Sensibilidade do Teste de Tiras na Detecção dos Eventos de Milho Transgênico Bt11 e MON810

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1 Sensibilidade do Teste de Tiras na Detecção dos Eventos de Milho Transgênico Bt11 e MON810 André D. do N. Júnior 1, Vivian E. Nascimento 2, Édila V.R. V. Pinho 2, Bruno C. dos Santos 1 e Wilder de S. Silva 4. 1 Graduando em Agronomia; 2 Doutoranda Fitotecnia, Dept de Agricultura, vivian_nascimento@hotmail.com; 3 Professora do Dept de Agricultura, edila@dag.ufla.br 4 Bolsita CNPq, Setor de sementes, Universidade Federal de Lavras, C.P. 3037, Lavras, MG CEP Palavras-chave: OGM, detecção, métodos imunológicos. Introdução Atualmente diversos eventos de milho transgênicos foram aprovados para a comercialização. Contudo, com a produção e comercialização de sementes e em função da legislação vigente, é necessário a avaliação de métodos rápidos e seguros para a detecção de transgênicos em sementes e grãos. Diversos métodos já foram desenvolvidos para detectar esses genes que codificam características específicas em sementes. A primeira categoria inclui métodos que requerem a amplificação de um segmento de DNA com subsequente detecção direta ou indireta do produto final. A segunda categoria inclui métodos que envolvem o emprego de anticorpos marcados. Compreender o funcionamento dos testes diagnósticos permite reduzir o número de resultados falsos positivos e falsos negativos que possam ocorrer durante a realização dos testes em lotes de sementes e grãos. Os três testes diagnósticos mais usados para se determinar a presença ou ausência de eventos específicos de modificação genética em sementes e matérias-primas alimentares são: os testes ELISA em placas, o teste de tira por fluxo lateral e a PCR (Polymerase Chain Reaction) (Innis et al., 1990). Esses métodos estão fundamentados na capacidade de indicar a presença de novas sequências de DNA, correspondentes ao novo gene ou à construção genética introduzida, ou novas proteínas, decorrentes da expressão dessas novas sequências. Apesar de os métodos imunológicos e PCR diferirem quanto à sensibilidade, velocidade e custo por análise, observa-se uma grande concordância entre os resultados obtidos com os dois tipos de metodologia. Contudo, a robustez do método, o custo por análise, a necessidade de resposta qualitativa rápida, a velocidade de execução, os limites legais e treinamento de pessoal podem definir a escolha em favor de métodos imunológicos rápidos, principalmente daqueles em configuração mais simples, a exemplo do método de tiras. No entanto, há a necessidade de avaliar fatores que possam interferir no resultado das análises. Sabe-se que há níveis diferentes de expressão de proteínas em sementes em função do evento biotecnológico, e que esses níveis variam também nas estruturas das sementes. Em milho, os tecidos das sementes possuem diferentes níveis de ploidia (embrião=2n, endosperma=3n, tegumento=2n). Sendo assim, essa diferença pode influenciar na detecção do evento do parental que o mesmo foi introduzido. Diante disso, o objetivo neste trabalho foi avaliar sensibilidade do teste de tiras na detecção dos eventos Bt11 e MON810 em diferentes tecidos da semente de milho. 105

2 Material e Métodos A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório Central de Sementes do Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras (UFLA). Foram utilizadas sementes de cultivares comerciais de milho DKB 390 convencional, Yieldgard (MON810) e Maximus TL (Bt11). Com a finalidade de simular diferentes níveis de contaminação, sementes transgênicas (Yieldgard e TL) foram misturadas às sementes convencionais nos níveis: 0,2; 0,4 e 0,8% para Bt11 e 0,4; 0,8 e 1,6% para MON810. Essas preparações foram definidas a partir das especificações do kit comercial adquirido da marca Gehaka, com limite de detecção é 0,4% e 0,8% para os eventos Bt11 e MON810 respectivamente. Metodologia 1: Foram utilizados como tratamentos: sementes inteiras, endosperma e eixo embrionário, utilizando 500 sementes (equivalente a 160 g). Os materiais foram triturados durante 30 segundos em liquidificador, e posteriormente adicionado 200 ml de tampão diluído para amostra. Para proceder ao teste, 0,5ml do extrato triturado foi pipetado e colocado em um tubo de 1,5ml, na presença da tira. Metodologia 2: Os tratamentos foram: sementes inteiras, endosperma e eixo embrionário, utilizando 500 sementes (equivalente a 160 g). Depois de separados os endospermas e eixo embrionário das sementes estes foram triturados e pesados. Utilizou-se o peso do eixo embrionário como referência para todos os outros tratamentos. Posteriormente foi adicionado tampão para amostra diluído proporcional ao peso do eixo embrionário. Para proceder ao teste, 0,5ml do extrato triturado foi pipetado e colocado em um tubo de 1,5ml, na presença da tira. Metodologia 3: Os tratamentos foram: sementes inteiras, endosperma e eixo embrionário, utilizando 500 sementes (equivalente a 160 g). Os materiais foram triturados durante 30 segundos em liquidificador, e posteriormente adicionado tampão para amostra diluído proporcional ao peso de cada material. Para proceder ao teste, 0,5ml do extrato triturado foi pipetado e colocado em um tubo de 1,5ml, na presença da tira. Resultados e Discussão Por meio dos resultados apresentados nas Tabela 1, 2 e 3 é possível observar que a sensibilidade do teste foi diferente para ambos os eventos, tratamentos e metodologia utilizada. De acordo as especificações do fabricante, considerando o limite de detecção do kit utilizado, 0,8% para o MON 810 e 0,4% para o Bt11, na Metodologia 1, o teste não foi sensível para detectar o evento em sementes inteiras e eixos embrionários para MON810 e em nenhum dos materiais utilizados para o Bt11. O teste foi positivo para endosperma no limite de 0,8% para MON810, o que permite inferir que o gene provavelmente tenha sido introduzido no parental feminino. Ressalta-se que as sementes de milho são constituídas, em maior parte, pelo tecido endospermático. Observa-se também que, nessa metodologia o teste só foi positivo para o evento Bt11 no nível de 0,8%, o que compromete o limite de detecção de 0,4% indicado pelo fabricante. 106

3 Tabela 1: Resultados dos testes de tiras para a Metodologia 1. UFLA, Lavras-MG, *Limite de detecção para o evento de acordo com as especificações técnicas do kit. Nas metodologias 2 e 3 (Tabela 2 e 3) observa-se que todos os testes foram positivos quando da utilização do eixo embrionário em todos os tratamentos. Na primeira metodologia os eixos embrionários foram retirados de 160g de sementes obtendo-se aproximadamente 24 g desse material. Nas 24 g foram adicionados 200 ml de tampão, o que diluiu muito a amostra dificultando a detecção da proteína. No entanto deve ser ressaltado que nesse teste trabalha-se com sementes inteiras e que nas metodologias 2 e 3 utilizadas houve a detecção dos eventos MON810 e Bt11 com 1,6% e 0,8% de contaminação, respectivamente, coincidindo com os resultados observados quando da utilização da metodologia 1. Tabela 2: Resultados dos testes de tiras para a Metodologia 2. UFLA, Lavras-MG, *Limite de detecção para o evento de acordo com as especificações do técnicas do kit. 107

4 Tabela 3: Resultados dos testes de tiras para a Metodologia 2. UFLA, Lavras-MG, *Limite de detecção para o evento de acordo com as especificações do técnicas do kit. Os resultados da metodologia 3 só diferiram da metodologia 2 no teste para MON810 no nível de 0,4% que foi positivo também para o endosperma (Figura 1). Isso provavelmente ocorreu porque grande parte da amostra é descartada no método 2, aumentando a probabilidade de resultados falso negativo. Sendo assim, pode-se afirmar que na metodologia 3 foi observada maior eficiência para a detecção dos eventos nos diferentes tratamentos e que a quantidade de tampão adicionado às amostras pode influenciar nos resultados. Figura 1: Resultado do teste de tiras para MON810, nível de 0,4%, metodologia 3. Agradecimentos 108

5 Os autores agradecem o apoio a Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais FAPEMIG. Referências Bibliográficas Ahmed, F.E. (2002) Detection of genetically modified organism in foods. TRENDS in Biotechnology Vol.20 No.5. COMISSÃO TÉCNICA NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA. Desenvolvido pela CTNBio, Informações sobre Liberações Comerciais. Disponível em: < > Acesso em: 10 mai. GIOVANNINI T, CONCILIO L. PCR Detection of genetically modified organisms: a review. Starch. 2002; 54(8): JAMES, C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2009 Ithaca, NY: ISAAA, (ISAAA Brief, n. 41). Laffont, J.L, Remund,. K., Wright, D., Simpson, R.D and Grégoire, S. (2005) Testing for adventitious presence of transgenic material in conventional seed or grain lots using quantitative laboratory methods: statistical procedures and their implementation. Seed Science Research 15: Stave, J.W. (2002) Protein immunoassay methods for detection of biotech crops: Applications, limitations, an practical considerations. J. AOAC int.85(3): Stave, J. W., Brown, M.C., Chen,J., McQuillin, A.B. and Onisk, D.V. Enabling grain distribution and foos labeling using protein immunoassay for products of agricultural biotechnology. In Press, M.Bhalgat, ed. American Chemical Society, Stave, J.W. (1999) Detection of new or modified proteins in novel foods derived from GMO Future needs. Food Control 10: