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1 ARS VETERINARIA, 17(3): , IDENTIFICAÇÃO PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) DE AMOSTRAS DE Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICAS (EPEC) ISOLADAS DE CÃES COM DIARRÉIA E NORMAIS NO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL (IDENTIFICATION BY THE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) TECHNIQUE OF STRAINS OF ENTEROPATHOGENIC (EPEC) Escherichia coli ISOLATED FROM DIARRHEIC AND HEALTHY DOGS IN THE STATE OF SÃO PAULO, BRAZIL) G. NAKAZATO 1, L. OSUGUI 2, F. A. DE ÁVILA 3, A. F. P. DE CASTRO 4 RESUMO Foram examinadas fezes de 146 cães com diarréia e de 36 cães aparentemente normais. Utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi verificada a presença do gene eae em 22 (11,82%) amostras de Escherichia coli de cães, sendo 19 oriundas de cães com diarréia e três de animais aparentemente sadios. O gene eae é responsável pela codificação de uma proteína de membrana externa, denominada intimina, um dos principais fatores de virulência envolvidos na formação da lesão attaching and effacing (A/E) encontrada no epitélio intestinal dos animais afetados e também em células HEp-2 e HeLa, experimentalmente infectadas por essas amostras de E. coli. Ainda pela técnica de PCR, destas 22 amostras eae positivas, duas amostras foram positivas para a presença do gene bfpa, que codifica para um tipo de adesina, denominada bundle-forming pilus. Todas as amostras foram negativas para genes produtores de shiga-toxinas (Stx1 e Stx2). Nossos achados demonstram de modo evidente a presença dessas amostras muito semelhantes às enteropathogenic E.coli (EPEC) humanas entre cães, bem como sugerem a habilidade destas bactérias causarem lesões A/E, podendo ser consideradas agentes etiológicos de diarréia em cães e eventualmente serem transmitidas para humanos. PALAVRAS- CHAVE: Escherichia coli enteropatogênica, attaching and effacing, gene eae, PCR SUMMARY Stools from 146 dogs with diarrhea and 36 from apparently healthy ones were examined. Using the polymerase chain reaction (PCR) the gene eae was detected in 22 (11.82%) strains of Escherichia coli, being 19 from animals with 1 Médico Veterinário e Mestrando do Programa de Biologia Molecular e Genética de Microrganismos, Departamento de Microbiologia e Imunologia, do Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Cidade Universitária Zeferino Vaz, s/nº, , Campinas, SP. 2 Biologista, Bolsista de Iniciação Científica do Pibic/USP, Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas-II, Universidade de São Paulo, Cidade Universitária Armando Sales de Oliveira, Av. Prof. Lineu Prestes, 1374, , São Paulo, SP. 3 Médico Veterinário, Pesquisador do CNPq, Professor Titular de Microbiologia, Departamento de Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Unesp, Campus de Jaboticabal, Rodovia Paulo Castelane Donato, Km5, Jaboticabal, SP, Brasil 4. Médico Veterinário, Pesquisador 1-A do CNPq, Professor Titular de Microbiologia, Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas-II, Universidade de São Paulo, Cidade Universitária Armando Sales de Oliveira, Av. Prof. Lineu Prestes, 1374, , São Paulo, SP. Autor para correspondência. Trabalho subsidiado pelo CNPq e pela Fapesp

2 219 ARS VETERINARIA, 17(3): , diarrhea and three strains from non-diarrheic dogs. The eae gene is responsible for encoding an outer membrane protein, named intimim, one of the main virulence factors involved in the formation of the attaching and effacing (A/E) lesions found in the intestinal epithelium of the affected animals and also in the HEp-2 and Hela cells experimentally infected by these E.coli strains. Yet, using the PCR technique two out of the 22 eae+ were positive for the presence of the bfpa gene, that codes for an adhesin, denominated bundle-forming pilus. All strains were negative for the genes that encode for shiga-toxins ( Stx1 and Stx2 ). Our findings demonstrate clear-cut that the presence of these strains among dog stools is very similar to the enteropathogenic E. coli (EPEC) responsible for diarrheal infection among children, as well suggest that these bacteria have the ability of causing A/E lesions, characterizing these strains as etiological agents of diarrhea among dogs and eventually transmitted to humans. KEY-WORDS: Enteropathogenic Escherichia coli, attaching and effacing, gene eae, PCR INTRODUÇÃO Escherichia coli é um dos maiores componentes da microbiota normal anaeróbia facultativa intestinal (DRASAR & HILL, 1974). Algumas amostras de E. coli têm sido reconhecidas como uma das causas de diarréia em humanos (LEVINE, 1987) e animais (PESTANA DE CASTRO et al., 1984; BLANCO et al., 1993; ROBINS- BROWNE et al., 1994). Uma variedade de amostras de E. coli, incluindo as attaching and effacing E. coli (AEEC), enterotoxigênicas (ETEC), necrotoxigênicas (NTEC) e verotoxigênicas (VTEC, hoje conhecidas como STEC), têm sido associadas com diarréia em cães (BEUTIN, 1999). Amostras de E. coli enteropatogênicas (EPEC) são responsáveis por causarem lesões características no epitélio intestinal denominadas de attaching and effacing (A/E). Essas lesões são caracterizadas pela destruição das microvilosidades e proliferação de filamentos de actina e outras proteínas do citoesqueleto, resultando na formação de estruturas semelhantes a pedestais (DONNENBERG & KAPER,1992). Em humanos as amostras de EPEC típicas são caracterizadas pela presença do gene eae e plasmídio EAF (EPEC adherence factor) e geralmente apresentam adesão do tipo localizada em cultura de células HEp-2 e HeLa (TRABULSI et al., 1996). As EPEC atípicas são caracterizadas somente pela presença do gene eae e geralmente apresentam adesão do tipo localizada-like (TRABULSI et al., 1996). Esse gene produz uma proteína de membrana conhecida como intimina, sendo responsável pelo contato íntimo entre a bactéria e a célula epitelial (JERSE et al., 1990). O plasmídio EAF contém uma seqüência de genes, genericamente denominados bfp, que codifica uma fímbria denominada de bundle-forming pilus (BFP) (SOHEL et al., 1996), envolvido na aderência localizada às células epiteliais (NATARO et al., 1985). Algumas amostras de E. coli, além de possuírem o gene eae, podem apresentar também toxinas semelhantes às da Shigella dysenteriae, conhecidas como shiga-toxinas (Stx1 e Stx2) (O BRIEN & HOLMES, 1984). Essas amostras são denominadas de shiga-toxins Escherichia coli ( STEC) ou entero-hemorrágicas (EHEC) (NATARO & KAPER, 1998), quando enquadradas em sorotipos responsáveis, em humanos, por colite hemorrágica e pela sindrome hemolítica urêmica (SHU), que também na sua maioria possui o gene eae. Portanto para identificar as EPEC, quer de origem humana quer animal, é importante verificar a ausência dessas citoxinas. A ocorrência de AEEC em cães não foi relatada ainda no Brasil, encontrando-se somente relatos em outros países (BROES et al., 1988 e DROLET et al., 1994) que verificaram a presença dessas bactérias em cães no Canadá). Alguns autores, como DROLET et al. (1994), denominam, atualmente, essas amostras de dog EPEC ou DEPEC. No Brasil, não existe nenhum relato sobre a ocorrência de amostras de A/E ou DEPEC isoladas de cães. Deste modo, o nosso objetivo principal nesta pesquisa foi verificar, técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), a presença desses marcadores de virulência (gene eae, bfpa e plasmídio EAF) em amostras de E. coli isoladas de cães com diarréia e normais. Essas amostras também foram testadas pela PCR em relação à possível ocorrência de genes produtores de shiga-toxinas (stx). MATERIAL E MÉTODOS Coleta e isolamento Neste trabalho foram examinadas fezes de 146 cães com diarréia e 36 cães normais. As fezes foram coletadas da região anal de animais de várias faixas etárias e de diferentes localidades. Parte desta coleta foi realizada em dois hospitais veterinários da cidade de Campinas e em clínicas veterinárias dos municípios de São Paulo, Valinhos e São Bernardo do Campo. Em virtude do número de amostras coletadas nos hospitais ter sido reduzido, depois

3 ARS VETERINARIA, 17(3): , de três a quatro meses do começo da pesquisa, iniciada em março de 1998, foi resolvido estender esta coleta à cidade de São Paulo, de modo mais amplo, contando para tal com o Canil da Sociedade Protetora dos Animais. Esta coleta, utilizando-se para esta conduta suabes estéreis, foi sempre acompanhada por um veterinário, escolhendo-se somente animais jovens, em sua maioria com menos de três meses de idade, e que apresentassem sinais de diarréia. Algumas destas amostras foram isoladas de cães com suspeitas clínicas de parvovirose, cinomose e outras infeções, reforçando a hipótese das DEPEC também poderem atuar como agentes em co-infecções. Em todas as coletas os materiais foram imediatamente encaminhados para os Laboratórios de Microbiologia do Instituto de Biologia na Unicamp e do Instituto de Ciências Biomédicas da USP para serem processados. O isolamento de E. coli foi realizado pela semeadura das fezes em placas contendo o meio ágar MacConkey e incubação destas por horas a 37 C. A identificação da espécie Escherichia coli foi feita utilizando métodos convencionais usados nesses laboratórios, baseados nos resultados das semeaduras em meios de EPM (Escola Paulista de Medicina), MILi- motilidade-indol-lisina (TOLEDO et al., 1982a; TOLEDO et al., 1982b) e citrato (EDWARDS & EWING, 1972). Reação em cadeia da polimerase ( PCR) Como triagem foi realizado o teste de PCR para o gene eae do material de um raspado da zona de crescimento confluente de cada placa de MacConkey. Para as placas que apresentaram resultado positivo para esse gene, foram selecionadas e identificadas entre 10 e 50 colônias de E. coli por meio de provas bioquímicas já citadas. Essas colônias foram novamente testadas para o gene eae pelo teste de PCR. As colônias positivas para esse gene foram testadas para a presença de bfpa e genes que codificam shiga-toxinas (stx1 e stx2), também pela técnica de PCR. Para o teste de PCR, 10μL de DNA molde foram misturados com 2,5 U de Taq polimerase (Gibco BRL), 50 ρmol de cada iniciador, 200 μm de deoxinucleosídeo trifosfato (dntps), 1,5 Mm de MgCl 2 e 1x PCR buffer (Gibco BRL), num volume final de 100μL. O DNA molde a ser amplificado foi extraído pela fervura, em banho por 10 minutos, das culturas oriundas das colônias acima citadas, suspensas em tubos eppendorf com 100μL de água Mili-Q Depois de uma desnaturação inicial a 94 C por 10 minutos, o material foi submetido a 30 ciclos térmicos de 94 C (desnaturação) por 1 minuto, X C (temperatura de anelamento variável de acordo com a porcentagem de CG dos iniciadores) por 1 minuto e 72 C (extensão) por 1minuto. As reações foram feitas num Termociclador, marca MJ Research, USA. Um volume de 10 μl de cada reação (fragmento amplificado) foi submetido a eletroforese em gel de agarose a 1% e em seguida corado em brometo etídio, sendo depois visualizado através de um transiluminador (Ultra Violet Products). Os produtos amplificados para os genes eae, bfpa, stx1 e stx2 corresponderam a bandas de 815 pb, 326 pb, 894 pb e 478 pb, respectivamente. Para a amplificação do gene eae foram usados dois iniciadores (GANNON et al., 1993): EAE1 5 ACGTTGCAGCATGGGTAACTC 3 e EAE2 5 GATCGGCAATTTCACCTG 3, com temperatura de anelamento de 56 C. Para o bfpa foram utilizados 2 iniciadores (GUNZBURG et al., 1995): BFP1 5 AATGGTGCTTGCGCTTGCTGC 3 e BFP2 5 GCCGCTTTATCCAACCTGGTA 3, com temperatura de anelamento de 63 C. E para stx1 e stx2, quatro iniciadores (BLANCO et al., 1994) : STx1-A 5 CAGTTAATGTGGTGGCGAAG 3, STx1-B 5 CTGCTAATAGTTCTGCGCATC 3, STx2-A 5 CTTCGGTATCCTATTCCCGG 3 e STx2-B 5 GGATGCATCTCTGGTCATTG 3, com temperatura de anelamento de 55 C. Para todos os testes foram utilizados controles positivo e negativo. A amostra de E. coli E2348/69 foi utilizada como controle positivo para o genes eae e bfpa. O sorotipo O157:H7 para stx1 e stx2, e o sorotipo K12C600, como padrão negativo para todos os testes. RESULTADOS Das 146 amostras de fezes de cães com diarréia e 36 de cães normais, apenas nove de cães com diarréia e duas de cães normais não apresentaram crescimento bacteriano em placas de ágar MacConkey. Entre as amostras isoladas, 22 apresentaram amplificação com iniciadores para o gene eae no raspado da zona de crescimento das placas de meio de cultura (triagem). Destas 22, três eram oriundas de cães sem diarréia. Para o isolamento das 22 amostras, de cada espécime fecal semeado em meio de MacConkey, cerca de 10 a 50 colônias de E. coli foram examinadas pela PCR, para detecção do gene eae. As amostras positivas na triagem apresentaram uma grande variação entre a relação do número de colônias eae positivas, comparadas com o total de colônias examinadas (Tabela 1). Algumas amostras apresentaram alta freqüência de colônias eae+, como a amostra 008 (100%), e outras apresentaram um freqüência de colônias eae+ bem baixa, como a amostra B17 (2%). Os resultados positivos para a amplificação do fragmento de 861pb, correspondente à detecção do gene eae, em várias amostras estudadas podem ser vistos na

4 221 ARS VETERINARIA, 17(3): , Tabela 1 Resultados das amostras de E. coli isoladas de cães. Presença dos genes eae, bfpa, das citoxinas STxs, diarréia e relação entre o número de colônias eae positivas e o número de colônias examinadas para cada amostra. AMOSTRAS eae bfpa Stx DIARRÉIA N DE COLÔNIAS POSITIVAS/ N DE COLÔNIAS TESTADAS /10 HE /10 HE /10 HE /10 HE /10 HE /10 SPA /10 SPA /10 B /10 B2N /30 B /40 B /10 B /50 S /50 S /50 BIO /10 BIO /10 BIO /50 C /10 C /10 SB /10 QSF /10 N O Número; eae- gene que codifica para a proteína de membrana externa, denominada intimina; bfpa- Um dos genes responsáveis pela codificação do bundle forming pilus ; Stx- Toxina de Shiga ou Shiga-toxina; + ou presença ou ausência do gene, fator de virulência, ou diarréia, respectivamente. Figura 1. Das 22 amostras, apenas culturas de duas colônias (S6 e C27) amplificaram com iniciadores para o gene bfpa, sendo ambas isoladas de cães com diarréia. Nenhuma das amostras estudadas apresentou amplificação com iniciadores para os genes stx1 e stx2. DISCUSSÃO A presença do gene eae e a ausência das toxinas Stxs em 22 amostras de E. coli isoladas de cães demonstram a presença de E. coli enteropatogênicas (EPEC) nesses animais, quer com diarréia quer aparentemente normais. Neste trabalho encontramos duas amostras eae positivas que também amplificaram com iniciadores para o gene bfpa. Portanto essas amostras se enquadrariam entre as DEPEC típicas. Apesar disso ocorreu uma grande predominância de amostras DEPEC atípicas (sem BFP e sem o plasmídio EAF) entre as amostras eae positivas. Como DEPEC foi encontrada tanto em cães com diarréia como em cães sem diarréia, isso nos leva a crer que esses cães, ainda que aparentemente sadios, possam atuar como portadores para outros animais e para humanos. Algumas amostras apresentaram elevada porcentagem de colônias de E. coli que eram portadoras do gene eae (número de colônias eae positivas/ total de colônias testadas), como as amostras SB2 (100%) e C32 (100%), em relação às quais se pode afirmar que possivelmente as mesmas eram na realidade agentes etiológicos primários dos casos de diarréia nesses cães. Outras apresentaram baixas porcentagens, como as amostras B17 (2%) e BIO12 (2%). Em relação a estas últimas, a baixa porcentagem de colônias eae+ dificultou muito o isolamento das DEPEC, sendo necessário selecionar muitas colônias, mais precisamente entre 40 e 50 por cultura, o que pode sugerir serem esses cães portadores, como resultado de doença ou infecção recente ou remota. A presença de marcadores de virulência nessas amostras nos leva a crer que as mesmas apresentem potencial genotípico para causarem a lesão A/E (DONNENBERG & KAPER, 1992 ) no epitélio intestinal desses cães, podendo conseqüentemente desenvolver diarréia nesses animais. Vale ressaltar que essas amostras apresentaram os genes necessários para a codificação e formação da lesão A/E. Todavia, a presença dos genes eae e bfpa só tem significado se for confirmada a sua expressão por outros métodos. No caso do gene eae, a produção de intimina foi confirmada por western blot (dados não mostrados), porém no que concerne ao gene bfpa, os experimentos estão em andamento para que se confirme a sua expressão, também por esta última técnica. Por outro lado, levando-se em conta que os

5 ARS VETERINARIA, 17(3): , Figura 1- Resultados da PCR para o gene eae de algumas amostras de Escherichia coli isoladas de cães, mostrando fragmentos amplificados de 815pb (canaletas 4 a 13); canaleta 1: (Ladder 1Kb, Gibco); canaleta 2 : Amostra de E.coli E2348/69 (controle positivo) e canaleta 3: E. coli K12 (controle negativo) marcadores de virulência de amostras DEPEC são muito semelhantes aos encontrados em amostras EPEC (humanos) (DROLET et al., 1994), principalmente quando presentes os genes que codificam para o BFP e o plasmídio EAF, podemos acreditar que esses animais possam servir como eventuais fontes de infeção para o homem, embora dados da literatura não relatem ainda esses fatos (TRABULSI, comunicação pessoal). REFERÊNCIAS BEUTIN, L. Escherichia coli as a pathogen in dogs and cats. Review. Veterinary Research, v.30, p , BLANCO, M., BLANCO, J.E., RAMOS, J. Enterotoxigenic, verotoxigenic and necrotoxigenic Escherichia coli isolated from cattle in Spain. American Journal of Veterinary Research, v. 54, p , BLANCO, M., BLANCO, J.E., GONZÁLEZ, E. A., GOMES, T.A.T., ZERBINI, L.F., YANO, T., PESTANA DE CASTRO, A.F. Genes coding for shiga-like toxins in bovine verotoxin producing Escherichia coli (VTEC) strains belonging to differents O:K:H serotypes. Veterinary Microbiology, v. 42, p , BROES, A., DROLET, R., JACQUES, M., FAIRBROTHER, J.M., JOHNSON, W.M. Natural infection with an attaching and effacing Escherichia coli in a diarrheic puppy. Canadian Journal of Veterinary Research, v.52, p , DONNENBERG, M.S., KAPER, J.B. Enteropathogenic Escherichia coli. Infection and Immunity, v.60, p , DRASAR, B.S., HILL, M.J. Human intestinal flora. London. Academic Press, Ltd., 1974, p DROLET, R., FAIRBROTHER, J.M., HAREL, J., HELIE, P. Attaching and effacing and enterotoxigenic Escherichia coli associated with enteric colibacillosis in dog. Canadian Journal of Veterinary Research, v. 58, p , EDWARDS, P.R., EWING, W.H. Identification of Enterobacteriaceae. Burgess Publishing CO. Mineapolis, GANNON, V.P.J., RASHED, M., KING, R.K., THOMAS, E.J.G. Detection and characterization of the eae gene of shiga-like toxin producing Escherichia coli using polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiolology, v.31, p , GUNZBURG, S.T., TORNIEPORTH, N.G., RILEY, L.W. Identification of enteropathogenic Escherichia coli by PCR-bases detection of the bundle forming pilus gene. Journal of Clinical Microbiolology, v.33, p ,

6 223 ARS VETERINARIA, 17(3): , JERSE, A.E., YU, J., TALL, B.D., KAPER, J.B. A genetic locus of enteropathogenic Escherichia coli necessary for the production of attaching and effacing lesions on tissue culture cells. Proceedings of National Academy of Science, v.87, p , LEVINE, M.M. Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic and enteroadherent. Journal of Infectious Diseases, v.155, p , NATARO, J. P., KAPER, J.P. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews, v.11, n.1, p , NATARO, J.P., SCALETSKY, I.C.A., KAPER, J.B., LEVINE, M.M., TRABULSI, L.R. Plasmid-mediaded factors confering diffuse and localized adherence of enteropathogenic E. coli. Infection and Immunity, v. 48, p , O BRIEN, A.D., HOLMES, R.K. Shiga and Shiga-like toxins. Revista de Microbiologia, v.51, p , PESTANA DE CASTRO, A.F., SERAFIM, M.B., BRITO, J.R.F., BARCELLOS, D.S.E.N., COLLI, I.A.G. Virulence factors present in cultures of Escherichia coli isolated from pigs in the region of Concordia, SC, Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.4, p ,1984. ROBINS-BROWNE, R.M., ADAMS, L.M., WOOD, B.V., MOISIDIS, A.V., OKREJANY, E.O., O GORMAN, L.E. Adherence characteristics of attaching and effacing strains of Escherichia coli from rabbits. Infection and Immunity, v.62, p , SOHEL, I., PUENTE, J.L., RAMER, S..W., BIEBER, D., WU, C-Y., SCHOOLNIK, G.K. Enteropathogenic Escherichia coli: Identification of a gene cluster coding for bundle-forming pilus morphogenesis. Journal of Bacteriology, v.178, p , TOLEDO, M.R.F., FONTES, C.F., TRABULSI, L.R. EPM- Modificação do meio Rugai e Araújo para realização simultânea dos testes de produção de gás a partir de glicose, H 2 S, urease e triptofano desaminase. Revista de Microbiologia, v.13, p , 1982a. TOLEDO, M.R.F., FONTES, C.F., TRABULSI, L.R. Um meio para a realização dos testes de motilidade, indol e lisina descarboxilase. Revista de Microbiologia, v.13, p.230-5, 1982b. TRABULSI, L.R., CAMPOS, L.C., WHITTAN, T.S., GOMES, T.A.T., RODRIGUES, J., GONÇALVES, A.G. Traditional and non-traditional enteropathogenic Escherichia coli serogroups. Revista de Microbiologia, v.27, p.1-6, 1996.