Atividade biológica associada à Atriplex nummularia em solo

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO SEMINÁRIO II Atividade biológica associada à Atriplex nummularia em solo salino-sódico no Agreste de Pernambuco Discente: Karen Cristina Fialho dos Santos Orientadora: Maria Betânia Galvão dos Santos Freire Co-orientadores: Júlia Kuklinsky Sobral Mario de Andrade Lira Junior Novembro, 2009

2 Introdução A salinidade em solos Acúmulo de sais Lençol freático CE 4 ds/m (Oliveira et al., 1992; Ribeiro et al., 2009)

3 Introdução A salinidade em solos Fator limitante para agricultura Aumento considerado nas últimas décadas Fatores: Material de origem (gênese do solo) Uso indiscriminado de água Qualidade da água (Liang et al., 2005)

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5 Introdução A salinidade em solos No Brasil, acontece principalmente em regiões de clima árido e semi-árido Teor de sais que permite apenas o desenvolvimento de plantas halófitas Utilização para fitoextração (Oliveira et al., 1992; Leal et al., 2008; Ribeiro et al., 2009)

6 Introdução A cultura da Atriplex e sua utilização na recuperação de solos salinos Família Chenopodiacea (Austrália) Abundante fitomassa Precipitação de 100 a 250 mm/ano Planta arbustiva, perene Altura 1,5 3,0 m e raízes de até 3,5 m Toleram solos pouco profundos, secos e pobres em nutrientes Precisam de sais para completar seu ciclo de vida (Halófilas autênticas) (Flower et al., 1977; Kelley et al., 1982; O Leary, 1990; Porto et al, 2000; )

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8 Introdução A cultura da Atriplex e sua utilização na recuperação de solos salinos Folhas verde acinzentadas Vesículas esbranquiçadas acumuladoras de sais mecanismo de tolerância Por isso, usadas na fitoextração (Kelley et al., 1982; Porto et al., 2000, Santana & Silva, 2000; Zhu, 2001).

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10 Introdução Microorganismos em ambientes salinos Maioria presentes no Domínio Archea - halófilas Cocos e bacilos Requerem no mínimo 9% de NaCl no solo chegando a até 23% (4mol/L) Halotolerantes 2 a 5% de salinidade Para adaptação principalmente acúmulo de íons orgânicos para equilibrar a tensão osmótica (Santos et al., 2001, Kyaw, 2009; Oetterer, 2009).

11 Introdução Microorganismos em associação à Atriplex Adubação nitrogenada para desenvolvimento da cultura Conhecimento e isolamento de bactérias nativas que fixem N2 Aumento da capacidade do desenvolvimento em solos pobres promoção da fitorremediação Produção do AIA Estudos escassos sobre o tema (Silva et al., 2008).

12 Objetivos Geral Avaliar o desenvolvimento de mudas de Atriplex nummularia sob associação com microorganismos em condições de salinidade.

13 Objetivos Específicos Avaliar a comunidade bacteriana associada a plantas de Atriplex meio de isolamento em meio de cultura com alta concentração de sal Identificar e analisar filogeneticamente os isolados bacterianos pelo estudo do gene 16S rrna; Identificar e analisar a variabilidade genética de populações bacterianas não-cultiváveis por meio da técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Selecionar bactérias fixadoras de N2 e produtoras de ácido indol acético (auxina), um regulador de crescimento vegetal; Avaliar isolados bacterianos quanto a tolerância a diferentes concentrações de salinidade in vitro; Avaliar, em casa de vegetação, os efeitos da reinoculação de bactérias selecionadas sobre o desenvolvimento inicial de plantas de Atriplex. por

14 Material e Métodos Material de estudo e amostragem Bactérias associadas à ambientes com e sem plantas de Atriplex nummularia Experimento de campo, 2008, Neossolo Flúvico salino-sódico no Município de Pesqueira (PE). Período seco (dezembro) e chuvoso (agosto) O solo - textura média, ph 9,1, CE de 21,49 ds/m e Na + solúvel 29,8 cmolc/dm 3 O experimento foi montado em delineamento experimental em blocos casualizados Três tratamentos: planta sem poda, planta com poda e a testemunha

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16 Material e Métodos Material de estudo e amostragem Serão coletadas amostras de solo na profundidade de 0-20 cm Três locais distintos por bloco: 1) na rizosfera, 2) no ponto intermediário entre plantas e na área sem interferência das plantas (tratamento testemunha). Ramos terminais contendo folhas As amostras de solo serão coletadas em duplicata para a identificação biológica e atividade biológica.

17 Material e Métodos Isolamento de bactérias Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana, UAG-UFRPE, para procedimento das análises. Para separação das bactérias do solo e rizosfera serão feitos os procedimentos iniciais de desagregação do solo, em Erlenmeryers com pérolas de vidro. Diluições seriadas para inoculação em meio de cultura TSA 10% + 5% de NaCl, juntamente com o fungicida Cercobyn Serão avaliadas após 3, 8 e 14 dias através da contagem das UFCs Posteriormente serão isoladas e purificadas

18 Material e Métodos Isolamento de bactérias Para o rizoplano, as raízes serão lavadas para retirada do solo Depois será seguido o mesmo procedimento para rizosfera e solo Para isolamento das bactérias endofíticas de folhas e raízes será feita a desinfecção, que seguirá as etapas: Etanol 70% NaOCl 2% Etanol 70% Água 1 Água 2 1 min 3 min 30 seg Depois será seguido o mesmo procedimento para rizosfera, solo e rizoplano

19 Material e Métodos Seleção de bactérias Fixação de N2 meio de cultura sem fonte de N (NFb) confirmação (presença de halo), após 7 dias a 28ºC Produção de AIA meio de TSA + L-triptofano + membrana de nitrocelulose, por 1 dia a 28ºC Após este tempo, membrana removida e tratada com reagente de Salkowski- confirmação por um halo rosa em torno da colônia Tolerância a salinidade- inoculação em placas de petri com concentrações de NaCl de 0g/l; 15 g/l; 30 g/l; 45 g/l; 60 g/l e 75 g/l, por 7 dias a 28ºC Avaliações de acordo com nível do crescimento

20 Material e Métodos Identificação de bactérias Análise parcial do 16S rdna Posteriormente analisadas pelo BLAST Posteriormente o DNA será analisado através de kits (EMBRAPA Meio Ambiente) Só então serão realizadas análises de PCR e DGGE

21 Material e Métodos Atividade Biológica Laboratório de Química do Solo UFRPE Respiração basal (incubação reação do CO2 da respiração com NaOH) C e N (fumigação-extração)

22 Material e Métodos Ensaio em casa de vegetação Após avaliação e identificação dos isolados bacterianos Montagem de experimento em casa de vegetação Envolvendo: mudas de Atriplex (c/ e s/ inoculação), Fertilizantes orgânico e mineral, além de irrigação com águas de diferentes salinidades Mudas micropropagação CETENE sacos de polietileno Escolha dos inóculos N2, AIA e tolerância a salinidade

23 Material e Métodos Tratamento Identificação 1 Fertilizante químico 2 Fertilizante orgânico 3 Inóculo 1 4 Inóculo 2 5 Inóculo 3 6 Inóculo 4 7 Inóculo 5 8 Combinação de bactérias 1 9 Combinação de bactérias 2 10 Combinação de bactérias 3 11 Testemunha Esquema fatorial: 11 x 2 (tratamentos x águas de irrigação 1 e 5 ds/m), com 5 repetições 110 unidades experimentais

24 Material e Métodos Ensaio em casa de vegetação A cada 15 dias, medições de planta Após 90 dias, coleta das plantas e solo Da planta, raízes separadas da parte aérea para determinação do N total e matéria seca Serão realizadas também análises da atividade microbiana do solo

25 Material e Métodos Análise estatística Para a densidade populacional bacteriana - programa SAS Os valores de UFC/g serão transformados em log10 antes da análise de variância. A ANOVA será utilizada para testes a 1% de significância, no delineamento experimental inteiramente casualizado. Teste de Tukey - comparação entre as médias. Experimento casa de vegetação - Contrastes ortogonais (comparação entre grupos)

26 Cronograma Ano Atividades/mês A S O N D J F M A M J J A S O N D J F Elaboração e defesa do projeto Coleta das amostras x x Análises microbiológicas x x x x x x x x x x Análises de DGGE x x Implementação do experimento da casa-devegetação Coleta das amostras Análise do material coletado Análise estatística x x Avaliação dos resultados Redação de artigos e da dissertação Defesa da dissertação x x x x x x x x x x x x

27 Obrigada.