onjunto, esses ftos sugerem que promoção d germinção de sementes de estilosnte oorre vi estímulo d produção de etileno. Assim, sementes reém-olhids de estilosnte provvelmente não germinm pel flt ou ix pidde de produção de etileno, omo tmém ontee om Amrnthus udtus (Kępzyński e Kępzyńsk 1997). 1.2 Iniição d síntese e d ção do etileno O estímulo à germinção em sementes não-dormentes é loquedo por iniidores que fetm iossíntese e ção fisiológi do etileno. Iniidores omo minoetoxivinilgliin (AVG) (Kępzyński 1986) e áido minooxiétio (AOA) (Sinsk e Gldon 1989), que iniem tividde d sintse do ACC (EC ), e Co 2+ (Gllrdo et l 1994, Vieir e Brros 1994), Zn 2+ (De Rued et l 1995) e áido α-mino-isoutírio (AMIB) (Stoh e Esshi 198, Frigeri 1998), que iniem tividde d oxidse do ACC (EC 1.4.3), são ons indidores pr inferirse se quer d dormêni e germinção de sementes oorrem em função d iossíntese de etileno. A ção fisiológi do etileno é iniid por 2,5-nororndieno (Wng e Woodson 1989, Kępzyński e Kępzyńsk 1997, Whitehed e Sutliffe 1995) e 1-metililopropeno (Sisler e Serek 1997), possivelmente por se ligrem sítios reeptores de etileno (Kluge et l 22), exerendo um ção ompetitiv om o reguldor, e tmém por Ag + (Aeles 1986), que loqueim ligção do etileno os seus reeptores (Aeles et l 1992). Ms o menismo de iniição não é onheido; os íons prt poderim estr gindo medinte um sustituição dos íons ore nos sítios de ligção do etileno do reeptor trnsmemrânio ETR do etileno (Srivstv 22). Em sementes dormentes de estilosnte, Ag + iniiu germinção estimuld por Ethrel (Vieir e Brros 1994), por metis pesdos (Deltorre e Brros 1996) e por soluções de ixos ph(s) (Frigeri 1998, Pelni 21), indindo o requerimento do etileno n quer d dormêni ds sementes dess leguminos. 1.3 Selênio em plnts A seleno-metionin provoou quer d dormêni de sementes de estilosnte (Brros e Freits 2, 21), possivelmente por desender iossíntese de etileno, devido às ondições de estresse promovids pelo seleno-minoáido, um vez que ondições de estresse estimulm iossíntese de etileno em plnts (Yng e Hoffmn 1984, Morgn e Drew 1997). Os selenominoáidos seleno-etionin e seleno-metionin form mis efiientes do que própri 2

13 metionin em estimulr produção de etileno em teidos floris de Ipomoe triolor Cv (Konze et l 1978), devido o umento de su iossíntese (Konze e Kende 1979), possivelmente por servirem tmém omo preursores do etileno (Konze et l 1978). As plnts diferem muito n su hilidde em umulr selênio em seus teidos (Virupksh e Shrift 1965, Shrift 1969). Certs plnts são pzes de hiperumulr selênio n prte ére, qundo resem em solos seleníferos. Esss plnts são umuldors de selênio e inluem espéies dos gêneros Astrglus, Stnley, Morind, Neptuni, Oonopsis e Xylorhiz, e podem umulr entens milhres de miligrms de selênio kg -1 de mss se (MS) nos teidos. Por outro ldo, muits forrgeirs e outrs plnts ultivds, priniplmente grmínes, umulm menos de 25 mg selênio kg -1 MS, não exiindo mis que 1 mg de selênio kg -1 MS, qundo ultivds em solos seleníferos. Por isso, são hmds não-umuldors de selênio. Plnts ultivds resids em solos não-seleníferos exiem níveis de selênio entre,1 e 1 mg de selênio kg -1 MS. Emor s espéies umuldors de selênio sejm dptds solos seleníferos, nem tods s espéies de plnts que vivem nesses solos são umuldors de selênio. Algums umulm somente pouos miligrms de selênio kg -1 MS. Por exemplo, no gênero Astrglus, espéies umuldors e não-umuldors podem reser próxims ums ds outrs. Em solos seleníferos, por exemplo, Astrglus isultus exiiu 553, Stnley pinnt 119, Atriplex nuttllii 3 e grmínes 23 mg de selênio kg -1 MS (Terry et l 2). 1.4 Metolismo do selênio Emor o selênio não sej um nutriente essenil às plnts superiores, selenominoáidos, seleno-proteíns e outros ompostos selênios, em lgums espéies, são enontrdos em grndes quntiddes (Welh et l 1991) e ofereem proteção ontr herivori por lrgts e infeção por fungos (Hnson et l 23), ms nenhum função essenil do selênio em plnts foi ind identifid. Em nimis, essenilidde do selênio, em quntiddes trço, é em esteleid (Stdmn 199, Terry et l 2). Ns éluls nimis, o selênio ontriui om qutro átomos pr formção d moléul d peroxidse d gluttion (GSH-Px) (Miller et l 1991). A enzim é mplmente distriuíd, no reino niml e protege s memrns elulres ontr dnos peroxidtivos (Whnger et l 1977, Stdmn 1979), destruindo os peróxidos (H 2 O 2 ) e hidroperóxidos, no itossol e n mtriz mitoondril (Miller et l 1991). No reino vegetl, tividde d GSH-Px foi detetd em pous espéies (Smith e Shrift 1979). O selênio só pssou despertr interesse ientífio pós desoert de seus efeitos tóxios, ms, tulmente, é reonheido omo um mironutriente essenil pr mmíferos, pássros e váris téris. Entre s diverss doençs usds pel defiiêni nutriionl de 3

14 selênio em nimis, dest-se distrofi musulr, onheid omo doenç do músulo rno, que tinge rneiros e ezerros jovens (Stdmn 1979), frequente em regiões de lt pluviosidde d Nov Zelândi, onde quntidde de selênio ns plnts forrgeirs é ix e está orreliond om o ixo onteúdo do elemento no solo (Whnger et l 1977). As plnts umuldors de selênio possuem um menismo diferente de disriminção do sustrto n fse de tivção do seleno-minoáido (Burnell 1981). Durnte síntese protéi, s éluls ds plnts umuldors exluem o seleno-minoáido de seus polipeptídeos (Brown e Shrift 1981), por um proesso que impede síntese ou provo um modifição do seleno-minoáido, loquendo su inorporção em proteíns (Eustie et l 1981). A umulção do selênio tmém pode se dr por omprtimentlizção dentro do vúolo (Neuhierl e Bök 1996), omo selento, ou n form de seleno-minoáido não-protéio (Läuhli 1993, Terry et l 2). O menismo usdo pels plnts umuldors pr tolerr lts quntiddes de selênio em seus teidos é impedir inorporção de seleno-minoáidos em proteíns. Esse menismo não pode ser usdo pels plnts não-umuldors, pois não possuem um sistem enzimátio pz de disriminr os minoáidos que possuem selênio (Neuhierl et l 1999). Por isso, podem inorporr grndes quntiddes de seleno-minoáidos em proteíns, o que result em toxiidde (Burnell 1981). Poderi oorrer tmém um derésimo n formção d ligção peptídi, que resultri em diminuição d síntese de proteín (Eustie et l 1981). Os prinipis seleno-minoáidos inorpordos em proteíns são seleno-isteín e selenometionin, em sustituição à isteín e à metionin, respetivmente. As diferençs em tmnho e proprieddes de ionizção do enxofre e selênio podem produzir lterções signifitivs n estrutur ds proteíns, reduzindo ssim su tividde (Läuhli 1993). A ligção entre dois átomos de selênio é proximdmente um sétimo mior e um quinto mis fr do que ligção dissulfídri, lém de poder interferir n formção de pontes dissulfídris, resultndo em um leve, ms signifinte lterção, n estrutur teriári ds S-proteíns, levndo efeitos negtivos sore su tividde tlíti (Terry et l 2). 1.5 Selênio e germinção de sementes Os efeitos do selênio sore germinção form estuddos em sementes de Vign rdit e revelrm-se enéfios sore o resimento e tividde metóli de enzims hidrolítis, qundo s sementes form exposts o elemento em nível de,75 ppm (Llith e Eswri 1995). N leguminos Trigonell foenum-greum, selenito de sódio,5 ppm tmém fez umentr tividde ds enzims β-gltosidse e β-gliosidse, ms em nível de 1, ppm foi levemente 4

15 tóxio pr o resimento ds plântuls e reduziu tividde ds dus enzims em 6 % (Sreekl e Llith 1998). Por outro ldo, o selênio não estimulou germinção de sementes de repolho (Brssi olere vr pitt), lfe, rnete (Rphnus stivus vr rdíul Perzoon), dus vrieddes de sorgo (Sorghum vulgre sudnense Hith vrs Du-L-Grze e Sugr-Grze) e trigo (Tritium estivum vr Cldwell), trtds om selento ou selenito de sódio té onentrção de 45 mmol m -3 selênio, em ph 5,. O resimento iniil d rdíul foi dependente d espéie d plnt, d form do selênio e d onentrção plid (Crlson et l 1989). A emeição ds sementes de dus ultivres de ç-mrg (Momordi hrnti) vs Speil Six e Moon Shine em solução de selenito de sódio (,1 mol m -3 ), mntids so tempertur su-ótims (2 C), fez resturr o poder germintivo ds sementes (Chen e Sung 21). 1.6 Inter-relções entre selênio e produção de etileno Seleno-minoáidos, n-propil glto, 1,4-dizoiilo(2,2,2)otno e vitmin E, por serem extintores de oxigênio singleto e iniirem peroxidção de lipídios, são onsiderdos protetores d élul (Tppel 1965, Ounnès e Wilson 1968, Mttoo et l 1986). Como extintor dos rdiis livres, seleno-metionin protege s memrns elulres interns ontr o tque de gentes peroxidtivos, o mesmo tempo que inie produção de etileno induzid por íons ore n plnt quáti Spirodel oligorrhiz (Mttoo et l 1986, 1992). Contrrimente, qundo disos folires de fumo (Niotin tum Xnthi ) sumetidos o trtmento om CuSO 4 (Mttoo et l 1992), segmentos estioldos de hstes de ervilh (Pisum stivum L. Alsk ) trtdos om uxin (Konze et l 1978), e teidos senesentes de otão florl de Ipomoe triolor Hevenly Blue (Konze e Kende 1979), form inudos om selenometionin e, oservou-se iossíntese de etileno, vi rot do ACC (Mttoo et l 1992). Considerndo-se que o etileno pode ser produzido prtir d peroxidção de lipídios, pel formção de rdiis livres, o emprego de extintores de rdiis livres, omo selenometionin, pode uxilir n identifição d rot iosíntéti do etileno em plnts. N germinção de sementes, por exemplo, o selênio possivelmente tue desendendo iossíntese de etileno (Jones e Kende 1979). A dição de iniidores d iossíntese ou d ção do etileno impediu germinção em sementes dormentes de estilosnte trtds om seleno-metionin (Brros e Freits 2, 21). Assim, o emprego de seleno-metionin e de outros ompostos selênios torn-se um om instrumento pr vlirem-se os efeitos do selênio n quer d dormêni de sementes de estilosnte. 5

