CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE RIZÓBIOS ISOLADOS DE FEIJÃO CAUPI CULTIVADO EM SOLOS NO CERRADO DO ESTADO DO TOCANTINS

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1 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE RIZÓBIOS ISOLADOS DE FEIJÃO CAUPI CULTIVADO EM SOLOS NO CERRADO DO ESTADO DO TOCANTINS WESLANY SILVA ROCHA¹; ALOÍSIO FREITAS CHAGAS JÚNIOR² 1 Aluna do Curso de Agronomia; Campus de Gurupi-TO weslanythd@hotmail.com, PIBIC/CNPq 2 Orientador(a) do Curso de Agronomia; Campus de Gurupi-TO; chagasjraf@mail.uft.edu.br RESUMO: O objetivo deste trabalho foi caracterizar morfologicamente estirpes de rizóbios isoladas de feijão-caupí, obtidos de diversas amostras de solos coletadas em diferentes regiões no cerrado tocantinense, e avaliar in vitro as suas capacidades de solubilização de fosfato de cálcio e produção de ácido indol acético. Quanto à capacidade de solubilização de fosfato de cálcio dos 34 isolados, apenas oito (23,53%) obtiveram capacidade de solubilizar fosfato de cálcio. Em relação á produção de AIA, todos os isolados de rizóbio foram capazes de produzir, e as maiores concentrações foram encontradas nos isolados UFT R112, UFT R82 e UFT R16, em meio de cultura, sendo maior com a adição de L-triptofano. Palavras-chaves: rizóbios; fosfato de cálcio; fosfato de alumínio; ácido indol acético. INTRODUÇÃO O feijão-caupi, feijão-de-corda ou feijão-macassar (Vigna unguiculata (L.) Walp.) é uma excelente fonte de proteínas e apresenta todos os aminoácidos essenciais, e por meio da simbiose com rizóbio, tem a habilidade para fixar nitrogênio do ar. O fósforo é um dos nutrientes essenciais para o crescimento e desenvolvimento das plantas e, apesar de ser abundante em solos nas formas orgânicas e inorgânicas, muitos solos cultivados do mundo são deficientes em P na forma disponível para as plantas. Diversos microrganismos do solo, incluindo bactérias e fungos, possuem a capacidade de solubilizar fosfatos por meio de diferentes mecanismos, especialmente pela produção de ácidos. Em adição, estirpes de rizóbio envolvidas na solubilização de P podem aumentar o crescimento vegetal pelo aumento da eficiência da fixação biológica do nitrogênio (Zaidi et al., 2003). Diversos estudos demonstram que o AIA é sintetizada a partir do triptofano. Esta transformação pode ser realizada por microrganismos que produzem uma conversão oxidativa quando o triptofano se encontra em presença de peroxidasses e de radicais livres. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar morfologicamente estirpes de rizóbios isoladas de feijão-caupi, obtidos de diversas amostras de solos coletadas em diferentes regiões no cerrado tocantinense, e avaliar in vitro as suas capacidades de solubilização de fosfato de cálcio e produção de ácido indol acético.

2 MATERIAIS E MÉTODOS Para fonte de inóculos de rizóbio, foram coletadas diferentes amostras de solo de regiões do estado do Tocantins, que visou avaliar as características de eficiência dos isolados de rizóbio nativo na fixação do N 2, usando feijão-caupi (Vigna unguiculata L. Walp.) como planta isca. O experimento deu-se em casa de vegetação e a metodologia permitiu avaliar simultaneamente, a habilidade dos isolados em infectarem e nodular o sistema radicular da planta hospedeira. A coleta das plantas se deu no inicio da floração, seguido de uma lavagem e separação da parte aérea, o sistema radicular foi levado ao laboratório de microbiologia onde foram retirados três nódulos de cada repetição e armazenados em tubos de ensaio devidamente etiquetado e encaminhados para câmera fria. Para avaliação da produção do fito hormônio AIA, as colônias de rizóbios de 2-3 mm de diâmetro crescidas em meio YMA (Vicent, 1970) foram transferidas para tubos de Erlenmeyer contendo 25 ml de meio YM líquido (Vicent, 1970, modificado) na presença e ausência de triptofano. Na presença foi utilizado 100 ml L -1 de L-Tryptofano. Após quatro dias de crescimento sob uma mesa rotatória (100 rpm) a 26ºC ± 2ºC o sobrenadante bacteriano foi separado por rotação ( rpm) durante 15 minutos (Gordon & Weber, 1951). Para as análises colorimétricas de AIA foram utilizadas um parte do reagente de Salkowski [(FeCl 3 0,5 M + HClO 4 (35%)] e duas partes do sobrenadante obtido de cada bactéria. Após a comprovação qualitativa da presença de AIA (coloração rosa após 25 minutos de reação a 26±2ºC), o fito hormônio foi quantificado espectrofotometricamente em 530 nm. As concentrações, em μg ml -1 foram calculadas a partir de uma curva padrão construída com a forma sintética de AIA. Os isolados foram também riscados em meios específicos para solubilização de fosfatos, contendo 10 g de Glucose, 2 g de Extrato de Levedura e 15 g de Ágar. Neste meio acrescentou-se uma solução A contendo 5 g de K 2 HPO 4 (50 ml de água) e uma solução B contendo 10 g de CaCl 2 (100 ml de água), para a formação do fosfato de cálcio precipitado, foi acrescentado o corante azul de bromotimol no meio P-Ca, com o objetivo de visualizar a alteração do ph do meio pelas bactérias, em função da alteração da cor do meio, ajustando-se o ph para 6,5 para a formação do halo de solubilização de fosfato de cálcio. Com base nos índices de solubilização, as bactérias foram classificadas como isolados com baixa (IS < 2), média (2 IS < 4) e alta solubilização (IS > 4).

3 RESULTADO E DISCUSSÃO A caracterização morfológica foi avaliada através da observação de características fenotípicas (Tabela 1) dos isolados retirados dos nódulos das plantas iscas. Não foi possível separar os isolados de rizóbios em grupos semelhantes, pois os mesmos apresentavam características fenotípicas bastante variadas, o que sugere grande diversidade genética entre os isolados estudados. Tabela 1 - Características morfofisiológicas dos grupos de isolados de rizóbio obtidos de amostras de solos de diferentes regiões do Tocantins. Isolados 1 Características dos grupos de isolados/ 2 TC ph DC EC Tr CC EM TM QM R82, R83, R102 e R121 R Ac > 2 E S B SE Vis M R02, R50 e R109 R Ac < 2 P S B SE Vis M R63, R76 e R97 R Ac > 2 E S B CE Vis M R35, R57 e R80 R Ac 2 E S B SE Vis M R112 L Al 2 P S B SE Vis M R20 R Ac < 2 E N B CE But M R34, R59 e R67 R Al 2 P S B SE Vis M R44 R Ac 2 P S A SE Vis M R93 L Ac 2 E S B SE Vis M R91 R Ac 2 P S A SE Vis P R16 R Al < 2 P S B SE But P R87 L Al > 2 E S B CE But P R27 L Al < 2 P S B SE But M 122 L * < 2 E N B SE But M 123 L * <2 E S B SE But M 124 R * <2 E S B CE Vis M 125 R * <2 E N B CE Vis M 126 L * <2 E N B SE But M 127 R * <2 E N B CE Vis M 128 R * <2 P S B CE Vis M 129 L * <2 P N B SE But M 1 Grupos de isolados. 2 TC - tempo de crescimento (R: rápido 3 dias, L: lento > 3 dias); ph do meio (Ac: ácido, Al: álcalis); DC - diâmetro da colônia em mm; EC - elevação da colônia (P: plana, E: elevada); Tr - transparência (S: sim, N: não); CC - cor da colônia (A: amarela, B: branca); EM - elasticidade do muco (SE: sem elasticidade, CE: com elasticidade); TM - tipo de muco (Vis: viscoso, But: butírico); QM quantidade de muco (M: muito, P: pouco);*-não houve análise deste iten. A tabela 02 mostra a capacidade de solubilização de fosfato de cálcio e alumínio por rizóbios, onde as estirpes marcadas com um sinal de positivo (+) tiveram a capacidade de solubilizar fosfato de cálcio, adicionadas ao meio de cultura. Já as que foram marcadas com o sinal negativo (-) não solubilizaram fosfato de cálcio. Quanto ao índice de solubilização de fosfato de cálcio dos 34 isolados, apenas oito (23,53%) obtiveram capacidade de solubilizar fosfato de cálcio. Resultados semelhantes, quanto a capacidade de solubilizar fosfato de cálcio foram reportados por Chagas Jr et al. (2010) para isolados de rizóbio oriundos da Amazônia.

4 Tabela 2: Solubilização de fosfato de cálcio (P-Ca) por isolados de rizóbios de feijão caupí em diferentes solos do cerrado Tocantinense. ISOLADOS ESPÉCIE ESPÉCIE P-Ca ¹ ISOLADOS VEGETAL VEGETAL P-Ca ¹ R 02 Feijão Caupi - 2 R 91 Feijão Caupi - R 16 Feijão Caupi + R 93 Feijão Caupi - R 20 Feijão Caupi - R 97 Feijão Caupi - R 27 Feijão Caupi - R 102 Feijão Caupi + R 34 Feijão Caupi - R 109 Feijão Caupi + R 35 Feijão Caupi + 3 R 112 Feijão Caupi + R 44 Feijão Caupi + R 121 Feijão Caupi - R 50 Feijão Caupi + R 122 Feijão Caupi - R 57 Feijão Caupi - R 123 Feijão Caupi - R 59 Feijão Caupi - R 124 Feijão Caupi - R 63 Feijão Caupi - R 125 Feijão Caupi - R 67 Feijão Caupi - R 126 Feijão Caupi - R 76 Feijão Caupi - R 127 Feijão Caupi - R 80 Feijão Caupi - R 128 Feijão Caupi - R 82 Feijão Caupi - R 129 Feijão Caupi - R 83 Feijão Caupi + INPA 03-11B Estirpe padrão 4 - R 87 Feijão Caupi - UFLA 3-84 Estirpe padrão - ¹ = Capacidade de solubilização de Fosfato de Cálcio; 2 = Índice de solubilização zero, ou seja, não há capacidade de solubilização de Fosfato de Cálcio; 3 = Índice de solubilização positivo, ou seja, há a capacidade de solubilização de Fosfato de Cálcio; 4 Estirpes padrões selecionadas e identificadas. Recomendadas para a cultura do feijão caupi. Todos os isolados apresentaram capacidade de sintetizar AIA, mesmo em pequenas quantidades. Os isolados UFT R112, UFT R82 e UFT R16 produziram as maiores concentrações de AIA nos tratamentos com adição de L-triptofano. Halda-Alija (2003), em seus experimentos, também verificou que houve produção de AIA pelos isolados de diazotróficas, mesmo quando não houve adição de triptofano ao meio de cultura. Existem várias rotas para a biossíntese do AIA, sendo o aminoácido triptofano o seu provável precursor. Suspeita-se da existência de outra via independente do triptofano para a biossíntese desse hormônio vegetal. Apesar de ambas as vias coexistirem nas plantas, a importância relativa de cada uma para o conteúdo de AIA nos tecidos vegetais, ainda não foi esclarecida. Quanto as concentrações de AIA produzidas pelos isolados com a utilização do L- triptofano, o isolado UFT R112 foi superior aos demais isolados, variando de 10 a 330 mg L - 1. Na comparação dos tratamentos com e sem L-triptofano, houve diferença significativa, evidenciando o efeito positivo da utilização do L-triptofano como indutor para síntese de AIA. A habilidade de sintetizar fitormônios é amplamente distribuída entre bactérias associadas com plantas. Entre eles, a produção de ácido indolacético (AIA), que estimula tanto a elongação celular quanto a divisão e diferenciação celular nas plantas. Tabela 3: Potencial de produção de ácido 3-indol acético (mg L -1 ) por isolados de rizóbios obtidos de feijão-caupi no cerrado Tocantinense.

5 ISOLADOS ESPÉCIE VEGETAL AIA ESPÉCIE AIA (mg L -1 ISOLADOS ) VEGETAL (mg L -1 ) R 02 Feijão Caupi + R 91 Feijão Caupi + R 16 Feijão Caupi + R 93 Feijão Caupi + R 20 Feijão Caupi + R 97 Feijão Caupi + R 27 Feijão Caupi + R 102 Feijão Caupi + R 34 Feijão Caupi + R 109 Feijão Caupi + R 35 Feijão Caupi + R 112 Feijão Caupi + R 44 Feijão Caupi + R 121 Feijão Caupi + R 50 Feijão Caupi + R 122 Feijão Caupi + R 57 Feijão Caupi + R 123 Feijão Caupi + R 59 Feijão Caupi + R 124 Feijão Caupi + R 63 Feijão Caupi + R 125 Feijão Caupi + R 67 Feijão Caupi + R 126 Feijão Caupi + R 76 Feijão Caupi + R 127 Feijão Caupi + R 80 Feijão Caupi + R 128 Feijão Caupi + R 82 Feijão Caupi + R 129 Feijão Caupi + R 83 Feijão Caupi + INPA B Padrão + R 87 Feijão Caupi + UFLA 3-84 Padrão + A capacidade de solubilização de fosfato e produção de AIA pelos isolados de rizóbio avaliados sugere o uso potencial dessas bactérias como promotores do crescimento radicular de espécies vegetais de importância agrícola. Resultados semelhantes foram reportados para diferentes isolados de rizóbio, conforme documentado por Chagas Jr. et al. (2009; 2010). LITERATURA CHAGAS Jr, A.F; OLIVEIRA, L.A; OLIVEIRA, A. N. Produção de ácido indolacético por rizóbios isolados de caupi. Ver. Ceres, Viçosa, v.56, n.6, p , CHAGAS Jr, A.F; OLIVEIRA, L.A; OLIVEIRA, A. N.; WILLERDING, A. L. Capacidade de solubilização de fosfatos e eficiência simbiótica de rizóbios isolados de solos da Amazônia. Acta Scientiarum. Agronomy. Maringá, v.32. n.2, p , HALDA-ALIJA, L. Identification of indole-3-acetic acid producing freshwater wetland rhizosfere bacteria associated with Juncus effusus L. Cambridge Journal of Microbiology, v.49, p , VINCENT, J. M. (1970). A Manual for the Practical Study of Root Nodule Bacteria. Oxford: Blackwell Scientific. ZAIDI, A; KHAN, M.S.; AMIl, M. Interactive effect of rhizotrophic microorganisms on yield and nutrient uptake of chickpea (Cicer arietinum L.). European J. Agronomy, 9: AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil"