Caracterização molecular e fenotípica de amostras de Escherichia coli isoladas de alimentos

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1 Caracterização molecular e fenotípica de amostras de Escherichia coli isoladas de alimentos Autores: Faúla, L. L. 1,2 ; Cerqueira, M.M.O.P. 1,2 ; Magalhães, P.P. 1,2 ; Carlos, G. A. 2 ; Leal Bernardes, A.F. 1,2 Instituição: 1 UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (Belo Horizonte MG); 2 FUNED - Fundação Ezequiel Dias (Belo Horizonte - MG). Correspondência: leandrofaula@funed.mg.gov.br RESUMO Em Minas Gerais, a partir de 396 alimentos, isolamos 220 de amostras de E. coli para pesquisa dos seguintes genes de E. coli diarreiogênica eae, bfpa (EPEC), eltb, esta, st1 (ETEC) stx1 e stx2 (STEC) ipah (EIEC) e aata (EAEC), bem como dos seus respectivos sorotipos. Nenhuma amostra apresentou genes característicos dos patotipos de EPEC, STEC, EAEC e EIEC. A presença do patotipo ETEC limitou-se a duas amostras (0,9%) de E. coli, ambas positivas para os genes eltb, esta, st1, e caracterizadas como sorotipos O9:H10 e O9:H33, fenótipos até o momento, não evidenciados em E. coli isoladas de alimentos. As duas amostras de ETEC foram isoladas de um pão de queijo e de uma refeição mista tipo galinhada (envolvida em surto de Doença de Transmissão Alimentar). Dados dessa natureza reforçam a necessidade de monitoramento da presença de E. coli diarreiogênica em alimentos. Palavras chaves: Escherichia coli diarreiogênica, sorotipos, alimentos In Minas Gerais, from 396 food, we isolated 220 strains of E. coli to search the following E. coli diarrheagenic genes eae e bfpa (EPEC), eltb, esta e st1 (ETEC) stx1 e stx2 (STEC) ipah (EIEC), and aata (EAEC), as well as of the respective serotypes. No sample showed characteristic genes of pathotypes of EPEC, STEC, EAEC and EIEC. The presence of ETEC pathotype was limited to two samples (0.9%) of E. coli isolated from a hunk of cheese and a chicken (involved in outbreak of foodborne disease). Both samples were positive ETEC for ELTB genes is, st1, and characterized as serotypes O9: H10 and O9: H33, phenotypes so far, not shown in E. coli isolated from food. The two samples of ETEC have been isolated from a cheese bread and a mixed meal type "galinhada" (involved in outbreak of foodborne disease). Such data reinforce the need for monitoring the presence of E. coli in food diarrheagenic. Keyword: diarrheagenic Escherichia coli, serotype, food 1. INTRODUÇÃO Dentre os principais contaminantes microbiológicos destaca-se Escherichia coli, bactéria que faz parte da microbiota intestinal dos seres humanos e animais de sangue quente, sendo constantemente eliminada no ambiente, contaminando o solo, a água e os alimentos (SILVA et al., 2010). Embora E. coli possa se comportar como bactéria residente e inócua do trato gastrointestinal, sabe-se que alguns sorotipos são potencialmente diarreiogênicos para ser humano, sendo considerada um dos principais patógenos causadores de diarreia no mundo (Croxen et al., 2013) A presença de determinados fatores de virulência e seus antígenos somáticos, capsulares e flagelares, subdivide a categoria de E. coli diarreiogênica em seis patotipos distintos: E. coli Enteropatogência (EPEC), E. coli Enterotoxigênica (ETEC), 1

2 E. coli produtora de toxina de Shiga (STEC) E. coli Enteroinvasiva (EIEC), E. coli Enteroagregativa (EAEC) e E. coli Difusamente Aderente (DAEC), cada um destes apresentando manifestações clínicas e epidemiologia distinta (Feng et al., 2011). Considerando a necessidade de se primar pela inocuidade dos alimentos destinados ao consumo humano, mitigando, portanto, o aparecimento das Doenças de Transmissão alimentar (DTA), relevante agravo de Saúde Pública, este trabalho objetivou avaliar a ocorrência de Escherichia coli diarreiogênica em alimentos comercializados ou envolvidos em surtos (DTA), no estado de Minas Gerais, Brasil. 2. MATERIAL E MÉTODOS Obtenção das amostras Diversos tipos de alimentos (n = 396), incluindo massas e salgados diversos, produtos cárneos, especiarias, hortaliças, produtos lácteos, produtos de panificação e refeições de pronto consumo foram coletados em diferentes municipios do Estado de Minas Gerais, no perído de 2014 e 2015, e em seguida, armazenados sob refregeração até a realização das análises microbiológicas. Contagem de Coliformes a 45ºC e isolamento das amostras de Escherichia coli A contagem de coliformes a 45ºC e o isolamento das amostras de E. coli foi realizado pela da técnica Número Mais Provável conforme descrito no Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Kornacki&Johnson, 2001). Extração do DNA O DNA das amostras de E. coli (n=220) foi extraído pelo método proposto por Fox et al. (1994). As amostras de E. coli, criopreservadas a 80ºC negativos, foram descongeladas e cultivadas em ágar sangue a 35 o C por 24hs. Os sedimentos de cultura bacteriana, obtidos a partir das culturas no ágar sangue, foram ressuspendidos em 210 µl de tampão STET (sacarose8%, Tris-HCl 50mM, EDTA 50mM, Triton X-100 0,1%; ph 8,0). A seguir, foram adicionados à suspensão 60 µl de SDS (10%) e 10 µl de RNase A (0,5mg/mL) para posterior incubação em banho-maria a 37ºC por1 hora. Após esse período de incubação adicionou-se 30 µl de proteinase K (10mg/mL) à suspensão, a qual foi novamente incubada em banho-maria a 37 o C por 24 horas. Finalizado essa etapa, foram adicionados 75 µl de NaCl 5M e 60 µl de solução CTAB/NaCl (CTAB 5%p/v/NaCl 0,7M) e a suspensão mantida em banho-maria a 56ºC por 10 minutos. Após incubação, acrescentou-se à suspensão 350 µl de fenol e 350 µl de clorofórmio (1:1) e seguiu-se à centrifugação a g, a 4ºC, por 8 minutos e descarte da fase gelatinosa (procedimento este realizado por três vezes). Após a última etapa de centrifugação adicionou-se ao material restante 60 µl de acetato de sódio 3M e 750 µl de etanol absoluto, para posterior armazenamento a menos 20ºC por 24 horas. Finalizado o período de armazenamento, a suspensão foi centrifugada a g, a 4ºC por 75 min; o sobrenadante descartado; e novamente acrescentado 750 µl de etanol 70% para nova centrifugação a g, a 4ºC, por 25 minutos. Após esta centrifugação o sobrenadante foi descartado e o sedimento do DNA diluído em 50 µl água Milli-Q estéril. A amostra foi homogeneizada e 2 µl da suspensão utilizado para medição da concentração de DNA em espectrofotômetro (Nanodrop 1000; Thermo Fischer Scientific, Wilmington), empregando-se comprimento de onda de 260 nm. 2

3 Pesquisa dos genes de virulência pela reação em cadeia da polimerase (PCR) O DNA extraído foi submetido à PCR convencional (Termociclador Mastercycler nexus) utilizando iniciadores específicos para pesquisa dos seguintes marcadores de virulência: eae, bfpa, eltb, esta, st1, stx1, stx2, ipah e aata. Os produtos de amplificação, sequência de primers e protocolos estão descritos no quadro 2. O volume final das reações de amplificação foi de 20 μl e o mix constituído por tampão (Tris HCl 10 mm, ph 8,4;), 0,75 a 2 mm de MgCl2 (concentração específica por marcador), 200 μm de cada dntp, 0,5 μm de cada primer, 1 U de Taq DNA polimerase e 20 ng de DNA molde. Os controles positivos foram eae, bfpa (E. coli CDC O126, INCQS ), elt, esta e st1 (E. coli H10407), stx1 e stx2 (E. coli CDC EDL-933, INCQS 00171), ipah (E. coli 3927, Instituto Adolfo Lutz) e aata (E. coli 3929 L08-15, Instituto Adolfo Lutz). Em cada lote de reações foram empregadas amostra de E. coli ATCC e água, como controle negativo interno, respectivamente. Como padrão, foi utilizado marcador de peso molecular 100 bp. Tabela 1: Marcadores de virulência, seguido dos patotipos e produtos de amplificação, condições ideais da PCR, tamanho do produto e bibliografia. Gene Patotipo/ Produto Sequência do primer Programa Amplicon (pb) Fonte eae bfpa eltb esta st1 stx1 STEC E EPEC/ Intimina EPEC atípica/ Fimbria BFP ETEC/ Enterotoxina termolábil ETEC/ Enterotoxina termoestável (STp) STEC/ Enterotoxina termoestável (STh) STEC/ Toxina de Shiga stx1 F: 5 -CTGAACGGGCGATTACGCGAA-3 R: 5 -CCAGAACGATACGATCCAG-3 F: 5 -ATTGGTGCTTGCGCTTGCTGC-3 R: 5 -GCCGCTTTATCCAACCTGGTA-3 F: 5 -ACGGCGTTACTATCCTCTC-3 R: 5 -TGGTCTCGGTCAGATATGTG-3 F: 5 -TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG-3 R: 5 -ACAGGCAGGATTACAACAAAG-3 F: 5 -TTCACCTTTCCCTCAGGATG-3 R: 5 -CTATTCATGCTTTCAGGACCA-3 F: 5 -CAGTTAATGTGGTGGGGAAGG-3 R: 5 -CAACAGACAATGTAACCGTG-3 95 C/40s 40x; 53 C/2min 40x; 60 C/2min 40x 95 C/40s 40x; 53 C/2min 40x; 60 C/2min 40x 94ºC/1min 1x; 94ºC/30s 35x, 52ºC/30s 35x;72ºC/1min 35x; 72ºC/5min1x 94ºC/1min 1x; 94ºC/30s 35x, 52ºC/30s 35x;72ºC/1min 35x; 72ºC/5min1x 94ºC/1min 1x; 94ºC/30s 35x, 52ºC/30s 35x;72ºC/1min 35x; 72ºC/5min1x 95 C/20s 30x, 61ºC/40s 30x, 72ºC/1,5min 30x Aranda, et al., 2004 Gunzbur g, et al., 1995 Sjöling et al., 2007 Rodas et al., 2009 Woodw ard et al., 1992 Vidal et al., 2004 stx2 ipah aata STEC/ Toxina de Shiga stx2 EIEC/ Proteína de invasão EAEC/ Proteína de membrana F: 5 -ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG-3 R: 5 -GCGTCATCGTATACACAGGAGC-3 F: 5 -CTCGGCACGTTTTAATAGTCTGG-3 R: 5 GTGGAGAGCTGAAGTTTCTCTGC-3 F: 5 -CTGGCGAAAGACTGTATCAT-3 R: 5 -CAATGTATAGAAATCCGCTGTT-3 95 C/20s 30x, 61ºC/40s 30x, 72ºC/1,5min 30x 94 C/5min 1x, 94 C/1min 35x, 55 C/1min 35x, 72ºC/1min 35x, 72 C/3min 1x 95 C/5min 1x, 94 C/40s 30x, 53 C/1min 30x, 72ºC/1min 30x, 72 C/7min 1x Vidal et al., 2004 Vidal et al., 2005 Aranda et al., 2004 Fonte: elaborado pelo autor 3

4 Pesquisa dos sorotipos de Escherichia coli As amostras de E. coli confirmadas como positivas para quaisquer fatores de virulência foram sorotipadas pelo Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil. Os sorotipos O:H foram determinados por meio do método de Ewing (1986), no qual para aglutinação em tubo utilizou-se os anti-soros adsorvidos para os antígenos somáticos (O1 a O188) e flagelar (H1 a H56), preparados pelo Instituto Adolfo Lutz. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na avaliação das 220 amostras de E. coli quanto aos fatores de virulência de E. coli diarreiogênica, foram identificadas duas (0,9%) positivas para o patotipo ETEC, ambas com amplificação dos genes eltb, esta e st1, responsáveis pela produção das enterotoxinas LT, STp e STh de ETEC, respectivamente. Estas foram isoladas de um salgado (pão queijo) e a outra de uma refeição mista (galinhada) proveniente de surto de Doença de Transmissão Alimentar.O referido surto ocorreu em um centro religioso onde pelo menos cinco pessoas adoeceram após o consumo de uma galinhada. Dos envolvidos, 100 % apresentaram vômito, náusea e cólica abdominal após cinco horas do consumo. Na ocasião, não foram isolados enteropatógenos no material clínico (fezes) dos envolvidos e na água de consumo. Neste evento também não foi identificado nenhum outro micro-organismo na galinhada ou outro alimento que justificasse o quadro de toxinfecção, indicando, portanto, se tratar de uma possível DTA por ETEC. Dados similares, com baixo percentual de amostras de E. coli diarreiogênica (STEC e ETEC) foram reportados por Paneto et al. (2007), ao analisarem 168 amostras de E. coli, provenientes de queijos. Segundo os autores, apenas uma (2,0%) amostra foi classificada como ETEC e duas (4,0%) como STEC. Ribeiro (2013) não identificou a existência dos patotipos STEC, EPEC e ETEC entre 169 amostras isoladas de queijo produzido por leite cru. Chomvarin et al. (2005) também não reportaram a presença de qualquer patotipo diarreiogênico (STEC, EPEC, ETEC, EAEC e EIEC) nas 140 amostras isoladas de alimentos prontos para consumo. Melo (2015) corrobora os resultados acima, uma vez que não evidenciou patotipos de E. coli diarreiogênica (STEC, EPEC, ETEC, EAEC e EIEC) entre as 36 amostras isoladas de diversos alimentos. Segundo Peresi et al. (2016), a avaliação de 70 quibes crus resultou no isolamento de 403 amostras de E. coli. Destas, apenas duas (0,5%) mostraram-se patogênicas, ambas pertencentes ao patotipo STEC. Em nenhuma das amostras analisadas foram identificados fatores de virulência associados à ETEC, EPEC, EAEC e EIEC. A ausência de alto percentual de E. coli diarreiogênica neste estudo, não importa, necessariamente, em amostras comensais, uma vez que estas podem ser portadoras de outros fatores de virulência, tais como os genes de E. coli patogênica extra intestinal (ExPEC), que é responsável por quadros de meningite neonatal e infecções do trato urinário. Okura (2010), por exemplo, já reportou amostras de ExPEC isoladas de de queijo, indicando-as como uma nova classe de patógenos transmissíveis por alimentos. Segundo Riberiro (2013), 10,6% das 169 amostras de E. coli isoladas de queijo possuíam genes de ExPEC. No presente estudo, as duas amostras de ETEC isoladas foram caracterizadas com os sorotipos O9:H33 e O9:H10. Em ampla pesquisa realizada na literatura não foi evidenciado, até o momento, relato destes dois sorotipos em E. coli isoladas em alimentos. Com relação à análise de sorotipagem, sabe-se que, no passado, esta era o principal mecanismo de diagnóstico existente para diferenciação de amostras 4

5 de E. coli patogênica e comensal. Hoje, com o advento das análises genéticas, que permitem identificação dos fatores de virulência, a sorotipagem perdeu valor. Todavia, o conhecimento dos sorogrupos e/ou sorotipos de E. coli patogênicas, podem fornecer informações úteis para caracterização das amostras que compõe os diferentes patotipos de E. coli (Wolf, 1997). Conforme discutido a presença de E. coli diarreiogênica em alimentos é realidade não só no Brasil, mas no mundo. Nesse sentido, espera-se que iniciativas institucionais, legais e comunitárias possam ser discutidas, harmonizadas e consolidas em todo o cenário mundial, sempre com objetivo de assegurar a qualidade e a segurança dos alimentos destinados ao consumo humano. 4. CONCLUSÕES Não foi observada a presença de marcadores de virulência característicos dos patotipos EPEC (eae e bfpa), STEC (stx1 e stx2), EAEC (aata) e EIEC (ipah). A presença de ETEC, identificada em baixo percentual, foi isolada de um salgado (pão queijo) e a outra de uma refeição mista (galinhada) proveniente de DTA, reforçando a necessidade de monitoramento da presença de E. coli diarreiogênica em alimentos. As referidas amostras ETEC foram positivas para os marcadores eltb, esta e st1, responsáveis pela produção das enterotoxinas LT e STp e STh, respectivamente e, paralelamente, caracterizadas como sorotipo O9:H10 e O9:H33. Até o momento, nenhum destes sorotipos havia sido evidenciado entre E. coli isoladas de alimentos. 