16 1.7 Biossíntese de etileno Existem evidênis (Osorne 1984, Aeles et l 1992) de que, em lguns grupos de plnts, tis omo pteridófits e gimnosperms e, priniplmente em espéies não-vsulres e menos evoluíds, omo s riófits, opere um rot de iossíntese do etileno, n qul o ACC não seri onvertido em etileno, ujo menismo é desonheido e diferente d rot oorrente ns plnts superiores (Hyodo e Uritni 1984, Osorne et l 1996). Exeto ns plnts ns quis pree ter oorrido perd d enzim oxidse do ACC o longo do proesso evolutivo, tods s plnts terrestres produzem e respondem o etileno om mudnçs definids no resimento e desenvolvimento (John 1997). O etileno é rpidmente sintetizdo prtir de um mpl vriedde de preursores, espeilmente durnte ruptur de estruturs elulres, possivelmente gindo nos menismos de defes d plnt. Isso sugere que su ção, omo reguldor iológio, teve origem nos primórdios d evolução ds plnts terrestres em respost os sinis de estresse, pois é rpidmente difundido e está ssoido à desintegrção elulr (John 1997, Reynolds e John 2). Ns plnts vsulres, oper um rot iosintéti em que enzim sintse do ACC desempenh um ppel entrl e regultório n produção do ACC, intermediário e preursor imedito do etileno (Flur e Mttoo 1996). O etileno é derivdo do minoáido metionin, que é onvertido pr S-denosil-L-metionin (SAM), por ção d sintse do SAM (EC ) que, por su vez, é onvertido em ACC, pel ção d sintse do ACC (Yng e Hoffmn 1984, Kende 1993). A etp finl d iossíntese do etileno em plnts superiores se dá vi onversão do ACC em etileno, tlisd pel enzim onstitutiv oxidse do ACC. A seleno-metionin foi mis efiiente em estimulr iossíntese de etileno, em teidos floris de Ipomoe triolor Cv, do que metionin, possivelmente por servir omo preursor do etileno de form mis efiiente que o seu preursor nturl (Konze et l 1978). O estímulo d iossíntese de etileno pode tmém resultr de ondições de estresse, omo oorre em plnts de tomte e óor exposts sis em lts onentrções (Morgn e Drew 1997), e sementes de lfe, que produzem grnde quntidde de etileno e presentm mior germinção qundo exposts ondições de estresse osmótio (Prusinski e Khn 199). Em sementes de estilosnte, germinção estimuld por seleno-metionin provvelmente dispr iossíntese de etileno (Brros e Freits 21), restndo ser se esse fenômeno pode tmém oorrer em respost outros ompostos selênios e o modo de tução desses ompostos. 2 OBJETIVOS Este trlho ojetivou investigr ção de ompostos selênios sore germinção de sementes dormentes de estilosnte, exminndo-se sus inter-relções om rot iossintéti do etileno, vi produção de ACC. 6

17 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Condições de ultivo e ensios de germinção Plnts de estilosnte form ultivds ontinudmente em s de vegetção, n Universidde Federl de Viços, Viços (2º 45 S e 42º 52 W, 648 m de ltitude), Mins Geris, Brsil, em vsos plástios om pidde de 3,5 dm 3, ontendo dus prtes de solo tipo ltossolo vermelho mrelo, um prte de rei e um prte de estero ovino urtido. A dução foi de,5 g vso -1 de N-P-K (25-5-2), plidos por oertur em três prels, durnte o ilo de vid d plnt. A irrigção foi feit dirimente, de form mnter-se o solo próximo à pidde de mpo. Por ser o estilosnte espéie de di urto (Cmeron e t Mnnetje 1977), nos meses de dezemro mrço, s plnts form oerts om empnd pret, reduzindo-se, ssim, o fotoperíodo pr oito hors diáris, pr promoção d indução florl. Os frutos erm oletdos periodimente, levdos pr o lortório e rmzendos em sos de ppel té exeução dos ensios. Dess form, sementes de diferentes iddes, isto é, om diferentes grus de dormêni, enontrvm-se sempre disponíveis. Pr relizção dos ensios, os frutos form previmente deulhdos, por frição entre dus superfíies emorrhds e, em seguid, s sementes erm esrifids por leve frição entre dus lixs d águ nº 15. Após esrifição, s sementes form trtds om hipolorito de sódio,5 %, por 1 min, e lvds exustivmente om águ destild. As sustânis testds form dissolvids em solução de HCl-KOH, 1 mol m -3, ph 7, ontendo Tween 8,5 %. As sementes erm infiltrds om s soluções-teste (1 m 3 ), pel plição de váuo, por um período de 4 min, seguido de um intervlo de 3 min, sem váuo, e de mis 3 min de váuo (Vieir e Brros 1994). Após infiltrção, s sementes, juntmente om s soluções-teste, erm trnsferids pr pls de Petri (9 mm de diâmetro), ontendo o fundo dois disos de ppel de filtro Whtmn nº 1; este onjunto er previmente semi-esterelizdo em estuf, 15 C, por 4 h. As pls de Petri, ontendo s sementes e s respetivs soluçõesteste, erm mntids no esuro, em âmr de resimento noite/di (Form Sientifi, In, Ohio, USA), 3 C (Burin et l 1987), por um período de ino dis, durnte o qul er registrdo, dirimente, o número de sementes germinds. A semente er onsiderd germind qundo presentv protrusão rdiulr. 3.2 Quer d dormêni por ompostos selênios A quer d dormêni por ompostos selênios foi relizd expondo-se sementes dormentes de estilosnte soluções dos seguintes ompostos: selento de sódio (N 2 SeO 4 ), selenito de sódio (N 2 SeO 3 ), áido selênio (H 2 SeO 4 ), áido selenoso (H 2 SeO 3 ), selenouréi 7

18 (CH 4 N 2 Se), seleno-dl-metionin (ou seleno-l-metionin - C 5 H 11 NO 2 Se), tetrloreto de selênio (SeCl 4 ) e dióxido de selênio (SeO 2 ), vrindo-se onentrção iniilmente d ordem de 1 vezes, n fix de 1 mol m -3. Determind onentrção de d omposto que proporionou mior germinção, testrm-se níveis miores e menores em torno do nível seleiondo. A onentrção, de d omposto selênio que promoveu mior quer d dormêni fisiológi ds sementes foi onsiderd ótim e seleiond pr os trlhos seguintes. As dus forms de seleno-metionin, seleno-dl-metionin e seleno-l-metionin, não mostrrm diferençs n promoção d germinção de sementes dormente e, omo hvi mior disponiilidde d segund, miori dos experimentos foi relizd om el. 3.3 Tempo de exposição soluções de ompostos selênios Pr determinr-se o tempo mínimo de exposição neessário pr promover-se quer d dormêni, s sementes dormentes form exposts às soluções-teste dos ompostos selênios, ns onentrções ótims, pelos períodos de, 6, 9, 12, 18, 24, 48 e 12 h. No trtmentoontrole não houve imersão ds sementes ns soluções de ompostos selênios, enqunto o trtmento h onsistiu pens de rápid imersão n solução-teste. Após d período de exposição, s sementes form trnsferids pr solução-ontrole, reinfiltrds e olods em outr pl de Petri om nov solução-ontole, e levds novmente pr o germindor té o finl do experimento. 3.4 Ténis de tro ds soluções de ompostos selênios pel solução-ontrole Determindo o melhor tempo de exposição os ompostos selênios, form testds três ténis de tro d solução-teste de ompostos selênios pel solução-ontrole: A - lvgem, reinfiltrção e trnsferêni ds sementes trtds pr solução-ontrole, em outr pl de Petri; B - somente trnsferêni ds sementes pr solução-ontrole, em outr pl; C - remoção ds soluções de ompostos selênios e dição de solução-ontrole n mesm pl. No ontrole sem omposto selênio não foi feit tro de solução. 3.5 Toxiidde dos ompostos selênios A toxiidde dos ompostos selênios sore germinção foi vlid expondo-se sementes dormentes às soluções-teste por períodos de, 6, 18, 24, 48, 72, 96 e 12 h. Após d período de exposição, s sementes form trnsferids pr solução-ontrole, seguindo-se téni A de tro d solução (item 3.4), e permneerm inuds té o quinto di n soluçãoontrole. Em seguid, s soluções ds pls form removids, diionndo-se solução de 8

19 tiouréi (TU, 1 mol m 3 ), ontinundo inução por mis 24 h. A vitlidde ds sementes não-germinds foi determind onsiderndo-se germinção pós exposição à tiouréi. 3.6 Cinéti d germinção ds sementes A inéti de germinção de sementes foi determind em sementes dormentes e nãodormentes, ompnhndo-se germinção intervlos de 2, 4, 6, 8, 1, 12, 14, 16, 18, 2, 22 e 24 h e, posteriormente, nos horários de 36, 48, 72, 96 e 12 h. As sementes dormentes form exposts às soluções-teste dos ompostos selênios (nos níveis ótimos por 18 h, om tro pel téni A), e tmém às soluções de Ethrel (ET) mis enzildenin (BA), às onentrção de,1 mol m -3, enqunto s sementes não-dormentes form exposts pens à solução-ontrole. Form justds urvs que desrevem germinção umuld o longo do tempo, utilizndose de um progrm omputionl (Clo et l 1989), d qul form estimds s respetivs derivds primeirs, determinndo-se, ssim, s txs de germinção so d trtmento. 3.7 Iniição d síntese e d ção do etileno Pr verifir-se um possível relção entre quer d dormêni de sementes de estilosnte provod por soluções de ompostos selênios e o efeito do etileno, sementes dormentes form exposts soluções de selênio ontendo lguns iniidores d iossíntese e d ção do etileno. Os iniidores d iossíntese utilizdos form: íons olto (Co(NO 3 ) 2 1, mol m -3 ) (Gllrdo et l 1994) e minoetoxivinilgliin (AVG,1 mol m -3 ) (Briker et l 1994) e o áido sísio (AAB,1 mol m -3 ) (Kępzyński 1986). A iniição d ção fisiológi do etileno foi investigd om Ag + (,5 mol m -3 ) (Knee 1992), forneido n form de tiossulfto de prt, preprdo em solução no sistem HNO 3 -KOH (ph 7,), no momento de utilizção, misturndo-se qutro prtes de tiossulfto de sódio om um de nitrto de prt (Reid et l 198). Como ontrole, s sementes form germinds ns soluções de ompostos selênios sem iniidor. Os ensios form onduzidos expondo-se s sementes dormentes às soluções de ompostos selênios mis o iniidor por 18 h, qundo foi feit tro d solução, trnsferindo-se s sementes pr nov pl de Petri, ontendo solução pur do iniidor, onde permneerm inuds, om ontgem diári d germinção, té o quinto di. Em seguid foi feit sustituição d solução do iniidor por TU, ontinundo inução e ontgem por mis dois dis, pr vlir-se vitlidde ds sementes. 3.8 Reversão d ção dos iniidores em relção o efeito dos ompostos selênios Pr tentr-se reverter os efeitos dos iniidores d iossíntese e d ção do etileno, sementes dormentes form trtds simultnemente om s soluções dos ompostos selênios 9

20 mis os iniidores por 18 h. Ao finl desse período, foi feit tro d solução, trnsferindo-se s sementes pr nov pl ontendo um mistur do iniidor mis o revertor. Pr reverter-se o efeito de Ag +, s sementes form trnsferids pr solução de HCl (1 mol m -3, ph 2,), num tenttiv de preipitr-se prt (Pelni 21). A germinção foi registrd té o quinto di, fzendo-se ontgem diári. Qunto à reversão do efeito dos iniidores d iossíntese do etileno, de Co 2+ foi feit om solução de Ethrel (ET,1 mol m -3 ) e de AVG om solução de ACC (1, mol m -3 ) (Brros e Freits 21). Pr reverter-se o efeito do AAB, usou-se ET. Como ontrole, s sementes form germinds ns soluções-teste de selênio sem iniidor. 3.9 Quntifição do etileno A quntifição do etileno emndo pels sementes foi efetud segundo metodologi desrit por Whitehed e Nelson (1992), om pequens modifições. Lotes de 25 sementes form infiltrdos ns soluções-teste (2, m 3 ) e inudos em frsos Erlenmeyer de vidro (25 m 3 ), ontendo o fundo, dois disos de ppel de filtro Whtmn nº 1. O onjunto frso mis ppel er previmente semi-esterelizdo em estuf 15 C, por 4 h. Os frsos seldos form mntidos no esuro, em âmr de resimento noite/di (Form Sientifi In, Ohio, USA), 3 C. A d horário de 3, 6, 12, 15, 18, 24, 36, 48 e 72 h tmosfer intern dos frsos er homogeneizd, utilizndo-se de um sering de 3, m 3, provid de gulh long, e retird um mostr de 1, m 3 d tmosfer dos frsos, utilizndo-se gor de serings desrtáveis ultr-fine (gulhs 29 G ½ "). Após retird d mostr, er feit ontgem ds sementes germinds e os frsos erm exuridos so ventilção forçd, em pel, durnte 15 min. Nos experimentos om ompostos selênios, em que o etileno não er produzido durnte s primeirs 12 h de inução, os frsos permneerm ertos, qundo form exuridos e seldos. A primeir olet de mostr gsos oorreu seis hors pós o fehmento, ou sej, om 18 h de inução, momento em que tmém foi feit tro d solução-teste por solução-ontrole. Os frsos form novmente seldos pr segund retird om 24 h de inução, repetindo-se s operções de homogeneizção, retird d mostr, exustão e novo selmento dos frsos nos horários ds olets seguintes. Form mntids mostrs prlels pr determinção d mss fres, d horário de olet d mostr gsos do período experimentl. As mostrs gsoss form injetds em romtógrfo gás (Hewlett-Pkrd 589, série II, USA), equipdo om detetor de ionizção de hm, e olun de ço inoxidável (1, m x 6, mm), empotd om Porpk-N (8-1 mesh). O gás de rrste foi o dinitrogênio, om fluxo de 3 m 3 min 1. Os fluxos do hidrogênio e do r form mntidos em 3 e 32 m 3 min 1, 1

21 respetivmente. As temperturs d olun, do injetor e do detetor form mntids em 6, 11 e 15 C, respetivmente. A quntifição do etileno foi feit pel omprção ds áres dos pios ds mostrs otids em integrdor (Hewlett-Pkrd 3395, USA) opldo o romtógrfo, om áres de pios de mistur do pdrão de etileno de onentrção onheid. Aos ddos de úmulo de etileno emndo form justds urvs que desreverm emnção umuld de etileno o longo do tempo (Clo et l 1989) e, por derivd primeir, form determinds s txs de produção de etileno pels sementes. 3.1 Quntifição do ACC O ACC ns sementes foi quntifido segundo metodologi desrit por Gllrdo et l (1991), om pequens modifições. Amostrs de 25 sementes form infiltrds om soluçõesteste de ompostos selênios ou solução-ontrole e inuds em pls de Petri (15 mm de diâmetro), ontendo o fundo dois disos de ppel de filtro Whtmn nº 1; esse onjunto er previmente semi-esterelizdo em estuf, 15 C, por 4 h. As pls de Petri, ontendo s sementes e s respetivs soluções, erm mntids no esuro, em âmr de resimento noite/di (Form Sientifi, In, Ohio, USA), 3 C, pelos períodos de, 6, 12, 15, 18, 24, 36, 48, e 72 h. Pr os ensios om durção mior que 18 h, s soluções dos ompostos selênios erm trods por solução-ontrole, pós quele tempo de inução (ver item 3.4). Ao finl de d período, s sementes erm lvds exustivmente em águ destild, tiverm determinds sus msss fress, e form imerss em nitrogênio liquido e estods 2 C. Form mntids, tmém, mostrs prlels de 5 sementes pr determinção d germinção. A extrção foi feit triturndo-se s mostrs em lmofriz om pistilo em 1 m 3 de etnol (8 %), mis polivinil-pirrolidon (PVP 5 % m/v), durnte 2 min. O extrto foi filtrdo em ppel de filtro, entrifugdo 28 g, por 2 min, 4 C, e o sorendnte sumetido à evporção em evpordor rottivo, 45 ºC. O resíduo foi suspenso em 4, m 3 de águ destild (extrto originl). Metde do extrto originl foi utilizdo pr quntifir-se o ACC livre. O ACC foi quntifido por onversão quími pr etileno, seguindo-se téni desrit por Lizd e Yng (1979), om efiiêni de onversão vrindo de %. Um líquot de,5 m 3 do extrto foi levd regir om,1 m 3 de loreto de merúrio (5, µmol), ompletndo-se o volume de reção pr,8 m 3, om águ destild. O tuo de ensio ontendo os regentes foi veddo om seldor de látex e mntido em nho de gelo. Um líquot de proximdmente,2 m 3 de um mistur resfrid de NOCl (5 %) e NOH sturdo (v/v 2:1) foi injetd no tuo, o onteúdo foi gitdo em vórtex, por 5, s, e inudo em nho de gelo por 2,5 min. Após nov gitção por 5, s, um mostr gsos de 1, m 3 d tmosfer do tuo foi retird pr quntifição do etileno. 11

22 A outr metde do extrto originl foi usd pr determinr-se quntidde de ACC totl (ACC livre + ACC onjugdo, este possivelmente áido 1-roxílio-1-mlonilminoilopropno - MACC, Mnsour et l 1986). Após hidrólise áid om HCl (2, N), 1 C, por 3, h, o extrto foi neutrlizdo om NOH sturdo e evpordo 45 C, té seur. O resíduo foi ressuspenso em 3, m 3 de águ destild. A quntifição do ACC totl seguiu os mesmos proedimentos pr quntifição do ACC livre (Lizd e Yng 1979). Pel diferenç entre os onteúdos de ACC ntes e pós hidrólise, foi determind quntidde de ACC onjugdo no extrto Atividde d oxidse do ACC Após inúmers tenttivs não se onseguiu determinr tividde d sintse do ACC. Este estudo teve-se, portnto, à nálise d tividde d oxidse do ACC. Est foi determind in vivo segundo téni desrit por De Rued et l (1995), om pequens modifições. Amostrs de 25 sementes dormentes form infiltrds om 2, m 3 de solução-teste e inuds em frsos Erlenmeyer de 25 m 3. Amostrs pres de sementes dormentes form infiltrds om soluções-teste ou solução-ontrole e inuds, mntendo-se os frsos ertos, por não hver produção de etileno durnte s primeirs 18 h, de ordo om ensios nteriores. Proedeu-se, então, tro d solução e frso, trnsferindo-se s mostrs pres ds sementes trtds om selênio pr solução-ontrole ou solução de ACC (1, mol m -3 ). Os frsos permneerm ertos té 27 h pr grntir-se um lt produção de etileno, qundo, então, form exuridos e seldos té 33 h de inução. Nesse momento, foi feit olet d mostr gsos d tmosfer dos frsos e, tmém determind mss fres ds sementes. Os frsos form mntidos no esuro, em âmrs de resimento noite/di (Form Sientifi, In, Ohio, USA) 32 C. O etileno formdo, durnte o período de selmento, foi nlisdo em romtógrfo gás, onforme desrito no item 3.9. Dezoito hors pós o iníio dos trtmentos om sementes dormentes, iniiou-se o trtmento om sementes não-dormentes, inundo-se-s om solução-ontrole ou solução de ACC. Form então sumetids os mesmos pssos que s sementes não-dormentes. No estudo d inéti enzimáti in vivo, s sementes dormentes form inuds em soluções de ACC (, - 2, mol m -3 ), iniilmente om os frsos ertos durnte 8,75 h, pós o que form exuridos durnte 15 min e seldos, permneendo ssim por mis 6 h, ompletndose ssim 15 h de inução. Após homogeneizção d tmosfer intern dos frsos, foi retird primeir mostr gsos (em testes nteriores foi detetd grnde produção de etileno nesse período de inução). Após primeir olet de mostrs, os frsos permneerm novmente ertos por mis 2,75 h, qundo form exuridos durnte 15 min e seldos por mis 6 h, pr segund olet de mostrs, gor om um totl de 24 h de inução, qundo 12

23 produção de etileno mostrou-se máxim. Form mntids mostrs de sementes prlels, em d trtmento, pr determinção d mss fres. No período em que os frsos permneerm seldos pr olet ds mostrs, s msss fress form determinds pr um tempo médio de 12 h (9 15 h) e de 21 h (18 24 h) de inução. A tividde in vitro foi ensid segundo téni desrit por Fernández-Mulet e Yng (1992), om lgums modifições. Amostrs de 25 sementes erm infiltrds ns soluções-teste ou solução-ontrole, inuds em pl de Petri (15 mm de diâmetro), ontendo o fundo dois disos de ppel de filtro Whtmn nº 1. Esse onjunto er previmente semiesterelizdo em estuf, 15 C, por 4 h. As pls de Petri, ontendo s sementes e s respetivs soluções, erm mntids no esuro, em âmr de resimento noite/di (Form Sientifi, In, Ohio, USA), 3 C. Pr os ensios de tividde ds sementes trtds om ompostos selênios, els form inuds pelos períodos de, 12, 18, 24, 36, 48 e 72 h, fzendo-se tro ds soluções-teste por solução-ontrole, pós 18 h de inução. Ao finl de d período, s sementes erm lvds exustivmente em águ destild, tinhm determinds sus msss fress, e erm imerss em nitrogênio líquido e estods 8 C. As mostrs erm merds em lmofriz om pistilo resfridos e todo o proedimento onduzido so nho de gelo. A mostr er extríd om 6, m 3 do meio de extrção, onstituído de Tris-HCl 1 mol m -3 ph 7,; glierol 1 % (v/v); ditiotreitol (DTT) 1, mol m -3 ; sorto de sódio 3 mol m -3 ; Triton X-1 (,1 % v/v); e PVP 5% (m/v). O homogendo foi filtrdo em qutro mds de teido musselin e entrifugdo 28 g, por 2 min, 4 C, e 2, m 3 do sorendnte (extrto enzimátio) form plidos em um olun PD-1 (Phrmi),ontendo Sephdex G- 25, previmente equilirdo om o meio de reção menos ACC (ver ixo), pr desslinizção. Desrtrm-se os primeiros,5 m 3, reolhendo-se 4, m 3 seguintes do eluto ontendo enzim, o que foi previmente determindo por nálise ds frções, pr uso nos ensios de tividde enzimáti. A reção enzimáti er iniid pel dição de um líquot de,2 m³ do extrto desslinizdo, em tuo de ensio seldo, inudo por 2 h, 32 C, em um volume de reção de 2, m 3, onstituído de Tris-HCl 1 mol m -3, ph 7,; glierol 1 % (v/v); sorto de sódio 3 mol m -3 ; FeSO 4 5 mmol m -3 ; NHCO 3 3 mol m -3 ; DTT 1, mol m -3 ; e ACC 1, mol m -3 (Fernández-Mulet e Yng 1992). Deorrido o tempo de reção, um mostr de 1, m 3 do gás d tmosfer intern do tuo er nlisd pr quntifição do etileno. Cd repetição d mostr foi nlisd em duplit. Em mostrs sem o extrto enzimátio ou om o extrto fervido não foi detetd formção de etileno. A proteín no extrto enzimátio foi determind de ordo om Brdford (1976). 13

24 3.12 Iniição d tividde d oxidse do ACC Pr iniição d tividde d oxidse do ACC in vivo, mostrs de 25 sementes form infiltrds n solução-ontrole ou solução dos iniidores Co 2+ e n-propil glto (n-pg) e inuds em 2, m 3 ds respetivs soluções, em frsos Erlenmeyer de 25 m 3. Os frsos form mntidos ertos no esuro em âmrs de resimento noite/di (Form Sientifi, In, Ohio, USA) 32 C, durnte 24 h. Em seguid foi feit tro d solução dos iniidores por solução-ontrole, solução de ACC ou solução de mistur onjunt do iniidor mis ACC. Os frsos ontendo s sementes permneerm ertos, por mis 9 h, período de ix produção de etileno, vlido nteriormente. Form então, exuridos so ventilção forçd em pel, durnte 15 min e, seldos pr novo período de inução té 15 h, qundo foi feit primeir retird de mostrs. Em seguid, os frsos form novmente ertos e ssim permneerm té 18 h, pr que o próximo período de úmulo de etileno fosse de 6 h. Proedeu-se então, nov exustão e selmento té 24 h, efetundo-se segund retird de mostr gsos n produção máxim de etileno. Form mntids mostrs prlels de d trtmento, pr determinção d mss fres no período de úmulo de etileno, om os frsos seldos, tomndo-se os tempos médios de 12 h (9 15 h) e de 21 h (18 24 h), pós plição do ACC. Os efeitos d iniição form vlidos pel diminuição d produção de etileno, em relção o ontrole om ACC e sem o iniidor. Os ensios de iniição d tividde d oxidse do ACC in vitro form relizdos diionndo-se um líqut de,2 m 3 dos iniidores n mistur de reção. Em seguid, foi feit inução d mistur de reção, ontendo extrto enzimátio mis iniidor, 32 C, por ser tempertur ótim pr determinr-se tividde d enzim, onforme item Os iniidores testdos form α-mino-isoutírio (AMIB 1 mol m -3 ), áido sliílio (AS 1 mol m -3 ), áido etil-sliílio (AAS 1 mol m -3 ) e n-pg ( 1, mol m -3 ). A iniição foi vlid pel diminuição d produção de etileno durnte o período de reção, em relção o etileno formdo no extrto do ontrole, sem iniidor Delinemento experimentl O delinemento experimentl utilizdo em todos os experimentos foi inteirmente sulizdo. Os experimentos de germinção de sementes tiverm unidde experimentl ompost por 5 sementes por pl de Petri, om ino repetições por trtmento. As porentgens de germinção form trnsformds em ro-seno (%G/1) ½, pr serem sumetids o trtmento esttístio (Steel et l 1997), e s diferençs de médis entre trtmentos form vlids pelo teste de Sot & Knott (1974), em nível de 5 % de signifiâni. 14

25 Os experimentos sore quntifição do etileno emndo ds sementes e sore tividde enzimáti in vivo tiverm unidde experimentl onstituíd de um frso Erlenmeyer de 25 m 3 seldo om 25 sementes, om 1 repetições por trtmento. As diferençs de médi entre trtmentos form vlids pelo teste de Tukey, em nível de 5 % de signifiâni. Pr os experimentos de quntifição do ACC e de tividde enzimáti in vitro, os delinementos experimentis tmém form inteirmente sulizdos e s uniddes experimentis omposts de mostrs do extrto de 25 sementes om no mínimo qutro repetições por trtmento. As diferençs de trtmentos form vlids pelo teste de Tukey om 5 % de signifiâni. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 15

