DIAGNÓSTICO MOLECULAR COMO CONTROLE DE PATÓGENOS NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS

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1 DIAGNÓSTICO MOLECULAR COMO CONTROLE DE PATÓGENOS NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS C.W. Stocco 1, L. de Almeida 2, J.V.M. Bittencourt 3 1-Programa de Pós Graduação em Engenharia de Produção Universidade Tecnológica Federal do Paraná CEP: Ponta Grossa PR Brasil Telefone: (42) (claudiawalus@alunos.utfpr.edu.br) 2- Programa de Pós Graduação em Engenharia de Produção Universidade Tecnológica Federal do Paraná CEP: Ponta Grossa PR Brasil Telefone: (42) (lu_almeidaf@yahoo.com.br) 3- Programa de Pós Graduação em Engenharia de Produção Universidade Tecnológica Federal do Paraná CEP: Ponta Grossa PR Brasil Telefone: (42) (julianavitoria@utfpr.edu.br) RESUMO Este trabalho tem como objetivo verificar a presença de Escherichia coli em frigorifico, através do perfil molecular utilizando a de PCR Reação em Cadeia da Polimerase. O desenvolvimento do trabalho resume-se em diagnóstico de pontos críticos no controle de qualidade do processamento de um frigorífico da região dos Campos Gerais - Paraná, através de diagrama decisório. Após coleta de amostras durante o processamento, por swabs, utilizados para isolamento por microbiologia para a presença de Escherichia coli. Após isoladas, foi identificado o perfil genético das amostras. Para o estabelecimento do perfil genético, foi realizada o isolamento de DNA, seguida de amplificação por PCR com os primers universais rd1 e fd1. Pelo diagrama decisório, foi identificado 25 pontos para a coleta de amostras, sendo 10 pontos confirmados por microbiologia com Escherichia coli, que predomina na microbiota anaeróbica facultativa do trato gastrointestinal dos humanos e dos animais de sangue quente, como os bovinos. ABSTRACT This study aims to verify the presence of Escherichia coli in refrigerator by molecular profile using the PCR - Polymerase Chain Reaction. The development of the work summarized in the diagnosis of critical points in quality control processing of a refrigerator of the Campos Gerais region - Paraná, through decision diagram. After collection of samples during processing by swabs used for insulation microbiology for the presence of Escherichia coli. Once isolated, the genetic profile of the samples was identified. To establish the genetic profile, the DNA isolation was performed, followed by PCR amplification with primers fd1 and rd1. The decision diagram, was identified 25 points for the collection of samples, and 10 points confirmed by microbiology with Escherichia coli, which predominates in facultative anaerobic microflora of the gastrointestinal tract of humans and warmblooded animals such as cattle. PALAVRAS-CHAVE: Microrganismos Patogênicos; Biofilmes Microbianos; Indústria de Cárneos; Perfil Genético. KEYWORDS: Pathogenic Microorganisms; Microbial Biofilms; The Meat Industry; Genetic Profile. 1. INTRODUÇÃO Conforme a World Health Organization (WHO, 2002), as carnes ocupam o segundo lugar entre os produtos de origem animal, envolvidos em doenças transmitidas por alimentos (DTA s). O

2 crescimento da demanda mundial por produtos cárneos, pode preocupar os consumidores com uma alimentação saudável, voltando-se ao aspecto de segurança alimentar. Sendo assim, é indispensável oferecer maior atenção a gestão da qualidade em frigoríficos, associando com a segurança alimentar, com os padrões microbiológicos, á sanidade e a ausência de substâncias nocivas (Toledo, 2001). Processos de higienização deficientes ou inexistentes, podem levar a formação de biofilmes por microrganismos sobre superfícies. Sendo assim, a natureza dos biofilmes pode dificultar a limpeza e a sanitização. O desenvolvimento de um biofilme depende de fatores como a características do microrganismo, o material de aderência, substrato presente, ph, temperatura do meio, entre outros fatores. Onde ocorre a adesão inicial de um microrganismo a sua superfície, em seguida, há o acúmulo de células viáveis, permanecendo sob uma matriz de exopolissacarídeos. 1.1 Microrganismos Produtores de Biofilme no Ambiente Industrial No processamento industrial, os biofilmes são avaliados um problema nas áreas de processamento de produtos frescos e lácteos, além do processamento de aves e carnes vermelhas (Chen et al., 2007). Inúmeros microrganismos são capazes de aderir a uma superfície e formar biofilmes, sendo divididos em deteriorantes e patogênicos (Nitschke, 2006). Um grande número de microrganismos alteradores e patogênicos são capazes de participar com maior ou menor intensidade desses processos de adesão. Branda et al. (2005), reconheceram a capacidade de bactérias em formar celulose extracelular, entre eles Salmonella thyphimurium, Escherichia coli e Gluconaetobacter xylunus. 1.2 Escherichia coli A Escherichia coli é uma bactéria anaeróbica facultativa, gram negativa, pertencente à família Enterobacteriaceae, originária da flora intestinal, forma de bacilo, medindo aproximadamente 0,5 µm de largura e 2 µm de comprimento (Tortora et al., 2005). Microrganismo habitante do trato intestinal de humanos e animais endotérmicos, mas, se direcionado para a circulação sanguínea, pode ser capaz de provocar doenças e infecções no organismo hospedeiro. Além disso, pode se contrair cepas da bactéria pela ingestão de água ou alimentos contaminados, pelo contato com animais doentes e instrumentos médicos contaminados, podendo causar graves infecções no trato urinário, sendo uma das infecções mais contraídas por seres humanos (Boland et al 2000). 1.3 PCR Reação em Cadeia da Polimerase Reação em cadeia da polimerase é um método in vitro para a amplificação de material genético, por meio de uma pequena quantidade de ácido nucleico, obtendo um fragmento especifico de DNA de sequência definida (Saiki et al., 1988). Instrumento composto por dois oligonuceotídeos sintéticos, complementares as sequencias das fitas opostas do DNA alvo em posições contrárias dos extremos do segmento a ser amplificado. Oligonuceotídeos iniciadores, também chamados de primers ajudam na iniciação da replicação das cópias do fragmento alvo (Lane et al. 1985). A amplificação de uma sequência de DNA por PCR, fornece informações para identificar o microrganismo analisado, identificando dentro de uma espécie ou grupo conhecido (Neiva, 2007). A técnica de PCR é uma ferramenta com várias aplicações. Por meio da PCR, a partir de uma molécula de DNA, pode-se gerar inúmeros moléculas similares em poucas horas (Mullis; Faloona, 1987). A utilização da região 16S no sequenciamento, tem base na existência de sequencias conservados nos genes de DNA da menor unidade dos ribossomos, chamado de RNAr 16S. Esta molécula é encontrada em todas as bactérias e é um padrão universal para a sua identificação e classificação (Neiva, 2007). Para identificar microrganismos, pode associar as técnicas de PCR e sequenciamento de DNA. Assim, pode-se identificar fungos e bactérias de forma rápida (Devereux et

3 al, 1996). A técnica de PCR destaca-se da convencional devido ao curto prazo, sendo uma técnica mais precisa, a confirmação do resultado é confiável aliado ao baixo custo (Monteiro, 2015). 2. MATERIAIS E MÉTODOS O método utilizado para a determinação de pontos de coletas, foi baseado no modelo de Diagrama Decisório que orienta a identificação dos Pontos Críticos de Controle (PCC) pela ferramenta de qualidade Análise de Pontos Críticos de Controle (APPCC) baseado em Tobias et al. (2014). Dentre os microrganismos indicados na legislação, optou-se neste trabalho por Escherichia coli, selecionada por suas toxinas e doenças causadas pela sua ingestão em alimentos contaminados. As análises microbiológicas foram realizadas em triplicata e o procedimento foi de acordo com Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos (Silva et al. 2001). Para a extração de DNA das cepas isoladas, foi utilizado o protocolo recomendado por Olivindo et al. (2009). Para a confirmação da extração do DNA, as amostras foram separadas por eletroforese em gel de agarose e fotodocumentadas em transiluminador ultravioleta. A reação de amplificação foi realizada um mix contendo 0,6 µl de primer rd1, 0,6 µl de primer fd1, na concentração de 10 µm, 5 µl de solução tampão de PCR, 2,5 µl de tampão, 1,5 µl de MgCl2 na concentração de 50 mm, 2 µl da mistura de nucleotídeos na concentração, 0,4 µl de solução Taq polimerase, 2 µl do DNA bacteriano extraído anteriormente, e 15,4 µl água Milli-Q. Para amplificação do gene foram utilizados os inicializadores universais para o domínio bactéria fd1 (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) e rd1 (5 - AAGGAGGTGATCCAGCC-3 ). Metodologia de amplificação descrita por Olivindo (2009), sendo 1 minuto a 96 C, 30 ciclos de 20 segundos a temperatura de 64 C, para o anelamento dos primers será de 30 segundos a 55 C e mais 2 minutos a 72 C, mais 5 minutos a 72 C para a extensão final. Para o sequenciamento da região do DNA que codifica o gene 16S rrna com os primers fd1 (Forward) e rd1 (Reverse), os produtos do PCR foram determinados pela empresa ACTGene Análises Moleculares localizada no Campus do Vale da UFRGS (Universidade Federal do Rio Grande do Sul). Os dados recebidos foram tratados com a ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), para obter os resultados do sequenciamento e a identificação correta dos microrganismos. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Análise de Escherichia coli Presente no Ambiente Produtivo De acordo com o método de diagrama decisório foram estabelecidos 25 pontos de coletas de amostras no processo produtivo, identificados como possíveis meios de contaminação do produto. As análises microbiológicas realizadas nos 25 pontos, foram identificados em 10 pontos a presença de Escherichia coli. Akkaya (2008), denotou a presença de microrganismos patogênicos no período e março a agosto de 2005, em um frigorifico localizado na Turquia. O mesmo mostrou 250 amostras de carcaças bovinas e observou prevalência de Salmonella sp. em 10%, Listeria monocytogenes em 6,8% e presença de Escherichia coli em 3,2% das amostras. Os alimentos envolvidos em surtos e em caso de infecção por Escherichia coli são na maioria de origem animal, particularmente bovina. A contaminação da carcaça bovina pode ocorrer durante o abate. O trato gastrointestinal dos bovinos funciona como um reservatório deste microrganismo. A Escherichia coli predomina na microbiota anaeróbica facultativa do trato gastrointestinal dos humanos e dos animais de sangue quente, como os bovinos (Moreng; Avens, 1990). A Escherichia coli foi identificada em 10 pontos do processamento frigorifico, as presenças deste microrganismo podem estimar falhas na higiene e indicar contaminação de origem fecal, sendo

4 que a presença deste microrganismo pode estar relacionada a níveis significativos de enteropatógenos (Ducas e Silva, 2011). Em estudo publicado por Elder et al. (2000), indicou que o processo de evisceração é um ponto crítico de controle para a contaminação das carnes, com isso, medidas de controle devem ser adotadas. A contaminação por E. coli pode se dar através da utilização de utensílios mal higienizados ou não sanitizados, não higienização das mãos entre a manipulação setores alimentícios diferentes e má higienização do manipulador após o uso do sanitário (Silva, 2001). 3.2 Verificação da Identidade de Escherichia coli Isolada do Processo Produtivo O método de extração de DNA emprega CTAB, sendo um componente que desfavorece a ação de enzimas degradantes e de DNAses endógenas, sendo um detergente que solubiliza as membranas, que facilita a precipitação do complexo formado com o DNA. As extrações com métodos que utilizam CTAB, fornecem DNA suficientemente puro para a amplificação por PCR (Gonçalves, 2006). A extração dos DNA s é demonstrada na Figura 1 abaixo, sendo o primeiro poço com marcador de peso molecular, seguida das amostras microbiologicamente positivas. Figura 1 - Amostras de DNA extraídas por método CTAB visualizadas por eletroforese em gel de agarose Fonte: Autoria Própria (2016) A amplificação de DNA necessitou de ajustes, de acordo com a literatura, as condições de ciclo eram 1 minuto a 96 C, 30 ciclos de 20 segundos a temperatura de 64 C, para o anelamento dos primers de 30 segundos a 55 C e mais 2 minutos a 72 C, mais 5 minutos a 72 C para a extensão final. Entretanto, para estas condições não foram obtidos produtos de leitura para sequenciamento, assim houve a necessidade de estabelecer nova temperatura de anelamento, a qual foi realizada por um PCR em gradiente, que consiste em um teste de temperatura, onde o experimento realiza iguais condições de reação, variando apenas a temperatura. Na Figura 2, FOTO A, há o produto de amplificação no teste de PCR em gradiente, variando a temperatura de anelamento entre 53 C a 60 C, sendo a última banda, a de melhor nitidez, consiste na temperatura de 60 C, considerada a temperatura ideal de anelamento para estas amostras. Na Figura 2, FOTO B, há o produto de amplificação após a determinação das condições ideais, para a mesma amostra, com cepa padrão de Salmonella sp..

