TENDÊNCIA PARA O CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO NO SETOR INDUSTRIAL, COM ÊNFASE EM ALIMENTOS

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1 TENDÊNCIA PARA O CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO NO SETOR INDUSTRIAL, COM ÊNFASE EM ALIMENTOS L. Almeida¹, C. Walus², J. V. M. Bittencourt³ 1- Mestranda PPGEP Universidade Tecnológica Federal do Paraná, CEP , Ponta Grossa-PR- Brasil, Telefone (42) (lu_almeidaf@yahoo.com.br). 2- Mestranda PPGEP Universidade Tecnológica Federal do Paraná, CEP , Ponta Grossa-PR- Brasil, Telefone (42) (claudiawalus@alunos.utfpr.edu.br). 3- Departamento Engenharia de Produção Universidade Tecnológica Federal do Paraná, CEP , Ponta Grossa-PR- Brasil, Telefone (42) (julianavitoria@utfpr.edu.br). RESUMO O controle de qualidade biológico nas indústrias alimentícias é o mais relevante, visando em primeiro lugar à saúde do consumidor. O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão bibliográfica de trabalhos relacionados à técnica da PCR em tempo real com aplicação no controle de qualidade biológico da indústria de carnes. A técnica da PCR em tempo real é uma inovação tecnológica com aplicação em diversas áreas. Na indústria de carnes pode ser utilizada no controle de qualidade por ser uma técnica de resultados rápidos podendo identificar e quantificar microorganismos deteriorantes e patogênicos. Foi possível perceber que o método da PCR em tempo real pode ser utilizado como uma ferramenta no controle da qualidade de indústrias alimentícias, tanto fazendo parte das análises de rotina, quanto pelos órgãos de fiscalização devido à rapidez e eficácia do método em mostrar resultados quantitativos que poderão ser comparados com a legislação em vigor. ABSTRACT The biological quality control in the food industry is the most relevant, aiming primarily to the consumers health. The objective of this study was to perform a literature review of studies related to the real-time PCR technique application in the biological quality of the meat industry. The PCR real-time technique is a technological innovation with application in several areas. In the meat industry it can be used in quality control to be for being a technique of fast results that can identify and quantify spoilage and pathogenic micro-organisms. It was possible to comprehend that the real-time PCR method can be used as a tool in quality control of food industries, both as part of routine analysis, and by the inspection agencies due to the speed and efficiency of the method in showing quantitative results that can be compared with the legislation in force. PALAVRAS-CHAVE: controle de qualidade; indústrias de carnes; PCR em tempo real. KEYWORDS: quality control; meat industry; real-time PCR. 1. INTRODUÇÃO O controle de qualidade de produtos industriais é de extrema importância. Quando se trata de setor alimentício, o controle de qualidade é ainda mais relevante sendo necessário lançar mão de técnicas confiáveis e ágeis. Um dos controles de qualidade mais importantes em alimentos é o controle microbiológico, pois micro-organismos contaminam e deterioram alimentos podendo causar DTAs (doenças transmitidas por alimentos) ao consumidor, diminuindo a vida útil de alimentos armazenados

2 e disponíveis para consumo, causando desperdícios e prejuízos para a indústria (FRANCO e LANDGRAF, 2002). A qualidade dos alimentos está relacionada à competitividade da indústria no mercado elevando ou comprometendo a sua marca no patamar mercadológico. Além disso, a saúde do consumidor está diretamente relacionada à qualidade do produto. No setor de abate animal, deficiências nas condições sanitárias podem facilitar a contaminação sendo necessárias medidas de controle para identificação de contaminantes no ambiente de processamento (MONTEIRO e BITTENCOURT, 2015). O ambiente industrial de frigoríficos é bastante propício ao desenvolvimento de microorganismos, mesmo sendo removidas as partículas de alimentos, os micro-organismos se aderem facilmente às superfícies, paredes e utensílios, sendo muitos deles patogênicos e muitos formadores de biofilmes o que dificulta a higienização do ambiente, podendo contaminar e deteriorar os alimentos causando danos ao consumidor e a empresa (TRAVAGIN e PORTO, 2010; FERRONATTO e CARDOSO, 2010). Atualmente, nos laboratórios de microbiologia, são utilizados métodos tradicionais de cultura que podem levar até uma semana para identificação de patógenos causadores de surtos alimentares (POTY e SANTANA, 2011). A indústria alimentícia necessita de métodos com resultados mais rápidos, reduzindo custos de estocagem e evitando surtos alimentares. O método da PCR realiza a detecção de bactérias evitando resultados falso-negativos devido à sensibilidade, especificidade e seletividade, além de ser um método com obtenção de resultados mais rápidos que a microbiologia convencional (ANDRADE, et al, 2010). Uma nova abordagem em relação a PCR se tornou uma grande perspectiva, tendo a possibilidade de amplificação dos ensaios durante a reação tornando-se a base para PCR em tempo real. Essa técnica usa marcadores fluorescentes para monitorar os produtos da amplificação durante os ciclos da reação, quantificando a contaminação com um dado patógeno. Este método economiza tempo, é sensível, específico e quantitativo, o risco de contaminação cruzada é reduzido, alto rendimento e não necessita manipulação pós-pcr (POTY e SANTANA, 2011). A PCR em tempo real é uma alternativa de diagnóstico rápido, especificando e quantificando o agente biológico e seus resultados, podendo rapidamente informar à administração da saúde pública sobre a ocorrência de surtos alimentares (POTY e SANTANA, 2011), entretanto, não existem muitos trabalhos relacionados à aplicação de tal tecnologia no setor industrial a qual facilitaria a identificação de patógenos de forma rápida e eficaz. O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão bibliográfica de trabalhos relacionados à técnica da PCR em tempo real com aplicação no controle de qualidade da indústria de carnes. 2. REFENCIAL TEÓRICO 2.1 Controle de Qualidade A gestão da qualidade é um conjunto de práticas aplicadas de forma eficiente e eficaz para garantir a qualidade do produto. Para algumas áreas de atuação, a qualidade é questão de sobrevivência enquanto para outras indústrias é uma vantagem competitiva (TOLEDO, et al, 2000). O controle de qualidade é uma preocupação cada vez maior no setor industrial, várias

3 ferramentas têm sido criadas para auxiliar na gestão da qualidade e utilizadas na expectativa de atender a quesitos de idoneidade em respeito ao consumidor, para oferecer um produto seguro e, ao mesmo tempo, contemplar as exigências de comercialização e exportação dos produtos. Outros benefícios além destes, é também a diminuição de custos, gerada pela redução de perdas evitando descarte, recolhimento e, às vezes, reprocessamento de produtos; otimização da produção; redução de perdas de matérias-primas e produtos; maior credibilidade junto ao cliente; maior competitividade na comercialização; além de atender a obrigatoriedade na exportação e a requisitos legais internos (FURTINI e ABREU, 2005). 2.2 Qualidade em Alimentos Na indústria alimentícia o controle de qualidade é um dos mais importantes, pois não se trata apenas de oferecer um produto de qualidade, mas de contribuir para a saúde e bem estar do consumidor evitando perigos químicos, físicos e biológicos (FURTINI e ABREU, 2005). Perigos químicos são os mais temidos pelos consumidores, e os físicos os mais comumente identificados, porém os perigos biológicos são os mais importantes para a saúde pública e representam a grande maioria das ocorrências, principalmente, por micro-organismos, compreendendo bactérias patogênicas e suas toxinas, vírus, parasitas e príons (FURTINI e ABREU, 2005). Infecções e intoxicações alimentares são problemas sérios de saúde pública pelo grande número e gravidade de casos, e pela grande quantidade de micro-organismos patogênicos que podem estar envolvidos em um surto estando estes, veiculados a alimentos e água (MONTEIRO e BITTENCOURT, 2015). Todos os requisitos de qualidade ao longo da cadeia produtiva devem ser avaliados para garantir a qualidade do produto. Atividades relacionadas à produção, transformação, distribuição e o consumo de alimentos estão diretamente ligadas à percepção do consumidor e deve ser avaliada regularmente (TOLEDO, et al, 2000). Todo o processo de fabricação de alimentos pode ser alvo de contaminação por microorganismos refletindo condições inadequadas de higiene. A contaminação pode ocorrer por microorganismos não patogênicos causando deterioração, decomposição, mau cheiro e sabor desagradável, assim como por patogênicos que causam doenças, intoxicações, mal estar e até a morte (ALMEIDA e PIETROWSKI, 2015). 2.3 Contaminação Microbiológica em Carnes A carne é um substrato de excelência para o desenvolvimento microbiano, pela elevada atividade de água (aw), de 0,99, carboidratos, lactatos, aminoácidos e proteínas. A temperatura é o fator externo que mais afeta o crescimento dos micro-organismos, pois quanto mais elevada, maior será a velocidade de crescimento. As carcaças bovinas, após abate, evisceração e lavagem, são mantidas em câmaras frias, onde permanecem por volta de 24 horas, período em que ocorrem transformações enzimáticas e bioquímicas, caracterizando a chamada conversão de músculo em carne. As temperaturas decrescem até próximo de 0 C, não devendo ultrapassar 7 C no interior do músculo quando de sua saída desse local (FILHO et al, 2006). Os microrganismos responsáveis pela contaminação da carne são oriundos da pele, fezes e conteúdos intestinais, também das mãos e instrumentos dos funcionários. Várias espécies são específicas, isoladas apenas de carnes, abatedouros ou de instalações e equipamentos necessários para

