26 a 29 de novembro de 2013 Campus de Palmas

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1 SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DA REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) UTILIZANDO AMOSTRAS DE PUNÇÃO BIÓPSIA ASPIRATIVA DE LINFONODO DE CÃES PARA DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL Gessica Hoanna Cunha Bailona 1 ; Helcileia Dias Santos²; Silvia Minharro³ ¹Aluna do Curso de Medicina Veterinária; Campus de Araguaína; gessicahoanna@hotmail.com PIBIC/CNPq ²Orientadora do Curso de Medicina Veterinária; Campus de Araguaína; hdsantos@uft.edu.br ³Co-orientadora do Curso de Medicina Veterinária; Campus de Araguaína; silviaminharro@yahoo.com RESUMO A pesquisa teve como objetivo determinar a sensibilidade e especificidade da PCR utilizando amostras de punção biópsia aspirativa de linfonodo de cães no diagnóstico da Leishmaniose Visceral. O estudo foi realizado na cidade de Araguaína-TO. As amostras foram obtidas através de visitas realizadas a residências onde ocorreram casos humanos positivos de leishmaniose visceral no ano de 2009, selecionadas segundo dados fornecidos pela Secretaria Municipal de Saúde. Foram coletadas amostras de punção biópsia aspirativa de linfonodo de cães presentes no domicílio onde ocorreu o caso, e em casas vizinhas laterais e do fundo. Para a realização da PCR, as amostras de PBA foram acondicionadas em microtubos com solução tampão fosfato-salina (PBS) estéril e armazenada a -20ºC até realização da extração de DNA. A extração de DNA foi realizada conforme protocolo do Kit de extração Purelink genomic lyses/beding buffer (Invitrogen). Foram extraídas e analisadas 68 amostras de DNA do material coletado em linfonodo dos cães. A PCR utilizando material de punção biópsia aspirativa de linfonodo para diagnóstico da leishmaniose visceral, apresentou elevada sensibilidade quando utilizado os primers L1 e L2. Os primers RV1 e RV2 apresentaram menor sensibilidade, porém, para diminuir as chances de reação cruzada com outras espécies do gênero Leishmania, recomenda-se a utilização dos primers RV1 e RV2, por serem específicos para L. i. chagasi e o conhecimento da espécie de Leishmania infectante pode impedir a eutanásia de animais positivos para as Leishmanioses cutâneas. Palavras-chave: Cão, Leishmania, Linfonodo, PCR.

2 INTRODUÇÃO Diferentes técnicas podem ser utilizadas para o diagnóstico de leishmaniose visceral humana e canina. Muitos avanços têm ocorrido nos últimos anos, mas a despeito do grande número de testes disponíveis para o diagnóstico da LV, nenhum apresenta 100% de sensibilidade e especificidade (MAIA; CAMPINO, 2008). O diagnóstico por PCR baseia-se na amplificação in vitro de sequências específicas de nucleótidos presentes no parasita (GOMES et al., 2008). A amplificação de fragmentos de DNA de Leishmania pela PCR pode ser realizada a partir de diferentes tecidos, tais como aspirado de linfonodos, medula óssea e de leucócitos do sangue periférico (IKONOMOPOULOS et al., 2003; MAIA et al., 2009). Além da rapidez na obtenção do resultado, a PCR apresenta a vantagem de requerer quantidades muito pequenas de DNA do agente para um resultado positivo (MARY et al., 2006). Está técnica tem demonstrado ser uma altamente sensível para o diagnóstico da LVC por ser capaz de amplificar o DNA de Leishmania sp. a partir de poucos exemplares de amastigotas presentes na amostra. Apesar de apresentar elevada sensibilidade, ainda não possui aplicabilidade nos programas de controle da LVC devido ao elevado custo e necessidade de laboratórios especializados para realização, mas é considerada uma importante ferramenta de diagnóstico em pesquisas e na elucidação de casos inconclusivos da doença, principalmente em novos focos da doença (ALAM et al., 2009; SRIVASTAVA et al., 2011). Portanto este estudo teve como objetivo determinar a sensibilidade e especificidade da PCR utilizando amostras de punção biópsia aspirativa de linfonodo de cães no diagnóstico da Leishmaniose Visceral. MATERIAL E MÉTODOS O estudo foi realizado na cidade de Araguaína-TO. e as amostras foram obtidas através de visitas realizadas a residências onde ocorreram casos humanos positivos de leishmaniose visceral no ano de 2009, selecionadas segundo dados fornecidos pela Secretaria Municipal de Saúde. Foram coletadas amostras de punção biópsia aspirativa de linfonodo e amostras de sangue de cães presentes no domicílio onde ocorreu o caso e em casas vizinhas laterais e do fundo.

