Bactérias halotolerantes e promotoras de crescimento vegetal associadas à Atriplex nummularia L. (1)

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1 1 Bactérias halotolerantes e promotoras de crescimento vegetal associadas à Atriplex nummularia L. (1) Flaviana Gonçalves da Silva (2) ; Isaneli Batista dos Santos (3) ; Andreza Raquel Barbosa de Farias (3) ; Adijailton José de Souza (4) ; Júlia Kuklinsky-Sobral (5) ; Maria Betânia Galvão dos Santos Freire (6) (1) Trabalho integrante do projeto de dissertação da primeira autora. (2) Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Produção Agrícola, UAG/Universidade Federal Rural do Pernambuco UFRPE, Garanhuns, PE, flavianagoncalves.16@hotmail.com; (3) Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Produção Agrícola, UAG/Universidade Federal Rural do Pernambuco UFRPE; (4) Discente do curso de Agronomia, UAG/Universidade Federal Rural de Pernambuco; (5) Professora Adjunta da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco; (6) Professora Associada do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, bolsista CNPq. RESUMO: A Atriplex nummularia L. é considerada uma halófita autêntica que sobrevive em ambientes extremamente salinos, desse modo, esta planta deve estar associada a micro-organismos capazes de promover o crescimento vegetal por diferentes mecanismos, como a fixação biológica de nitrogênio, produção de ácido indol acético e solubilização de fosfato inorgânico. Portanto, objetivou-se selecionar bactérias hatolerantes e promotoras de crescimento vegetal associadas à Atriplex nummularia L. que possam contribuir com o desenvolvimento vegetal. Para a bioprospecção das bactérias, as amostras foram coletadas em quatro nichos: solo rizosférico (solo agregado à raiz); raízes; solo cultivado (com uma distância de 1 metro da planta) e solo da área sem o cultivo da planta, em dois experimentos de campo, com plantas de Atriplex nummularia L. cultivadas nos municípios de Serra Talhada e Ibimirim, Pernambuco. Após a coleta do material de estudo, foi realizado o isolamento das bactérias e a seleção de bactérias em relação a: fixação biológica de nitrogênio (FBN), produção de ácido indol acético (AIA) e solubilização de fosfato inorgânico. Concluise que existem bactérias halotolerantes associadas às plantas de Atriplex, capazes de fixar N 2 ; produzir AIA e solubilizar fosfato inorgânico, havendo a possibilidade desses micro-organismos associados às plantas da Atriplex contribuírem de forma positiva em relação à promoção de crescimento vegetal, podendo, ainda, promover uma melhoria na qualidade de solos salinos com o cultivo desta planta associada à microbiota. Termos de indexação: Salinidade, fosfato, nitrogênio. INTRODUÇÃO A salinidade dos solos torna-se bastante pronunciada em locais do clima árido e semiárido onde as precipitações são reduzidas e mal distribuídas e as elevadas taxas de evapotranspiração propiciam um déficit hídrico durante quase todo o ano, não permitindo a lavagem dos sais do perfil do solo. Este entrave vem crescendo em todo o mundo, sendo que no Brasil, este problema acontece especialmente no Nordeste (Leal, 2008; Freire et al., 2009; Lima Júnior et al., 2010 ). A Atriplex nummularia L. é considerada uma halófita autêntica que sobrevive em ambientes extremamente salinos, sendo uma das mais importantes espécies empregadas na recuperação de solos salinos em todo o mundo, contribuindo para o processo de fitorremediação desses solos, devido sua característica de acumulação de sais nos tecidos vegetais, retirando-os do solo, minimizando assim os efeitos da salinidade. Dessa forma, fitoextração de sais solúveis utilizando plantas halófitas é uma alternativa de baixo custo para recuperação de solos salinos, não apresentando agressividade ao ambiente (Leal et al., 2008). No entanto, conhecimentos da comunidade microbiana e das interações que ocorrem no solo/planta podem permitir a utilização de microrganismos na agricultura, promovendo o crescimento das plantas, podendo solucionar problemas fitossanitários e nutricionais, consequentemente diminuindo a utilização de agroquímicos e evitando a salinização dos solos, por excesso de adubos químicos (Pedrinho, 2009). Havendo ainda a possibilidade desta planta estar associada a micro-organismos capazes de promover o crescimento vegetal por diferentes mecanismos, como a fixação biológica de nitrogênio, produção de ácido indol acético, solubilização de fosfato, entre outros. Dessa forma, objetivou-se selecionar bactérias halotolerantes e promotoras de crescimento vegetal

2 2 associadas à Atriplex nummularia L, que possam contribuir com solo/planta. MATERIAL E MÉTODOS Para a bioprospecção das bactérias, as amostras foram coletadas em cinco nichos: solo rizosférico (solo agregado à raiz); raízes; folhas; solo cultivado (com uma distância de 1 metro da planta) e solo da área sem o cultivo da planta, em dois experimentos de campo, com plantas de Atriplex nummularia L. cultivadas nos municípios de Serra Talhada e Ibimirim, Pernambuco. Os dois experimentos estão implantados em lotes de perímetros irrigados do DNOCS, o de Serra Talhada no Perímetro de Irrigação Cachoeira II e o de Ibimirim no Perímetro Irrigado do Moxotó. Após a coleta do material de estudo, foi realizado o isolamento e a seleção de bactérias em relação a: fixação biológica de nitrogênio (FBN), produção de ácido indol acético (AIA) e solubilização de fosfato inorgânico. As amostras que foram coletadas da zona radicular serviram para a determinação das bactérias endofíticas do material vegetal. Após a coleta do material de estudo, as amostras foram imediatamente transportadas ao Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana (LGBM), da Unidade Acadêmica de Garanhuns, UFRPE, para que as análises fossem procedidas. O isolamento das bactérias do solo e endofíticas foram realizados de acordo com a metodologia de Santos (2010). As bactérias foram isoladas em meio TSA (Triptone Soy Agar) acrescido de 5% de NaCl e logo após foi estimada a densidade populacional bacteriana por UFC.g -1 de solo ou g -1 de tecido vegetal fresco. Em relação à capacidade de fixação biológica de N 2, foram avaliados 21 isolados bacterianos provenientes dos nichos supracitados. As mesmas foram inoculadas em tubos de ensaio contendo 10 ml do meio de cultura NFb semi-sólido sem nitrogênio, incubadas a 28ºC, sendo avaliadas após 7 dias de crescimento. O resultado positivo foi caracterizado qualitativamente pela formação de película ou halo de crescimento bacteriano de cor clara, no interior do meio de cultura, indicando a capacidade de fixação biológica de nitrogênio (Santos, 2010; Pereira et al., 2012). O experimento foi realizado em triplicata. Para seleção e quantificação da produção de ácido 3-indol acético, foram avaliados os mesmos 21 isolados bacterianos que foram relatados anteriormente, onde os mesmos foram inoculados em tubos de ensaio contendo 3 ml do meio líquido TSA suplementado com 5 mm de L-triptofano. Logo após, os tubos foram mantidos em agitação constante a 120 rpm por um período de 16 h, na ausência de luz. Quando foi constatado o crescimento bacteriano, realizou-se uma reação com o reagente de Salkowski, na relação de 1:1 (Araújo et al., 2010). A reação foi mantida a temperatura ambiente por 20 minutos, na ausência de luz e logo após foi submetida à leitura da absorbância em espectrofotômetro, com comprimento de onda de 530 nm (Pereira et al., 2012). Para analisar a capacidade em solubilizar fosfato inorgânico, as bactérias foram inoculadas em meio de cultura sólido contendo fosfato insolúvel, o fosfato de cálcio bibásico, e logo depois incubadas a 28 C. A presença de área clara, ao redor das colônias bacterianas, indicou a solubilização do fosfato. Em seguida, foi calculado o índice de solubilização (IS), expresso pela relação do diâmetro médio do halo de solubilização pelo diâmetro médio do halo da colônia (Santos et al., 2012; Lima, 2012). Foram avaliadas 71 linhagens bacterianas provenientes dos nichos: solo com e sem cultivo; endofíticos de raiz e folha, associadas às plantas de Atriplex. Foi observada a solubilização de fosfato nas concentrações de 0% e 5% de NaCl; e em relação ao tempo, fazendo leituras com 3 e 6 dias após a inoculação. Para a análise estatística, as médias foram comparadas pelo teste de Scott-Knott, com probabilidade de 5%, com o SISVAR 5.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Observou-se na densidade populacional bacteriana, em ambas as áreas e nos diferentes nichos, uma variação de 10 2 a 10 7 UFC.g -1 de solo ou g -1 de tecido vegetal fresco. Entretanto, a densidade populacional das bactérias do solo rizosférico foi superior a dos demais nichos (Figura 1). Em relação à produção de AIA, observou-se que 100% dos isolados foram capazes de sintetizar este fitormônio (Figura 2); os valores de produção diferiram entre 53,25 µg.ml -1 e 3,13 µg.ml -1. Os isolados do solo cultivado, endofítico de raiz e folha tiveram um maior destaque comparando-se com os demais nichos, enquanto que as linhagens do solo sem cultivo foi quantificada uma baixa produção desse hormônio. Para a FBN, ocorreu alta fixação nas linhagens bacterianas testadas, variando em torno de 70%, tendo destaque com alta frequência