26 4.1 Efeito dos ompostos selênios n quer d dormêni Todos os ompostos selênios empregdos, om exposição ontinud ds sementes durnte ino dis, form efiientes n quer d dormêni, promovendo germinção. Medinte esse primeiro experimento foi esolhid, pr d omposto selênio, onentrção que melhor promoveu germinção (Fig 1). A seleno-dl-metionin foi o omposto que melhor promoveu quer d dormêni, levndo um germinção de 8 %, ms so um onentrção muito elevd (1 mol m -3 ). Em um segundo experimento, so intervlos mis estreitos de onentrção em torno d mis efiz, oservrm-se diferençs signifitivs n promoção d germinção devido à pequen vrição d onentrção de todos os ompostos (Fig 2). A seleno-metionin, no nível de 1, mol m -3, já hvi sido testd por Brros e Freits (2, 21), em sementes de estilosnte, om resultdos semelhntes o deste experimento. No nível mis lto (1 mol m -3 ) de seleno-dl-metionin, usdo nestes dois primeiros experimentos, repetirm-se os resultdos, e porentgem de germinção determind foi semelhnte o nível de 2,5 mol m -3 usdo por Brros e Freits (2, 21). Aumentos de onentrção em quse todos os ompostos selênios mostrrm-se orreliondos om elevção d porentgem de germinção té ertos níveis, prtir dos quis houve estilizção (tetrloreto de selênio e dióxido de selênio) ou iniição d germinção, om exeção d seleno-dl-metionin em que germinção foi sempre resente té o nivel mis lto testdo (Fig 2). Esses efeitos de umento d germinção seguidos de qued, om o umento d onentrção tmém form oservdos om o Zn 2+ (Deltorre e Brros 1996) e NCl (Lovto et l 1994). À exeção d seleno-dl-metionin, ujo emprego de 1 mol m -3 levri um onsumo muito lto, resultndo em ustos elevdos, trlhndo-se, prtir dí om onentrção de 1, mol m -3, pr os demis ompostos, o ritério de esolh d onentrção foi o de promoção d mior germinção (Fig 2). Os ompostos selento de sódio e selenito de sódio form os mis efiientes em promover quer d dormêni, om germinção superior 6 %, enqunto os demis promoverm germinção em torno de 4 %. Os seguintes níveis ótimos pr quer d dormêni ds sementes form seleiondos pr os trlhos posteriores: selento de sódio - 2, mol m -3 ; selenito de sódio -,2 mol m -3 ; áido selênio - 1, mol m -3 ; áido selenoso -,6 mol m - 3 ; selenouréi - 1, mol m -3 ; tetrloreto de selênio -,2 mol m -3 ; dióxido de selênio -,2 mol m - 3 e, pels rzões já explids, foi seleiondo pr seleno-l-metionin 1, mol m

27 8 Selento de sódio Selenito de sódio d d 8 Áido selênio Áido selenoso 6 4 Germinção (%) d Selenouréi Seleno-DL-metionin 4 2 d d d 8 6 Tetrloreto de selênio Dióxido de selênio Conentrção (mol m -3 ) Figur 1 - Efeito de ompostos selênios sore germinção de sementes dormentes de estilosnte, de 15 dis de idde pós-olheit, sem tro d solução-teste por solução-ontrole. Médi de 5 repetições ± erro d médi. Médis seguids de mesm letr, dentro de d trtmento, não diferem esttistimente entre si, em nível de 5 % de proilidde, pelo teste de Sott-Knott 17

28 8 6 4 Selento de sódio Selenito de sódio 2 d,6, ,6,8,1,2,4 8 Áido selênio Áido selenoso 6 4 Germinção (%) 2 8,6, Selenouréi d,6, Seleno-DL-metionin 6 4 2,6, ,1, Tetrloreto de selênio Dióxido de selênio d,6,8,1,2,4 Conentrção (mol m -3 ),6,8,1,2,4 Figur 2 - Efeito de ompostos selênios sore germinção de sementes dormentes de estilosnte, de 4 dis de idde pós-olheit, sem tro d solução-teste por solução-ontrole. Médi de 5 repetições ± erro d médi. Médis seguids de mesm letr, dentro de d trtmento, não diferem esttistimente entre si, em nível de 5 % de proilidde, pelo teste de Sott-Knott 18

29 A onentrção ótim do selenito de sódio usd em sementes de estilosnte foi metde d onentrção máxim utilizd por Crlson et l (1989), tentndo querr dormêni de sementes de lfe. Qunto o selento de sódio, onentrção ótim empregd neste trlho foi ino vezes mior que usd por queles utores, que não onseguirm promover germinção de lfe e de váris outrs espéies, usndo ompostos selênios. Esss espéies possivelmente possuem menismos de estímulo à germinção diferentes do de estilosnte, que tem dormêni querd qundo s sementes são exposts à ondição estressnte provod por metis pesdos, possivelmente por desender iossíntese de etileno (Deltorre e Brros 1996). Em outrs espéies omo Vign rdit, qundo s sementes form exposts o selênio em nível de,75 ppm, houve umento de germinção (Llith e Eswri 1995). Em sementes de Trigonell foenum-greum, trtds om selenito de sódio,5 ppm, houve umento d tividde de enzims hidrolítis, o que fvoreeu germinção (Sreekl e Llith 1998). O selênio não é um nutriente essenil pr plnts superiores, ms em lgums espéies vegetis seleno-minoáidos, seleno-proteíns e outros ompostos selênios são enontrdos em grndes quntiddes, sendo onsiderdo um elemento enéfio pr os vegetis (Welh et l 1991, Terry et l 2). Ms fix de onentrção ompreendendo os efeitos enéfios e tóxios é muito estreit; selênio (1, ppm) mostrou-se levemente tóxio pr o resimento de plântuls de Trigonell foenum-greum e reduziu tividde de enzims hidrolítis em 6 % (Sreekl e Llith 1998). 4.2 Efeito do tempo de exposição ds sementes os ompostos selênios Considerndo-se que o selênio pode ser tóxio e, portnto, pode levr um diminuição n germinção, estimou-se então o efeito do tempo de exposição ds sementes os ompostos selênios. A exposição ds sementes os ompostos selênios por somente 18 h proporionou melhores resultdos n germinção (Fig 3). As porentgens máxims de germinção, o fim de ino dis form: selenouréi - 95,2 %, dióxido de selênio - 88,4 %, tetrloreto de selênio - 86,4 %, áido selênio - 86, %, áido selenoso - 86, %, selento de sódio - 83,2 %, selenito de sódio - 81,6 %, om exeção d seleno-l-metionin - 56,8 %, n qul germinção não foi máxim. A doção do proedimento de expor s sementes dormentes os ompostos selênios por somente 18 h, fzendo-se em seguid um lvgem, reinfiltrndo e trnsferindo-se-s pr outr pl om solução-ontrole, resultou em um umento médio d germinção de 8 %, onsiderndo-se todos os oito ompostos selênios, qundo não se efetuou tro de soução. 19