DETECÇÃO DOS GENES eae e bfpa DE Escherichia coli ISOLADAS DE CARCAÇAS E VÍSCERAS DE AVES ABATIDAS NO ESTADO NO TOCANTINS, BRASIL

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1 DETECÇÃO DOS GENES eae e bfpa DE Escherichia coli ISOLADAS DE CARCAÇAS E VÍSCERAS DE AVES ABATIDAS NO ESTADO NO TOCANTINS, BRASIL Valmárcia Rodrigues dos Reis; Silvia Minharro 2 ; Helcileia Dias Santos 3 1 Aluno do Curso de Medicina Veterinária; Campus de Araguaína; valmarcia_rdr@hotmail.com PIBIC/CNPq, PIBITI/CNPq ou PIBIC/CNPq/AF ou PIBIC/UFT ou PIVIC/UFT 2 Orientador(a) do Curso de Medicina Veterinária; Campus de Araguaína; silviaminharro@gmail.com 3 Co-orientador(a) do Curso de Medicina Veterinária; Campus de Araguaín; hdsantos@uft.edu.br RESUMO O objetivo deste trabalho consistiu na verificação e identificação dos genes eae e bfpa de Escherichia coli isoladas de carcaças e vísceras de aves abatidas no estado do Tocantins por meio de técnica em cadeia da polimerase (PCR). Das 120 amostras de Escherichia coli isoladas de swabs de traqueia, sacos aéreos e de coração e fígado, o PCR demonstrou que 9 (7,5%) foram positivas para o gene eae (eae +) e 32 (26,66%) para o bfpa (bfpa +). Em nenhuma amostra foram isolados os dois genes simultaneamente, correspondendo aos genes da E. coli entertopatogência atípica (aepec), ou seja, bfpa +, eae, que difere da maioria dos resultados encontrados no Brasil, sendo desta forma importante a avaliação periódica da contaminação bacteriana ao logo de todo processamento de abate e em diferentes espécies animais, a fim de garantir medidas de higiene em diferentes fases do abate para minimizar a contaminação microbiana, evitando riscos aos consumidores, em especial crianças, bem como avaliar a dinâmica de distribuição de bactérias patogênicas. Palavras-chave: EPEC; PCR; inspeção. INTRODUÇÃO Entre os contaminantes da carne de aves está a Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) uma bactéria patogênica, Gram-negativa, anaeróbia facultativa, que se diferencia das outras bactérias pelo fato de expressar seus mecanismos de patogenicidade por meio de fatores de virulência como os genes intimina (eae) e o gene estrutural de Pili responsável pela aderência (bfpa) (NATARO; KAPER, 1998). A EPEC pertence a uma categoria importante de bactérias diarreiogênica normalmente causadora de surtos de diarreia e responsáveis por causarem lesões e destruição nas microvilosidades do intestino (GYLES; FAIRBROTHER, 2010). A EPEC subdivide-se em típicas e atípicas, onde a Página 1

2 EPEC típica possuem os genes eae e bfpa, enquanto que a atípica apresenta apenas o gene eae ou o bfpa (ARANDA; FAGUNDES-NETO; SCALETSKY 2004). Desta forma, o objetivo deste trabalho consistiu na verificação e identificação dos genes eae e bfpa de Escherichia coli isoladas de carcaças e vísceras de aves abatidas no Estado do Tocantins por meio de técnica em cadeia da polimerase (PCR) para determinação dos fatores de virulência. MATERIAL E MÉTODOS Foram estudadas 120 amostras de Escherichia coli isoladas de swabs de sacos aéreos, fenda palatina e traquéia (Sistema respiratório superior-srs) e de fígado e coração de aves condenadas e liberadas para consumo, abatidas em frigoríficos com serviço de inspeção federal no estado do Tocantins entre anos de 2010 a Para extração do DNA foi utilizado a termo-extração conforme o protolo de Costa et al. (2010). Para detecção dos genes eae e bfpa foi utilizada a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), sendo preparados 25 µl do mix, 0,5 X solução tampão IV B (Phoneutria ); dntps (10 mm) ; primer F (20 pmol/µl); primer R (20 pmol/µl); 0,2 unidades de Taq DNA polimerase DNA (5U/µL); DNA teste ( nm) (Costa et al, 2010). Para amplificação do gene codificante da Fimbria BFP (bfpa) foram utilizados os oligonucleotídeos senso 5 CAATGGTGCTTGCGCTTGCT3 e reverso 5 GCCGCTTTATCCAACCTGGT 3` conforme Tornieporth et al. (1995), com 350 pb. E para a Intimina (eae) foram utilizados os oligonucleotídeos senso 5 AAACAGGTGAAACTGTTGCC 3 e reverso 5 CTCTGCAGATTAACCTCTGC 3 conforme Yu; Karper, (1992) com 454 pb. Para amplificação, a desnaturação inicial a 94 C por 5 minutos, e uma sequência de 35 ciclos com 94ºC por 90 segundos, 53 ºC por 90 segundos, 72 C por 90 segundos, em seguida a extensão final de 72 C por 10 minutos, permanecendo estocada a 4 ºC no final da reação (COSTA et al, 2010). A visualização foi realizada em gel de agarose 1,5%, contendo 0,5 μg/ml de brometo de etídeo, visualizados em transluminador de luz ultravioleta e fotodocumentados. Para avaliação e associação dos resultados de identificação foram utilizados os testes de frequência absoluta e relativa, teste de Quiquadrado ou de Fischer a 5% de significância (SAMPAIO, 2007). RESULTADOS E DISCUSSÃO Das 120 amostras de Escherichia coli isoladas de swabs de traqueia, sacos aéreos e de vísceras coração e fígado das aves abatidas sob inspeção federal, o PCR demonstrou que 9 amostras Página 2