3 A extração de DNA foi realizada conforme protocolo do Kit de extraçãopurelink genomic lyses/beding buffer (Invitrogen). O DNA extraído de minicírculos de kinetoplastos de Leishmania spp foi amplificado em termociclador (Veriti- Life techonologies), utilizando os primers Forward L¹ ( 5 - GGG GAG GGG CGT TCT 3 ) e Reverse L² ( 5 - GGC CCA CTA TAT TAC TAC ACC AAC CCC 3 ) conforme MICHALSKY., et al (2002) para detecção de Leishmania spp. Os primers Forward Rv1 (50-CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3 ) e Reverse Rv2 (5 - CCACCTGGCCTATTTTACACCA-3 ), os quais amplificam uma sequência de 145 pares de bases do fragmento LT1 de kdna, foram utilizados para identificação específica de Leishmania infantum chagasi conforme GOMES et al., (2007). Como controle positivo, foi utilizado DNA extraído de promastigotas de L. i. chagasi proveniente de cultura e como controle negativo amostras negativas em exames sorológico e parasitológico, previamente testadas. RESULTADO E DISCUSSÃO Foram realizadas comparações entre os resultados do exame parasitológico e da reação em cadeia de polimerase (PCR) no diagnóstico da leishmaniose visceral canina, assim como também foram realizadas comparações entre os resultados do teste de reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e reação em cadeia de polimerase (PCR). Considerando o exame parasitológico como padrão-ouro, a PCR apresentou sensibilidade alta (97,06%) quando se utilizou o primer L1L2, o que era esperado, considerando que este primer não é específico para L. i. chagasi, podendo detectar DNA de outras espécies de Leishmania, fato também observado nos estudos de MICHALSKY et al. (2002). Em 2007 Antinori e colaboradores realizaram um estudo clínico comparativo entre técnicas microbiológicas convencionais e um sistema de PCR espécie-específico (primers R223 e R333) para Leishmania e encontraram sensibilidade de 95,7% para PCR de amostras de aspirado de medula e de 98,5% para amostras de sangue de pacientes humanos, enquanto que para o isolamento do parasito em cultura, teste sorológico e microscopia, utilizando material de biópsia de medula óssea, as sensibilidades encontradas foram de 76,2%, 85,5% e 90,2%, respectivamente,

4 resultado semelhante a sensibilidade observada neste estudo quando utilizados os primers L1 e L2. Os primers Rv1 e Rv2 tem demonstrado elevada sensibilidade para diagnóstico de L. infatum (LACHAUD et al., 2002; GOMES et al., 2007), portanto a menor sensibilidade observada neste estudo pode ter ocorrido devido a estes serem específicos para L. infantum, o que justifica o elevado número de falso negativos quando comparados os dois primers, levantando a hipótese de que os animais poderiam estar infectados por outras espécies de Leishmania spp., fato que merece futuras investigações, considerando que outras espécies predominantes no Brasil, como as do complexo L. braziliensis, podem se disseminar por via linfática e serem encontradas no linfonodo (GOMES et al., 2008; HOFFMAN et al., 2012). CONCLUSÃO A PCR utilizando material de punção biópsia aspirativa de linfonodo para diagnóstico da leishmaniose visceral, apresentou elevada sensibilidade quando utilizado os primers L1 e L2. Os primers RV1 e RV2 apresentaram menor sensibilidade, porém, para diminuir as chances de reação cruzada com outras espécies do gênero Leishmania, recomenda-se a utilização dos primers RV1 e RV2, por serem específicos para L. i. chagasi e o conhecimento da espécie de Leishmania infectante pode impedir a eutanásia dos cães falso positivos. O exame parasitológico continua a ser o padrão-ouro para o diagnóstico da leishmaniose, pois apesar de não determinar a espécie de Leishmania, é um método de diagnóstico relevante em países onde a leishmaniose continua sendo um grave problema de saúde pública, mas, sempre que possível, a inserção da PCR é uma ferramenta robusta para pesquisa e confirmação da infecção nos estágios iniciais da doença e em animais assintomáticos. LITERATURA CITADA ALAM, M. Z.; SHAMSUZZAMAN, M. K. A.; KUHLS. K. et al. PCR diagnosis of visceral leishmaniasis in an endemic region, Mymensingh district, Bangladesh. Tropical Medicine International Health, v. 14, n.5. p , ANTINORI, S.; CALATTINI. S.; LONGHI. E. et al. Clinical use of polymerase chain reaction performed on peripheral blood and bone marrow samples for the diagnosis and monitoring of visceral leishmaniasis in HIV infected and HIV uninfected patients: a

5 single-center, 8-year experience in italy and review of the literature. Clinical Infectious Diseases, v. 44, n. 12, p , GOMES, A. H. S.; FERREIRA, I. M. R.; LIMA, M. L. S. R. et al. PCR identification of Leishmania in diagnosis and control of canine leishmaniasis. Veterinary Parasitology, v. 144, n. 3-4, p , GOMES, Y. M.; CAVALCANTI, M. P.; LIRA, R. A. Diagnosis of canine visceral leishmaniasis: Biotechnological advances. The Veterinary Journal, v. 175, n. 1, p , HOFFMANN, A. R.; NAVARRO, I. T.; CAMARGO, V. et al.leishmania amazonensis em cão com quadro clínico de leishmaniose visceral no Estado do Paraná, Brasil relato de caso. Semina: Ciências Agrárias, v. 33, suplemento 2, p , 2012 IKONOMOPOULOS, J.; KOKOTAS, S.; GAZOULI, M. et al. Molecular diagnosis of leishmaniasis in dogs: comparative application of traditional diagnostic methods and the proposed assay on clinical samples. Veterinary Parasitology, v. 113, n. 2, p , LACHAUD, L.; MARCHERGUI-HAMMAMI, S.; CHABBERT, E. et al. Comparison of six PCR methods using peripheral blood for detection of canine visceral leishmaniasis. Journal of Clinical Microbiology, v. 40, n. 1, p , MAIA, C.; CAMPINO, L. Methods for diagnosis of canine leishmaniasis and immune response to infection. Veterinary Parasitology, v. 158, n. 4, p , MAIA, C.; RAMADA, J.; CRISTOVÃO, J. M. et al. Diagnosis of canine leishmaniasis: Conventional and molecular techniques using different tissues. The Veterinary Journal, v. 179, n.1, p , MARY, C.; FARAUT. F.; DROGOUL. M. P. et al. Reference values for Leishmania infantum parasitemia in different clinical presentations: quantitative polymerase chain reaction for therapeutic monitoring and patient follow-up. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 75, n. 5, p , MICHALSKY, E. M.; FORTES-DIAS, C. L.; PIMENTA, P. F. et al. Assessment of PCR in the detection of Leishmania spp in experimentally infected individual phlebotomine sandflies (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae). Revista do Instituto de Medicina Tropical, v. 44, n. 5, p , SRIVASTAVA, P.; DAYAMA, A.; MEHROTRA, S. et al. Diagnosis of visceral leishmaniasis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v.105, n. 1, p. 1-6, AGRADECIMENTO O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil e com o apoio da Secretaria de Ciência e Tecnologia do Estado do Tocantins - SECT.