6. AGRADECIMENTOS À FAPEMIG, FUNED e UFMG 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARANDA, K.R.S., FAGUNDES-NETO, U., & SCALETSKY, I.C.A. Evaluation of multiplex PCRs for diagnosis of infection with diarrheagenic Escherichia coli and Shigella spp. Journal of Clinical Microbiology, v. 42 n.12, p , CROXEN, M.A, LAW, R.J, SHOLZ, R. et al. Recent Advances in Understanding Enteric Pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. v.26, n. 4, p , CHOMVARIN, C.; RATCHTRACHENCHAI, O.A, CHANTRASK, Y. et al. Characterization of diarrheagenic Escherichia coli. Outheast Asian of Journal tropical medicine Public Health. v.36, n.4, p , EWING, W.H. Edwards & Ewing s Identification of enterobacteriaceae. New York: Elsevier, FENG, P.; WEGANT, S.D.; JINNEMAN, K. Diarrheagenic Escherichia coli. Bacteriological Analytical Manual. Food and Drug Administration (FDA). Capítulo 4A, revisão fevereiro 2011, acesso em: 20/06/2014. FOX, J. G.; DEWHIRST, F. E.; FRASER, G. J. et al. Intracellular Campylobacter-like organism from ferrets and hamsters with proliferative bowel disease is a Desulfovibrio sp. Journal Clinical Microbiology. v. 32, p , GUNZBURG, S.T.; TORNIEPORT, N.G.; RILEY, L.W. Identification of enteropathogenic Escherichia coli by PCR-basead detection of the bundle-forming pilus gene. Journal Clinical Microbiology. v.33, n.5, p ,

6 KORNACKI, J.L., JOHNSON, J.L. Enterobactereacea, coliforms and Escherichia coli as quality and safety indicators. In: DOWNES, F. P.; ITO, K. (Org.) Compendium of Methods for the Microbiological examination of Foods. Washington: Ed. APHA, P.69-82, OKURA, M.H. Avaliação Microbiológica de Queijos tipo Minas Frescal comercializados na região do Triângulo Mineiro f. Tese [Doutorado em Microbiologia]. Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. Universidade Estadual Paulista Júlio Mesquita Filho, PANETO, B.R.; ITURRINO, S.; MACEDO, C. et al. Occurrence of toxigenic Escherichia coli in raw milk cheese in Brazil. Arquivo Brasileiro Medicina Veteterinária e Zootecnia, v.59, n.2, p , PERESI, J.T.M.; ALMEIDA, I.A.Z.C.; VAZ, T.M.I. et al. Search for diarrheagenic Escherichia coli in raw kibbe samples reveals the presence of Shiga toxin-producing strains. Food Control. v.63, p , RIBEIRO, L.F. Características fenotípicas e genotípicas de Escherichia coli isoladas de queijos produzidos a partir de leite não pasteurizado. Dissertação [Mestrado em Medicina Veterinária Preventiva]. Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária Universidade Paulista São Paulo, RODAS, C.; INIGUEZ, V.; QADRI, F. et al. Development of multiplex PCR assays for detection of enterotoxigenic Escherichia coli colonization factors and toxins. Brazilian Journal Infectious Disease. v. 47, p , SILVA, N., JUNQUEIRA, V.C.A., SIVEIRA, N.F.A et al. Manual de métodos de análise microbiológica de Alimentos. São Paulo: Varela, SJÖLING, A.; WIKLUND, G.; SAVARINO, S. J. et al. Comparative analyses of phenotypic and genotypic methods for detection of enterotoxigenic Escherichia coli toxins and colonization factors. Journal of Clinical Microbiology. v. 45, p , VIDAL, M., KRUGER, E., DURAN, C. et al. Single multiplex PCR assay to identify simultaneously the six categories of diarrheagenic Escherichia coli associated with enteric infections. Journal of Clinical Microbiology. v.43 n.10, p , VIDAL, R., VIDAL, M., LAGOS, R. et al. Multiplex PCR for Diagnosis of Enteric Infections Associated with Diarrheogenic Escherichia coli..journal of Clinical Microbiology. v.42, p , WOODWARD, M. J.; CARROLL, P. J.; WRAY, C. Detection of entero- and verocytotoxin genes in Escherichia coli from diarrhoea disease in animals using the polymerase chain reaction. Veterinary Microbioly, v. 31, p , WOLF, M.K. Occurrence, Distribution, and Associations of O and H Serogroups, Colonization Factor Antigens, and Toxins of Enterotoxigenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews, v.10, n.4, p