DETECÇÃO DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Escherichia coli EM AMOSTRAS DE ÁGUAS PARA IRRIGAÇÃO

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1 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 6 DETECÇÃO DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Escherichia coli EM AMOSTRAS DE ÁGUAS PARA IRRIGAÇÃO DETECTION OF ESCHERICHIA COLI VIRULENCE GENES IN SAMPLES OF WATER FOR IRRIGATION Abstract Amanda Schimidt Célico (1) Aylan Kener Meneghine (1) Luciana Maria Saran (2) Lúcia Maria Carareto Alves (2) The objective of this study was seen in water for irrigation and human consumption, the presence or absence of Escherichia coli from microbiological kit, detecting virulence genes (stx1, stx2 and eae) in six points of water samples from a stream belonging to the farm of the State of São Paulo Zoological Park. Escherichia coli was determined by microbiological test for the determination of fecal coliforms by membrane filter technique. The presence of virulence genes (stx1, stx2 and eae gene) was performed by PCR using metagenomic DNA samples. It was observed the presence of Escherichia coli in the first two sampling points. It is suggested that this fact can be explained by the organic compound that is used in the garden process or the presence of animals close to the above points. However, it is possible to infer, by PCR, that it is not pathogenic enterobacteria, meaning that the water method is being used for irrigation and supply for human consumption is in great condition for such use. Keywords: Escherichia coli. stx1 gene, stx2 gene, eae gene. 1 Introdução A contaminação de alimentos por patógenos é uma das causas de diarreia em países em desenvolvimento, o que resulta em altas taxas de morbidade e mortalidade (LOPEZ- SAUCEDO, 2003). A água destinada para irrigação deve estar isenta de organismos patogênicos, sendo assim Medeiros et al. (2009) destacam que para o monitoramento e controle da qualidade do corpo d água tem-se utilizado indicadores de micro-organismos. Segundo Marouelli et al. (2001) uma das características que deve ser avaliada para a determinação da qualidade da água é a condição sanitária. Os mesmos autores relatam que é de fundamental importância analisar e controlar as águas destinadas ao uso em irrigação, pois se houver incidência de organismos patogênicos no meio, estes irão contaminar os alimentos irrigados, podendo servir de veículo para transmissão de doenças aos consumidores. Um dos indicadores da presença de micro-organismos patogênicos na água é os coliformes, que incluem a bactéria Escherichia coli (SILVA et al, 2011). 1 Pós Graduação em Microbiologia Agropecuária pela Universidade Estadual Paulista UNESP /FCAV Jaboticabal. 2 Professor Assistente Doutor da Universidade Estadual Paulista UNESP/FCAV Jaboticabal. contato: lmcalves@fcav.unesp.br

2 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 7 O gênero Escherichia contém grande parte dos bacilos móveis Gram negativos da família Enterobacteriaceae que compreende a espécie E. coli (NATARO e KAPER, 1998). De acordo com Kaper et al. (2004) a E. coli é um importante patógeno tanto na medicina humana quanto na animal. Existem muitos tipos de patógenos desta bactéria, caracterizados pela presença dos mais variados fatores de virulência (BORGES et al., 2012). Os genes responsáveis por tais fatores podem estar localizados nos cromossomos, plasmídeos ou fagos (TENG et al., 2004). A E. coli produtora de shiga toxina (SPEC) e enteropatogênica (EPEC) são duas das seis categorias que causam diarreia (KAPER et al., 2004). As STEC estão associadas a gastroenterite em humanos, como colite hemorrágica e síndrome hemolíticourêmica (OJO et al., 2010). A transmissão pode ocorrer pelo consumo de carnes mal cozidas ou cruas, produtos não pasteurizados, vegetais e até por águas contaminadas (CARVALHO et al., 2012). É definida pela produção de um ou mais tipos de shiga toxinas (Stx1, Stx2 ou variantes de Stx2), codificadas por bacteriófagos lisogênicos, elementos genéticos móveis (Waldor, 1998). A outra categoria de toxina produzida por E. coli enteropatogênica (EPEC) é a intimina, proteína codificada pelo gene eae, e que está relacionada a diarreia em todas as espécies animais, incluindo o ser humano (STELLA et al., 2009). A Fazenda da Fundação Parque Zoológico do Estado de São Paulo (FPZSP) é responsável pela produção dos alimentos destinados aos animais do parque e do Zoo Safari. A produção consiste em legumes e hortaliças produzidos na horta, na qual é aplicado o composto orgânico produzido no próprio Zoológico. A FPZSP possui uma Unidade de Produção de Composto Orgânico que utiliza os resíduos gerados no próprio local, tais como, resíduos animais, vegetais e carcaças de animais. Por outro lado, para suprir a necessidade hídrica dos vegetais cultivados na horta, há um sistema que capta água do córrego Ribeirão do Lajeado, localizado a jusante da horta, e goteja sobre a mesma, como forma de irrigação. A água é um dos mais importantes veículos de transmissão de natureza infecciosa, o que torna essencial a avaliação microbiológica da mesma (ISAAC MARQUEZ et al., 1994), quando usada para consumo ou processos. Um dos principais usos da água é a irrigação, que requer água isenta de organismos patogênicos, para vegetais que serão consumidos cru e livre de substâncias tóxicas aos vegetais e animais. Martins et al. (2013) ao estudarem a diversidade microbiana do composto orgânico gerado e aplicado na própria fazenda, encontraram Enterobacteriaceae. Kaper et al. (2004) ressaltam que a E. coli é encontrada no trato intestinal de animais, podendo causar doenças tanto nestes quanto em humanos. Os

3 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 8 mesmos autores destacam que o principal processo de infecção por essa bactéria é a contaminação dos alimentos. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de Escherichia coli patogênica na água de um córrego que banha a horta onde se aplica composto orgânico, e na água do poço, destinada ao consumo humano, do mesmo local. Essa avaliação se deu por meio de testes microbiológicos e da detecção de genes de virulência (stx1, stx2 e eae) amostras de água coletadas em seis pontos do córrego pertencente à FPZSP. 2 Material e Métodos O experimento foi realizado na Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho UNESP Jaboticabal. As amostras de água foram coletadas em um córrego do qual se capta água para irrigar a horta da Fazenda Parque Zoológico do Estado de São Paulo (FPZSP), no município de Araçoiaba da Serra. O córrego estudado é o Ribeirão do Lajeado, pertencente à Bacia Hidrográfica do Rio Sorocaba e Médio Tietê. A coleta foi realizada em dois períodos do ano de 2013, o primeiro chuvoso e o segundo de estiagem. Foram selecionados 6 pontos de amostragem: 2 a montante do ponto de captação da água (sendo o primeiro próximo à nascente e o segundo próximo a horta), 1 ponto no local de captação da água, 2 pontos à jusante (localizados na propriedade vizinha da FPZSP). Adicionalmente, coletou-se água de um poço artesiano situado nas proximidades da horta. Ressalta-se que a água deste poço é destinada ao consumo humano. A determinação da presença de coliformes totais e E coli foi realizada utilizando-se Kit Microbiológico para determinação de Coliformes Totais e E. coli pela técnica da membrana filtrante (cód 1808, Alfakit). Para a análise foram filtrados 100 ml da água coletada em cada ponto, em triplicata, em membrana de 0,45µm. Posteriormente, esta foi colocada sobre meio específico e incubada em estufa tipo B.O.D. a 37 o C por um período de 24 h, após o qual as placas foram expostas a luz UV para se determinar, a partir do aparecimento de fluorescência, a presença ou ausência de E. coli. Para a detecção de STEC (genes stx1 e stx2) e EPEC (gene eae) utilizou-se a metodologia molecular de PCR com o DNA metagenômico. A extração de DNA metagenômico das amostras foi realizada utilizando-se o kit PowerWater DNA Isolation Kit (MOBIO, Laboratories, Inc.). A PCR foi realizada de acordo com BORGES et al. (2012) a partir do DNA metagenômico extraído, sendo os amplicons avaliados por eletroforese em gel de agarose.

4 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 9 3 Resultados e Discussão Para os ensaios microbiológicos à detecção de coliformes totais e E. coli, observou-se nos dois primeiros pontos amostrados no período de seca uma colônia fluorescente para o ponto 1, que apresentou cerca de 140 coliformes totais e duas colônias para o ponto 2, em que foram observados aproximadamente 160 coliformes totais. Martins et al. (2013) ao estudarem a diversidade microbiana do composto orgânico produzido e aplicado na horta da FPZSP constataram a presença, embora em pequenas quantidades, da família Enterobacteriaceae, sugerindo que pode estar ocorrendo processo de lixiviação deste composto para o corpo d água, já que os pontos em que foi constatada a presença de E. coli são os mais próximos à horta. Outro fato que pode explicar a presença da bactéria em questão nos dois pontos amostrados pode ser a presença de animais silvestres próximo ao local, uma vez que a E. coli é encontrada no trato intestinal dos mesmos (KAPER et al., 2004). Quanto à análise da presença de genes de virulência das bactérias E coli nas amostras de água, constatou-se que nenhuma das delas, tanto em período chuvoso quanto em estiagem para o ano de 2013, apresentaram os genes investigados neste estudo. 4 Conclusões Constatou-se a presença de E. coli nos dois primeiros pontos amostrados no período de estiagem. Sugere-se que este fato pode ser explicado pelo processo de lixiviação do composto orgânico que é aplicado na horta, uma vez que foi constatada a presença de Enterobacteriaceae ou ainda pela presença de animais próximo aos pontos supracitados. No entanto, é possível inferir, pelo método da PCR, que não se trata de enterobactéria patogênica, significando que a água que está sendo utilizada para irrigação e para consumo humano está em ótimas condições para tais usos quanto ao aspecto microbiológico relacionado ao número de coliformes totais e presença de E coli patogênica. 5 Apoio financeiro A CAPES pela bolsa, ao CNPq e FAPESP pelos auxílios financeiros concedidos. À Fazenda Parque Zoológico do Estado de São Paulo pelo apoio. 6 Referências BORGES, C. A.; BERALDO, L. G.; MALUTA, R. P.; CARDOZO, M. V.; GUTH, B. E. C.; RIGOBELO, E. C.; ÁVILA, F. A. Shiga Toxigenic and Atypical Enteropathogenic Escherichia coli in the Feces and Carcasses of Slaughtered Pigs. Foodborne pathogens and disease, v.9, n.12, 2012.

5 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 10 CARVALHO, A. F.; MIYASHIRO, S.; NASSAR, A. F. C.; NODA, A. GABRIEL, D. T.; BALDASSI, L. Caracterização molecular e fenotípica de estirpes de Escherichia coli produtoras de shiga-toxina (STEC) não-o157 de fezes e carcaças bovinas. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. v.64, ISSAC-MARQUEZ, A. P.; LEZAMA-DAVILA, C. M.; KU-PENCH, R. P.; TAMAY- SEGOVIA, P. Calidad sanitaria de los suministros de agua para consumo humano en Campeche. Salud Pública Méx, v.36, KAPER J.B.; NATARO, J. P.; MOBLEY, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol, p , LOPES-SAUCEDO, C.; CERNA, J. F.; VILLEGAS-SEPULVEDA, N.; THOMPSON, R.; VELAZQUES, F. R.; TORRES, J.; TARR, P. L.; ESTRADA-GARCIA, T. Simple multiplex polymerase chain reaction to detect diverse loci associated with diarrheagenic Escherichia coli. Emerg Infect Dis. v.9, p , MAROUELLI, W.Q.; SILVA, W.L.C.; SILVA, H.R. Irrigação por aspersão em hortaliças/qualidade da água, aspectos do sistema e método prático de manejo. Brasília, DF: Embrapa Informações Tecnológicas, p.11, MARTINS, L. F.; ANTUNES, L. P.; PASCON, R. C.; DE OLIVEIRA, J. C. F.; et al. Metagenomic Analysis of a Tropical Composting Operation at the São Paulo Zoo Park Reveals Diversity of Biomass Degradation Functions and Organisms. PLoS ONE, v.8, MEDEIROS, A. O.; ROSA, C. A.; BRANDÃO, L. R.; GIANI, A.; GOMES, L. N. L.; LIBKING, D. Microbial Quality of Freshwater Ecosystems of South America. In:Water Quality: Physical, Chemical and Biological, NATARO, J. P.; KAPER, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Ver. Washington, v. 11, n.1, p , OJO, O. E.; AJUWAPE, A. T.; OTESILE, E. B.; OWADE, A. A.; OYEKUNLE, M. A.; ADETOSOYE, A. I. Potentially zoonotic shiga toxin-producing Escherichia coli serogroups in the faeces and meat of food-producing animals in Ibadan, Nigeria. Int. J. Food Microbiol., v.142, p , SILVA, I. N.; FONTES, L. O.; TAVELLA, L. B.; DE OLIVEIRA, J. B.; DE OLIVEIRA, A. C. Qualidade de água na irrigação. ACSA Agropecuária Científica no Semi-Árido, v. 07, n.3, p , STELLA, A. E. Fatores de virulência em isolados de Escherichia coli provenientes de amostras de água, leite e fezes de bovinos leiteiros da região de Ribeirão Preto-SP, Brasil f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias UNESP Jaboticabal, TENG, L.J., HSHUEH, P. R.; LIAW, S. J.; HO, S. W.; TSAI, J. C. Genetic detection of diarrheagenic Escherichia coli isolated from children with sporadic diarrhea. J Microbiol Immunol Infect 2004;37: WALDOR, M. K. Bacteriophage biology and bacterial virulence. Trends Microbiol. v.6, p , 1998.