Introdução. Ivana Dantas Disc.: Interação Droga-Receptor Prof. Pedro

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1 Ivana Dantas Disc.: Interação Droga-Receptor Prof. Pedro Introdução Inflamação das vias aéreas x hiperreatividade das vias aéreas durante a asma brônquica Pacientes asmáticos em condições basais níveis normais de endotelina-1 (ET-1) nos brônquios (Chalmers et al., 1997a) TNF e IL-8 produção de ET-1 por células epiteliais das vias aéreas em cultura (Yang et al., 1997) Níveis de ET-1 estão elevados no fluido brônquicotraqueal e no plasma durante os ataques asmáticos Sefadex produz uma inflamação eosinofílica das vias aéreas síntese do mrna de ET-1 níveis de ET-1 no fluido brônquico-alveolar ET-1 é produzida por células epiteliais brônquicas e macrófagos, e células epiteliais brônquicas de pacientes asmáticos mostram aumento da expressão de ET-1 1

2 Objetivo Examinar a hipótese de que receptores de endotelina-1 são superexpressos no músculo liso das vias aéreas na fase inicial da asma brônquica Materiais e Métodos Animais Quantificação de mrna Ratos adultos machos Sprague-Da wley Anestesia enflurano Sefadex 5mg/ml/Kg Controle: salina Confirmação macroscópica da inflamação induzida por sefadex Isolamento de RNA total e transcrição reversa: - As células musculares lisas da traquéia e brônquios foram isoladas e homogeneizadas com reagente de TRIzol para extração do mrna total - O processo de transcrição reversa (RNA cdna) foi realizado utilizando o kit Gene Amp RT (PE Applied Biosystems, USA) Estudos de miografia e RT-PCR Quantificação da expressão do mrna dos receptores de ET-1 tipo A e B (ET A e ET B ) O RT-PCR foi realizado para avaliar a expressão do mrna dos receptores ET A e ET B : - Curvas de dissociação foram feitas após RT-PCR e amplificação não-específica foi detectada no presente estudo - Os produtos do PCR de ET A (64bp), ET B (86bp) e EF-1 (96bp) foram visualizados em gel de agarose por eletroforese Estudos funcionais Segmentos circulares foram cortados da traquéia e brônquios Foi retirado o epitélio de cada segmento Dois grupos de segmentos foram divididos e um deles era conectado a um transdutor do deslocamento da força unido a um computador para a contínua mensuração da tensão isomérica e o outro grupo a um dispositivo do deslocamento Os segmentos foram imersos numa solução tampão de bicarbonato (37ºC, 5% CO2, ph 7,4) Inicialmente, os segmentos traqueais e brônquicos foram expostos por 60min a uma tensão de 2nN e 1nN, respectivamente 2

3 Análises dos dados A habilidade de contração de cada segmento foi examinada através da exposição a uma solução rica em potássio (60mM), a qual causa efeito máximo Quando a contração máxima era obtida em 1min, os segmentos eram lavados com solução tampão Apenas após 2 contrações fortes (>1mN), os segmentos eram utilizados para outros experimentos A contração induzida pela solução de potássio foi utilizada como contratilidade de referência e o máximo foi definido como 100% ET-1 e sarafotoxina 6c foram adicionadas para se alcançar curvas cumulativas de concentração-resposta Após a inflamação eosinofílica ter sido estabilizada (24h),os efeitos na contratilidade de ET-1 e sarafotoxina 6c foram estudados na traquéia e brônquios A resposta na contratilidade dos segmentos é expressa como percentagem da contração induzida por 60mM de K + Valores E máx referem-se à máxima contratilidade induzida por um agonista Valores pec 50 são o logaritmo negativo da concentração molar que causa 50% da contração máxima Teste não-pareado foi utilizado para os estudos moleculares e twoway ANOVA com Bonferroni post-test foi utilizado para os estudos funcionais para comparar grupo controle e grupo sefadex Significância estatística p<0.05 RT-PCR Resultados 64bp 86bp 96bp Expressão de mrna de ET A e ET B Resposta funcional das vias aéreas a ET-1 e sarafotoxina 6c Traquéia 3.9x > Brônquios 3

4 Contração máxima induzida por Ach 10-3 nm O presente estudo mostrou que a inflamação induzida por sefadex por 24h causa a superexpresão do mrna de ET B e up-regulation das respostas funcionais ao agonista seletivo sarafotoxina 6c em células musculares lisas de brônquios Discussão Foi demonstrado pela primeira vez que na inflamação das vias aéreas induzida por sefadex há superexpressão do mrna do receptor ET B nas células musculares lisas de brônquios, sem aumento significativo da expressão do receptor ET A A instilação na traquéia de sefadex consiste em um método bastante conhecido para se estudar inflamação das vias aéreas Sabe-se que durante este processo, a concentração de ET-1 pode aumentar até 30x e que esta pode contribuir para a hiperreatividade das vias aéreas Conclusão No presente estudo, os resultados moleculares corroboram com os estudos funcionais de contratilidade, já que houve superexpressão de ET B nas células musculares lisas de brônquios com aumento da contratilidade brônquica, mas não traqueal, causada por ET-1 e sarafotoxina 6c após sefadex Então, as respostas aumentadas a sarafotoxina 6c e ET-1 nos tecidos brônquicos pode ser explicada pela superexpressão de receptores ET B nesses tecidos Durante o processo de inflamação eosinofílica o nível aumentado de ET-1 provavelmente causa maior consumo dos receptores ETB, no entanto, os mecanismos de up-regulation desses receptores são melhores estudados para músculo liso de vasos sanguíneos Acredita-se eles envolvam síntese de novo via proteínaquinase C e proteínaquinases ativadas por mitógeno, via citocinas Durante a inflamação das vias aéreas induzida por sefadex, há aumento significativo da expressão do mrna de receptores de endotelina-1 do tipo ET B nas células musculares lisas das vias aéreas 4

5 Obrigada! 5