4 o processamento e podem veicular micro-organismos patogênicos como Salmonella, Escherichia coli, Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus (FILHO et al, 2006). De acordo com a legislação vigente no país, a RDC (Resolução da Diretoria Colegiada) nº 12 de 2 de janeiro de 2001, quanto a investigação microbiológica de carnes resfriadas ou congeladas, em alguns casos estabelece somente a verificação da presença de Salmonella sp, para outros casos a identificação e quantificação de Coliformes a 45ºC e Estafilococos coagulase positiva. Apesar disso, a presença de Listeria monocytogenes também deve ser investigada devido a apresentar grande risco à saúde do consumidor podendo causar abortos e até o óbito. 2.4 Diagnóstico Molecular A partir do século XX ocorreu um dos maiores passos no estudo da biologia molecular, houve a descoberta da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction), enormes benefícios como o sequenciamento de genomas, a rápida determinação da paternidade e o rápido diagnóstico de doenças infecciosas foram possíveis a partir deste novo método (ADRIÃO e FALEIRO, 2007). A técnica da PCR foi desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis e pode ser executada in vitro. A PCR possibilita a síntese de fragmentos de ADN (acido desoxirribonucleico), utilizando a enzima ADN-polimerase que participa na replicação do material genético nas células sintetizando uma sequência complementar de ADN desde que um pequeno fragmento (o iniciador, ou primer, em inglês) já se encontre ligado a uma das cadeias do ADN no ponto escolhido para o início da síntese. O resultado é a amplificação de uma determinada sequência de bilhões de cópias (ADRIÃO e FALEIRO, 2007). A PCR em tempo real é uma inovação tecnológica que vem ganhando espaço nos laboratórios devido à obtenção de resultados não apenas qualitativos, mas quantitativos de forma rápida e precisa (ADRIÃO e FALEIRO, 2007). A técnica se torna eficiente em caráter preventivo, pois a partir da rapidez das análises pode-se retirar de circulação ou evitar que entrem no mercado alimentos impróprios para consumo garantindo a segurança da população e a idoneidade da indústria (POTY e SANTANA, 2011). Existem diversas vantagens em relação aos métodos convencionais como a rapidez nas análises e na obtenção dos resultados, poder de tipificação e discriminação, bom limite de detecção, seletividade, especificidade, potencial para automação e possibilidade para trabalhar com bactérias não cultiváveis em meios de cultura (GANDRA et al, 2008). Algumas desvantagens também são listadas como a impossibilidade de diferenciar células vivas e mortas, presença de inibidores enzimáticos em alguns alimentos, alto investimento em equipamentos e reagentes e falta de aprovação por órgãos oficiais (GANDRA, et al, 2008). Podem-se ressaltar ainda outros fatores como a concentração de íons de magnésio, a temperatura de cada ciclo, duração de cada uma das etapas de um ciclo, números de ciclos, concentração dos dntps (desoxirribonucleotídeos fosfatados) a concentração da polimerase, contaminantes presentes na amostra que podem inibir a reação e enzimas termoestáveis produzidas por microrganismos podem degradar os produtos da amplificação (GANDRA, et al, 2008). A técnica da PCR convencional não obtém resultados quantitativos, pois a quantificação é feita após o término da reação, depois da fase exponencial. A PCR em tempo real determina exatamente o ciclo em que a amplificação é detectada, chamado de ciclo limiar. São utilizados

5 corantes fluorescentes que, na medida em que a reação avança, a amplificação produz quantidades de DNA ligando-se ao corante aumentando a fluorescência como representado na figura 1. O princípio da técnica é monitorar cada amostra, ciclo a ciclo, até observar acumulo de produto sendo detectado pelo aparelho (POTY e SANTANA, 2011). Figura 1: Representação da fluorescência. (WINKELSTRÖTER E MARTINIS, 2008). Trabalhos desenvolvidos utilizando a PCR em tempo real mostram a eficiência e clareza de resultados na detecção e quantificação de DNA como por exemplo: Sola e Mesquita (2011), que detectaram DNA de Brucella spp em carcaças e vísceras de matadouros-frigoríficos de Goiás. Fröder e Destro (2008), utilizaram a PCR em tempo real para quantificação de Salmonella sp. em amostras de fezes de suíno e de líquidos de carnes descongeladas e Winkelströter e Martinis (2008), que utilizaram a técnica para detectar DNA de L. monocytogenes em biofilmes formados pela bactéria em lâminas de aço inoxidável. Todos os trabalhos mostraram a viabilidade do método para utilização no controle de qualidade. 3. CONLUSÕES A partir desta revisão bibliográfica é possível perceber que o método da PCR em tempo real pode ser utilizado como uma ferramenta no controle da qualidade de indústrias alimentícias. Em especial, neste caso, os frigoríficos, tanto fazendo parte das análises de rotina para qualidade dos produtos, quanto pelos órgãos de fiscalização devido à rapidez e eficácia do método em mostrar resultados quantitativos que poderão ser comparados com a legislação em vigor. 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adrião, A. L. G.; Faleiro, M. L.; Determinação dos Genótipos de Listeria Monocytogenes por PCR em Tempo Real e Avaliação da sua Citopatogenicidade. Universidade do Algarve, Faculdade de Ciências e Tecnologia. Faro, Almeida, L., Pietrowski, G. A. M.; Qualidade microbiológica de refeições servidas em casas de repouso da cidade de Ponta Grossa-PR. Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR), Ponta Grossa, 2015.