3 3 as bactérias do nicho de endofítico de raiz (Figura 3). Para a solubilização de fosfato inorgânico, podese observar que na ausência de NaCl aos 3 dias de cultivo, houve uma solubilização de 50% das linhagens, com um índice de solubilização variando de 1,1 e 15,57, considerando o maior número de linhagens positivas na área do experimento de Serra Talhada, no nicho endofítico de raiz, enquanto que, com 6 dias de cultivo, houve um maior número de solubilizadores, em torno de 75% das linhagens foram consideradas positivas, tendo destaque: solo sem cultivo, endofíticos de raiz e folha, em ambas as áreas, porém o índice de solubilização variou de 1,1 a 12,26, consequentemente, um índice menor do que aos 3 dias de inoculação. Com os isolados testados com 5% de NaCl em 3 dias de cultivo, não houve solubilização em nenhuma das áreas e nichos, enquanto que na leitura com 6 dias de cultivo, teve uma solubilização de 24% das linhagens, destacando-se os endofíticos de raiz e folha (Figura 4). O índice de solubilização das bactérias testadas variou de 0,69 à 3,4. Santos et al., (2012), avaliando bactérias diazotróficas quanto à solubilização de fosfato inorgânico, verificaram que os isolados bacterianos avaliados, expressaram valores de IS variáveis entre 1,00 e 3,48, o que demonstra variabilidade quanto à intensidade de solubilização em meio de cultura sólido. Figura 2. Indicativo da produção de ácido indol acético. Figura 3. Teste de fixação de nitrogênio em meio nfb, livre de fonte nitrogenada. A) Linhagem positiva, apresentando um halo de crescimento; B) Linhagem negativa, ausência de halo de crescimento. Figura 1. Densidade populacional da comunidade bacteriana (Log 10 UFC.g -1 de solo ou g -1 de tecido vegetal fresco), de duas áreas com experimentos de Atriplex nummularia L. Letras iguais, não diferem entre si, de acordo com o teste de Scott-Knott (p<0,05). Figura 4. Teste de Solubilização de fosfato inorgânico com meio de cultura acrescido de 0 e 5% de NaCl.

4 4 CONCLUSÕES Existem bactérias halotolerantes associadas às plantas de Atriplex, capazes de fixar N 2 e produzir AIA; Algumas bactérias são solubilizadoras de fosfato; Há uma predominância maior de solubilizadoras endofíticos nas plantas de Atriplex. de cana-de-açúcar: solubilização de fosfato inorgânico e tolerância à salinidade. Bioscience Journal, v. 28, s.1, p , SANTOS, K. C. F. Atividade biológica e bioprospecção de bactérias associadas à Atriplex nummularia em solo salino sódico no agreste de Pernambuco. IN: Dissertação, Mestrado em Agronomia - Ciência do Solo, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, p AGRADECIMENTOS Agradecemos à CAPES e ao CNPq pelo o apoio financeiro; e ao grupo do Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana da UAG/UFRPE REFERÊNCIAS ARAÚJO, W. L. Guia Prático: Isolamento e caracterização de microrganismos endofíticos. Piracicaba: Calo, p. FREIRE, A. L. O.; RODRIGUES, T. J. D. A Salinidade do solo e seus reflexos no crescimento, nodulação e teores de N e K em Leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) De Vit.). Engenharia Ambiental - Espírito Santo do Pinhal, v. 6, p , LEAL, I. G.; ACCIOLY, A. M. A.; NASCIMENTO, C. W. A.; FREIRE, M. B. G. S.; MONTENEGRO, A. A. A.; FERREIRA, F. L. Fitorremediação de solo salino-sódico por Atriplex nummularia e gesso de jazida. Revista Brasileira de Ciência do Solo, v: 32; p , LIMA, D. R. M. Bactérias fixadoras de nitrogênio associadas a plantas de cana-de-açúcar cultivadas em Pernambuco f. Dissertação (Mestrado) - Pósgraduação em Ciência do Solo, Universidade Federal Rural de Pernambuco. LIMA JUNIOR, J. A.; SILVA, A. L. P. Estudo do processo de salinização para indicar medidas de prevenção de solos salinos. Enciclopédia Biosfera, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, p. 901, PEDRINHO, E. A. N. Isolamento e caracterização de bactérias promotoras de crescimento em milho (Zea mays). IN: Tese, Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. Jaboticabal, p. PEREIRA, A. P. A.; SILVA, M. C. B.; OLIVEIRA, J. R. S.; RAMOS, A. P. S.; FREIRE, M. B. G. S.; FREIRE, F. J.; KUKLINSKY-SOBRAL, J. Influência da salinidade sobre o crescimento e a produção de ácido indol acético de burkholderia spp. endofíticas de cana-de-açúcar. Bioscience Journal, Uberlândia. v. 28, p , SANTOS, I. B.; LIMA, D. R. M.;BARBOSA, J. G.; OLIVEIRA, J. T. C.; FREIRE, F. J.; KUKLINSKY- SOBRAL, J. Bactérias diazotróficas associadas a raízes

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