CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL DO GÊNERO Gluconacetobacter

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1 CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL DO GÊNERO Gluconacetobacter Geovane Souza Silvano 1 ; César Raphael Fernandes da Silveira 2 ; Agenor de Castro Moreira dos Santos Júnior 2 ; Cláudia Cristina Garcia Martin Didonet 3 1 Bolsista PBIC/UEG, graduando do Curso de Farmácia, UnUCET, Anápolis - UEG. 2 Voluntários PVIC/UEG, graduandos do Curso de Farmácia, UnUCET, Anápolis - UEG. 3 Orientador, docente do Curso de Farmácia, UnUCET, Anápolis - UEG.. Resumo Além de fixar nitrogênio atmosférico, bactérias do gênero Gluconacetobacter produzem hormônios de crescimento vegetal, como o Ácido 3-Indol Acético (AIA), e são tolerantes a vários antibióticos. No presente trabalho foi utilizado 20 isolados obtidos em meio semi-seletivo, LGI-P de raiz de plantas de arroz e avaliado a solubilização de fosfato, a produção de protease, a capacidade de antibiose ao fungo fitopatógeno Rhizoctonia sp, e a determinação da produção de ácido 3-indolacético (AIA) e realizado a dosagem de proteínas das amostras de AIA. Nenhum isolado revelou-se positivo para os testes de solubilização de fosfato e antibiose. Entretanto os isolados MRA 10, MRA 18, MRA 53 e MRA 109 produziram proteases. Todos os isolados mostraram-se produtores de AIA, variando de 33,76 µg AIA ml -1 (MRA 11) a 1,48µg AIA ml -1 (MRA 6, MRA 36 e MRA 123). Estes dados foram utilizados na construção de um dendrograma de similaridade, onde se observou uma proximidade entre todos os isolados analisados. Contudo, o objetivo deste trabalho foi caracterizar bactérias do gênero Gluconacetobacter através de testes bioquímicos frente à capacidade de atuarem como Bactérias Promotoras do Crescimento de Plantas. Palavras-chave: Gluconacetobacter; Bactérias diazotróficas; Endofíticos. 1 INTRODUÇÃO São considerados microrganismos endófitos aqueles os quais habitam o interior de plantas, sendo encontrados em órgãos e tecidos vegetais como folhas, ramos e raízes sem provocar doenças e sem produzir estruturas externas visíveis (AZEVEDO et al., 2000). Dentro do grupo das bactérias endofíticas são encontradas as bactérias que habitam as raízes de plantas e exercem efeitos positivos sobre as mesmas, denominadas rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (plant growth-promoting rhizobacteria RPCP) (KUSS, 2006). As RPCP podem atuar na planta de maneira 1

2 direta através da produção de ácido cianídrico, fito-hormônios (auxinas, citocininas, giberelinas e etileno), mineralização de nutrientes, solubilização de fosfatos, fixação do nitrogênio e aumento da absorção pelas raízes (CONN; NOWAK; LAZAROVITS, 1997) ou de forma indireta no antagonismo contra patógenos ou resistência a drogas (SOUZA, 2001). Bactérias do gênero Gluconacetobacter são bactérias endofíticas e estão presentes em vários grupos de plantas cultivadas pelo mundo. Dentre as características benéficas deste organismo estão a capacidade de fixar N 2 em presença de O 2 (REIS & DÖDEREINER, 1998) e produzir alguns promotores de crescimento vegetal como o fito-hormônio ácido 3-indolacético (AIA) e o ácido giberélico (GA) (FUENTES- RAMIREZ et al., 1993). Assim este estudo tem como objetivo caracterizar 24 isolados de plantas de arroz como promotores de crescimento de plantas. 2 MATERIAL E MÉTODOS Bactérias - As bactérias utilizadas neste estudo foram isoladas de raízes de plantas de arroz por Silvano (2007) e mantidas em glicerol a -20 C. Os isolados foram obtidos do banco de microorganismos da UEG, em meio semi-seletivos LGI-P para bactérias do gênero Gluconacetobacter. Foram utilizadas 19 isolados e como padrão para os testes uma estirpe de Acetobacter Produção e dosagem de AIA - Os isolados de Gluconacetobacter foram crescidas em triplicata em meio LGI-P líquido enriquecidos com triptofano (0,5mmol.mL -1 ), e em ausência de triptofano. A dosagem foi realizada em espectrofotômetro (540nm) através da metodologia de Salkowski modificado segundo Marchioro (2005). A curva foi confeccionada com concentrações de AIA (P.A.) 0,5µg.mL -1 a 15 µg.ml -1. Produção de proteases - Os isolados foram crescidos em meio mínimo enriquecido com caseína (10% m/v), e foram inoculadas em triplicata em meio sólido em placas, sendo mantidos por cinco dias. Os resultados positivos foram observados pela produção de um halo transparente ao redor das colônias produtoras de protease, sendo este resultado qualitativo. O diâmetro dos halos e das colônias foi medido e usado para calcular o índice de relação enzimático (IRE), que é dado pelo diâmetro do halo em função do diâmetro da colônia (HANKIN, 1975). Testes de antagonismos a fungos fitopatogênicos - Os ensaios de antagonismo foram realizados utilizado o fungo fitopatógeno do gênero Rhizoctonia, causa o mal-do-pé em 2

3 arroz e em feijão. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. Os ensaios foram realizados segundo Cattelan e colaboradores (1999). Produção de fosfatase - Para este teste os isolados foram inoculados em meio mínimo (MM) com ausência de fosfatos solúveis, acrescido de fosfato insolúvel e de frutose. Foram crescidas por sete dias sob agitação. Para a quantificação de fosfatases utilizouse o Kit Sistema Colorimétrico para Determinação de Fosfatases (Doles ), que permite dosar níveis de fosfatases ácidas totais, ácidas inibidas por ácido tartárico e alcalinas. Os ensaios foram realizados em triplicatas. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Somente os isolados MRA 10, MRA 18, MRA 53 e MRA 109 apresentaram resultado positivo para produção de protease. Nesta avaliação foram utilizados 19 isolados e a estipe padrão Acetobacter Os isolados MRA 5, MRA 6, MRA 11, MRA 21, MRA 22, MRA 36, MRA 56, MRA 72, MRA 86, MRA 88, MRA 96, MRA 100, MRA 123, MRA 131, MRA 143 e o padrão Acetobacter 11280, não foram capazes de produzir proteases. Foi aplicado um índice de produção de protease proposto por Hankin (1975) que correlaciona halo com diâmetro da colônia bacteriana que reflete a eficiência de produção de protease. O isolado MRA 53 apresentou maior índice de 3, enquanto que o menor índice foi apresentado pelo isolado MRA 18 com valor de 2,31. A média obtida para o índice dos isolados foi de 2,77. A bactéria utilizada como padrão (Acetobacter 11280) não produziu proteases e obteve índice zero. Segundo Oliveira e colaboradores (2006), em trabalho com 67 rizobatérias isoladas de plantas cultivadas na região amazônica, foi observado em 28,4% destas bactérias a capacidade de produzir proteases, com índices de eficiência de produção de proteases variando entre 1,3 e 6,6 com média de 3,9. O índice médio de 2,7, obtido neste trabalho é bem similar ao observado por Oliveira e colaboradores (2006) com rizobactérias isoladas da Amazônia. Os 19 isolados do gênero Gluconacetobacter e o padrão Acetobacter crescidos na ausência de triptofano, não foram capazes de produzir AIA, já na presença com triptofano, todos os isolados produziram AIA. O isolado MRA 11 apresentou a maior produção de AIA, com 33,76 µg.ml -1, enquanto que os isolados MRA 6, MRA 36 e MRA 123 produziram apenas 1,48 µg AIA ml -1, sendo estes os isolados com 3

4 menor produção de AIA por ml de meio de cultura. A média total geral (19 isolados mais o padrão Acetobacter 11280) foi de 9,026 µg AIA ml -1 e a média somente dos isolados (19 isolados) foi de 9,044 µg AIA ml -1. Somente os isolados MRA 10, MRA 11, MRA 18, MRA 22, MRA 72, MRA 96 e MRA 109 apresentaram produção de AIA acima da produção média dos isolados. Os isolados MRA 5 (7,6 µg AIA ml -1 ), MRA 86 (7,12 µg AIA ml -1 ), MRA 88 (9 µg AIA ml -1 ), MRA 100 (7,36 µg AIA ml -1 ), MRA 131 (8,2 µg AIA ml -1 ) e MRA 143 (8,76 µg AIA ml -1 ) apresentaram valores próximos do padrão Acetobacter (8,68 µg AIA ml -1 ) e abaixo da média geral (Figura 1). Em trabalho realizado por Marchioro (2005), bactérias endofíticas do gênero Herbaspirillum produziram em média 14,79 µg ml -1, isolados do gênero Burkholderia produziram em média 4,165 µg ml -1 e estirpes do gênero Azospirillum produziram em média 23,94 µg ml -1. Os valores médios de produção de AIA não se assemelhou a nenhum dos gêneros de endofíticos utilizados no trabalho de Marchioro (2005). O isolado MRA 11 destacou-se mesmo quando em comparação com outras estirpes conhecidas, produzindo 33,76 µg AIA ml ug AIA. ml Aceto MRA143 MRA131 MRA123 MRA109 MRA100 MRA96 MRA88 MRA86 MRA72 MRA56 MRA53 MRA36 MRA22 MRA21 MRA18 MRA11 MRA10 MRA6 MRA5 Isolados Figura 1 Quantidade de AIA produzida por cada isolado após sete dias de crescimento em meio líquido com triptofano. Para os isolados testados, possivelmente pertencentes ao gênero Gluconacetobacter, nenhum apresentou capacidade de produção de fosfatases. Os isolados analisados não apresentaram antagonismo ao fungo do gênero Rhizoctonia após avaliação com 196 horas. Utilizando os dados obtidos foi elaborado um dendrograma dos microrganismos analisados pelo agrupamento foi possível perceber a formação de 10 grupos distintos de 4

5 isolados. A similaridade entre todos os isolados está em aproximadamente 75% (Figura 2). Figura 2 - Dendrograma de similaridade obtido pelo coeficiente de Jaccard de 20 isolados de bactérias isoladas do meio LGI-P e analisadas morfológica e bioquimicamente. 4 CONCLUSÃO - Todos os 19 isolados testados demonstraram ser produtores de AIA. - Quatro dos 19 isolados são capazes de produzir protease. - Nenhum isolado dos testados mostrou-se capaz de produzir fosfatases. - Nenhum isolado foi capaz de inibir (antagonismo) o fungo fitopatógêno do gênero Rhizoctonia. -Foram consideradas BPCP todos os isolados testados do gênero Gluconacetobacter por apresentarem resultados positivos para pelo menos uma das características testadas. 5 BIBLIOGRAFIA AZEVEDO, J.L.; et al. Endophytic microorganisms: a review on insect control and recent advances on tropical plants. Electronic Journal of Biotechnology, v.3, CATTELAN A. J.; HARTEL, P. G.; FUHRMANN, J. J. Screening for rhizobacteria to promote early soybean growth, Soil Sci. Soc. Am. J. v.63, p , CONN, K.L., NOWAK, J. & LAZAROVITS, G. Agnotobiotic bioassay for studying interactions between potatoes and plant growth-promoting rhizobacteria. Canadian Journal of Microbiology vol.43, p

6 FUENTES-RAMIREZ, L.E. JIMINEZ-SALGADO,T.; ABARCA, I.R.; M. OCAMPO, CABALLERO-MELLADO, J. Acetobacter diazotrophicus, an indoleacetic acid producing bacterium isolated from sugarcane cultivars of México. Plant Soil, vol.154, p. 145, HANKIN, L.; ANAGNOSTAKIS, S. L. The use of solid media for detection of enzymes production by fungi. Mycologia, v. 67, n. 3, p , KUSS, A. V. Fixação de nitrogênio por bactérias diazotróficas em cultivares de arroz irrigado f. Tese (Doutorado em Ciências do Solo) Centro de Ciências Rurais, Universidade Federal de Santa Maria. Santa Maria, MARCHIORO, L. E. T.; Produção de ácido indol acético e derivados por bactérias fixadoras de nitrogênio, f. Tese (Mestrado.) Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, OLIVEIRA, A. N.; OLIVEIRA, L. A.; ANDRADE J. S.; CHAGAS JÚNIOR, A. F. 2 Enzimas hidrolíticas extracelulares de isolados de rizóbia nativos da Amazônia central, Amazonas, Brasil, Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, v26, n4, p , REIS, V.M.; DÖBEREINER, J. Effect of high sugar concentration on nitrogenase activity of Acetobacter diazotrophicus. Archives of Microbiology, vol.171, p.13-18, SILVANO, G.S. Caracterização de bactérias promotoras de crescimento vegetal do gênero Gluconacetobacter. Relatório Final apresentado ao Programa de Voluntariado de Iniciação Científica, Universidade Estadual de Goiás, Anápolis, SOUZA, M. L. de. Utilização de microrganismos na agricultura. Biotecnologia Ciência &Desenvolvimento, Brasília, n. 21, p ,