6 Andrade, R.B.; Gemelli, Dall Onder, T., L.P.; Cristina, K.; Brito, T.; Barboza, A. A. L.; Brito, B.G.; Métodos Diagnósticos para os Patógenos Alimentares: Campylobacter Sp., Salmonella Sp. e Listeria Monocytogenes. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.77, n.4, p , out./dez., Brasil. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução de Diretoria Colegiada - RDC nº12, de 02 de janeiro de Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos. Disponível em: < pdf?mod=ajperes > Ferronatto, A. I.; Cardoso, M. R. I.; Contaminação de Carcaças e Ambiente por Listeria sp. em Diferentes Etapas do Abate de Suínos. Universidade Federal do Rio Grande do sul, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente. Porto Alegre, Filho, A. T. F.; Mesquita, A. J.; Oliveira, J. P.; Bueno, C. P.; Lopes, J. H.; Couto, M. V.; Borges, N. M. F.; Qualidade Bacteriológica de Meias-Carcaças Bovinas Oriundas de Matadouros- Frigoríficos do Estado de Goiás Habilitados para Exportação. Ciência Animal Brasileira, v. 7, n. 3, p , jul./set Franco, B. D. G. M.; Landgraf, M.; Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Editora Atheneu, Froder, H; Destro, M. T.; Desenvolvimento de Métodos para a Quantificação Direta de Salmonella sp. por PCR-tempo real e por Transcriptase reversa-pcr-tempo real. Universidade de São Paulo Faculdade de Ciência dos Alimentos Área de Bromatologia. São Paulo, Furtini, L. L. R.; Abreu, L. R.; Utilização de APPCC na Indústria de Alimentos. Ciênc. agrotec., Lavras, v. 30, n. 2, p , mar./abr., Gandra, E. Á.; Gandra, T. K. V.; Mello, W. S.; Godoi, H. S.; Técnicas moleculares aplicadas à microbiologia de alimentos. Acta Sci. Technol., Maringá, v. 30, n. 1, p , Monteiro, F. C.; Bittencourt, J. V. M.; Avaliação de Listeria monocytogenes como Controle de Qualidade no Processamento de Carnes. Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Produção. Ponta Grossa, Poty, I. O.; Santana, A. P.; Revisão da Estrutura e Função do DNA para Compreensão das Técnicas de PCR e Real Time PCR e sua Aplicabilidade na Pesquisa de Microrganismos em Alimentos de Origem Animal. Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária. Brasilia/DF, Sola, M. C.; Mesquita. A. J.; Emprego da Técnica de PCR em Tempo Real na Detecção de DNA de Brucella spp em Lesões de Carcaças e Vísceras Provenientes de Matadouros-Frigoríficos Sob Inspeção Federal. Universidade Federal de Goiás, Escola de Veterinária e Zootecnia, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Goiânia, Toledo, J. C.; Batalha, M. O.; Amaral, D. C.; Qualidade na Indústria Agroalimentar: Situação Atual e Perspectivas. RAE- Revista de Administração de Empresas. v. 40, n. 2, Abr./Jun. São Paulo, Travagin, B. N. F. S.; Porto, E.; Estudo da formação de biofilmes de Listeria monocytogenes frente a diferentes condições encontradas em laticínios. Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. Piracicaba, Winkelströter, L. K.; Martinis, E. C. P.; Quantificação e Análise de Viabilidade de Listeria Monocytogenes em Biofilmes por Semeadura em Placa, Microscopia de Fluorescência e Ensaios Preliminares de PCR em Tempo Real. Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto. Ribeirão Preto, 2008.