3 (7,5%) foram positivas para o gene eae (eae +) e 32 (26,66%) para o bfpa (bfpa +). Em nenhuma amostra foram isolados os dois genes simultaneamente. Das 32 amostras positivas para o gene bfpa, 17 (14,2%) amostras foram de aves condenadas e 15 (12,5%) de aves liberadas para o consumo. Dentre as amostras clínicas pesquisadas, 13 (10,8%) isolados de fígados foram positivos para o gene bfpa, subdivididos em 9 (7,5%) amostras condenadas por lesões macroscópicas e 4 (3,3%) de fígados liberados. De coração, 8 (6,7%) foram positivas, sendo 3 (2,5%) de vísceras condenadas e 5 (4,2%) de vísceras sem alterações macroscópicas. E de swabs do sistema respiratório superior (SRS) foram 9 amostras positivas (9,2%), 5 (4,2%) de carcaças condenadas e 6 (5%) de carcaças liberadas. Não houve diferença entre os resultados obtidos entre os produtos condenados daqueles liberados para o consumo, não levando em conta o tipo de amostra clinica (p= 0,17) e nem entre os diferentes tipos de amostras de produtos liberados para o consumo (p=0,85). Porém, dentro das amostras clínicas condenadas a frequência observada no fígado foi maior do que das demais (p=0,01) pelo teste exato de Fischer a 5% de significância. Provavelmente devido o fígado está sujeito à presença de microorganismos, por ser o principal órgão responsável pela depuração sanguínea, e receber tanto sangue arterial, quanto sangue venoso do trato gastrintestinal, habitat natural da EPEC (MACLACHLAN; CULLEN, 1998). Quanto ao gene eae das 9 amostras positivas, 5 (4,2%) foram identificadas em aves condenadas e 4 (3,3%) em produtos liberados para o consumo. Da subdivisão dos resultados por amostras clínicas 3 (2,5%) foram identificadas no coração, destas, 1 (0,8%) em vísceras condenadas e 2 (1,7%) em vísceras liberadas. Para o fígado e o SRS, o gene eae foi identificado em 3 (2,5%) amostras, 2 (1,7%) condenadas e 1 (0,8%) liberada. Não houve diferença entre os resultados de isolados de produtos condenados daqueles liberados para o consumo (p= 0,47), nem entre as amostras clínicas por grupo condenados (p=0,79) ou liberados para consumo (p=0,72) pelo teste exato de Fischer a 5% de significância. Ainda existem poucos estudos feitos com produtos derivados de aves para identificação dos genes eae e bfpa no Brasil. Resultados semelhantes a este trabalho, foram encontrados na Tailândia, em que EPEC atípicas (aepec) bfp +; eae - foram isoladas em maior frequência, em carne de aves, seguido de suínos (PANNUCH et al., 2014). Entretanto no trabalho de Silva et al. (2011) o gene bfpa não foi encontrado nas amostras de fígados de frangos analisadas, provenientes de dois abatedouros avícolas na Bahia não foi encontrado o gene bfpa. Página 3

4 A aepec (eae +, bfpa -) também tem sido relatada como principal agente etiológico associado em quadros de diarreia infantil no estado de Rondônia (MATOS et al., 2015), e Bangladesh (ROY et al., 2014). Desta forma levanta-se a hipótese de que as aves funcionam como albergue de patógenos que acometem os humanos e até mesmo como fontes de infecção zoonóticas (TRABULSI et al., 2002), como caso de aepec. A diferença entre os achados neste trabalho da aepec ser bfpa +, eae pode ser explicado pela dinâmica populacional complexa da E. coli, com alta diversidade genética de populações e grande variabilidade temporal, o que a torna extremamente útil como um indicador de qualidade de alimentos e importante marcador no rastreamento de origem da contaminação microbiana (ANDERSON et al, 2006). Doenças transmitidas por alimentos causadas por esse tipo de bactérias podem ocorrer pelo consumo de carne de frango contaminada, ou por contaminação ambiental. Dessa forma podemos perceber a importância de avaliação da contaminação bacteriana ao logo de todo processamento de abate. Sendo um importante problema de saúde pública e uma das principais causas de diarreia infantil (GYLES; FAIRBROTHER, 2010; MACHADO et al. 2014). As amostras de E. coli isoladas apresentaram perfil de virulência de aepec diferente do que normalmente é encontrado, podendo se tornar um importante marcador epidemiológico da fonte de contaminação em humanos, uma vez que a identificação dos fatores de virulência causada por EPEC é de extrema importância. Além do que reforça a necessidade de controle e implementação das medidas de higiene em diferentes fases do abate para minimizar a contaminação microbiana de origem fecal, evitando riscos aos consumidores, em especial crianças. LITERATURA CITADA ANDERSON M. A.; WHITLOCK, J. E.; HARWOOD. V. J. Diversity and Distribution of Escherichia coli Genotypes and Antibiotic Resistance Phenotypes in Feces of Humans, Cattle, and Horses. Applied and Environmental Microbiology, v. 72, n. 11, p , ARANDA, K. R.; FAGUNDES-NETO, U.; SCALETSKY, I. C. Evaluation of multiplex PCRs for diagnosis of infection with diarrheagenic Escherichia coli and Shigella spp. Journal of Clinical Microbiology, v. 42, p , COSTA, A. R. F. et al. Desenvolvimento de PCR multiplex para detecção e diferenciação de categorias de Escherichia coli diarreiogênicas. Revista Pan-Amazônica de Saúde, v.1, n.2, p.77-84, Página 4

5 GYLES C. L.; FAIRBROTHER J. M. Escherichia coli. In: Gyles C.A., Prescott J.F., Songer J.G. & Thoen C.O. (Eds), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals. Wiley-Blackwell, Iowa, p , MACHADO P. A. L. et al. Prevalência e genotipagem de Escherichia coli patogênica em carcaças de suínos abatidos em frigoríficos comerciais na Região Sul do Brasil. Revista Brasileira de Higiene e Sanidade Animal, v. 8, n. 1, p , MACLACHLAN, N.J. CULLEN, J.M. Fígado, sistema biliar e pâncreas exócrino. In: THOMSON, R.G. (Ed.). Patologia Veterinária Especial. 2.ed. Porto Alegre: Artmed,1998. p MATOS, B. N. et al. Adherence and virulence genes of Escherichia coli from children diarrhoea in the Brazilian Amazon. Brazilian Journal of Microbiology, v. 46, n. 1, p , NATARO, J. P; KAPER, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews, v. 11, n. 1, p , PANNUCH, M. et al. Quantification of enteropathogenic Escherichia coli from retailed meats. International Food Research Journal, v. 21, n. 2, p , ROY, S. et al. Molecular detection of diarrheagenic Escherichia coli from children with acute diarrhea in tertiary care hospitals of Dhaka, Bangladesh. Asian Journal of Medical Science, v. 5, n. 2, SAMPAIO, I.B.M. Estatística aplicada à experimentação animal. 3 ed. Belo Horizonte: FEP- MVZ, 2007, 265 p. SILVA, I.M.M. et al. Caracterização genotípica dos isolados de Escherichia coli provenientes de frangos de corte. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.63, n.2, p , TRABULSI L. R.; KELLER R.; GOMES T. A. T. Typical and atypical enteropathogenic Escherichia coli. Emerg. The Journal of Infectious Diseases, v. 8, n. 5, p , YU J.; KAPER J.B. Cloning and characterization of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Molecular Microbiology, v. 6, n. 3, p , AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil, Da Secretaria de Ciência e Tecnologia do Tocantins e da Universidade Federal do Tocantins (UFT/PROPESQ). Página 5