5 Figura 2 - Produtos de PCR em gradiente de temperatura visualizadas em gel de agarose 1,8%. Fonte: Autoria Própria (2016) O sequenciamento será realizado pela empresa Ludwig Biotecnologia ( O preparo da amostra para envio, segue o padrão descrito pela empresa. Entretanto para controle das reações enviadas, realizou-se uma PCR com os primers rd1 e fd1 universais. Este produto consta do tamanho 1000 pares de base, cujas bandas se encontram no gel da Figura 3. Figura 3 - Produtos da PCR visualizados em gel de agarose 1,8%, enviados para sequenciamento Fonte: Autoria Própria (2016) 4. CONCLUSÕES No presente estudo, foi diagnosticado 25 pontos críticos no controle de qualidade do processamento industrial de um frigorifico, a partir de um diagrama decisório. Para Escherichia coli, nos 25 pontos amostrados, 10 pontos obtiveram resultado microbiológico positivo. Evidenciando falhas na higiene dos equipamentos e utensílios, bem como contaminação cruzada oriunda pelo manipulador. A determinação do perfil genético dos microrganismos isolados, foi realizado em 3 etapas, sendo a primeira a extração do DNA dos microrganismos isolados. A segunda etapa realizou a amplificação dos mesmos, para o posterior envio para sequenciamento. O sequenciamento evidenciou a contaminação cruzada dentro dos processos no frigorífico. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AKKAYA, L.; CETINKAYA, Z.; ALISARLI, M.; TELLI, R.; GOK, V. (2008) The prevalence of E. coli O157/O157:H7, L. monocytogenes and Salmonella spp. on bovine carcasses in Turkey. Journal of Musclle Foods, 19,

6 BOLAND, T.; LATOUR, R. A. & STUTZENBERGER, F. J. (2000). Molecular Basis of Bacterial Adhesion. Humana Press Inc., 2, BRANDA, S. S.; VIK, A.; FRIEDMAN, L.; KOLTER, R. (2005). Biofilms: the matrix revisited. Trends in Microbiology, 13(1), CHEN, J.; ROSSMAN, M. L.; PAWAR, D. M. (2007). Attachament of enretohemorragic Escherichia coli to the surface of beef and a culture medium. LWT. Food Science and Technology, 40, DEVEREUX, R., M. E. HINES, e D. A. S. STAHL. (1996). Cycling characterization of natural communities of sulfate-reducing bacteria by 16S rrna sequence comparisons. Microbial Ecology, 32, DUCAS, C. T. S.; SILVA, L. F. (2011). Pesquisa de Salmonella spp. e enumeração de coliformes totais e termotolerantes em carcaça de suínos abatidos em matadouro-frigorífico de Uberlândia, Minas Gerais. Vet. Not., Uberlândia, 7(1), ELDER, R.O.; KEEN, J.E.; SIRAGUSA, G.R.; BARKOCY-GALLAGHER, G.A.; KOOHMARAIE, M.; LAEGREID, W.W. (2000). Correlation of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 prevalence in feces, hides, and carcass of beef cattle during processing. Applied Biological Sciences, 97(7), GONÇALVES, D. (2006). Caracterização molecular de isolados de Staphylococcus aureus e produção de marcadores genéticos para diagnóstico de mastite em bovinos leiteiros. (Tese de Doutorado). Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Paraná. LANE, D. L. B.; PACE, G. J.; OLSEN, D. A.; STAHL, M. L.; SOGIN, N. R. (1985). Rapid determination of 16S ribossomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of National Academy of Science, 82, MONTEIRO, F. C. (2015). Avaliação de Listeria monocytogenes como controle de qualidade no processamento de carnes. (Dissertação de Mestrado). Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Ponta Grossa, Paraná. MORENG, R. E.; AVENS, J. S. (1990). Ciência e produção de aves. São Paulo: Roca. MULLIS, K.B.; F.A. FALOONA. (1987). Recombinant DNA - Part F. In: A polymerase catalyzed chain reaction. Academic Press, NEIVA, I.F. (2007). Caracterização molecular de biosorotipos selvagens de streptococcus mutans isolados de crianças com diferentes históricos da doença cárie. (Tese de Doutorado). Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Paraná. NITSCHKE, M. (2006). Biotensoativos como agentes inibidores da ação de patógenos em superfícies de materiais utilizados na indústria de alimentos. Projeto de Pesquisa. EMBRAPA. CTAA. Rio de Janeiro. OLIVINDO, C.S.; CHAPAVAL L.; VILLARROEL, A.B.S.; ALVES, F.S.F.; SOUSA, F.G.C.; FERNANDES, F.E.P.F.; ALVES, F.S.F; SOUSA, F.G.C.; FERNANDES, F.E.P. (2009). Detecção de Staphylococcus aureus utilizando a técnica de REP-PCR no monitoramento da qualidade do leite de cabra. Revista Brasileira de Zootecnia, 38(7), SAIKI, R.K.; GELFAND, D.H.; STOFFEL, S.; SCHARF, S.J.; HIGUCHI, R.; HORN, G.T.; MULLIS, K.B.; ERLICH, H.A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a termostable DNA polymerse. Science, 239, SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A., SILVEIRA, N. F.A. (2001). Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos (2. ed.) São Paulo. TOBIAS, W.; PONSANO, E. H; G.; PINTO, M. F. (2014). Elaboração e implantação do sistema de análise de perigos e pontos críticos de controle no processamento de leite pasteurizado tipo A. Ciência. Rural, 44(9). TOLEDO, J. C. (2001). Gestão da qualidade na agroindústria. Gestão agroindustrial. (2. ed.) São Paulo: Atlas. TORTORA, G. J.; FUNKE B. R.; CASE C. L. (2005). Microbiologia. Artmed.