CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE RIZÓBIOS ISOLADOS DE FEIJÃO- CAUPI E ESPÉCIES DE ADUBAÇÃO VERDE CULTIVADO EM SOLOS NO CERRADO NO ESTADO DE TOCANTINS.

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1 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE RIZÓBIOS ISOLADOS DE FEIJÃO- CAUPI E ESPÉCIES DE ADUBAÇÃO VERDE CULTIVADO EM SOLOS NO CERRADO NO ESTADO DE TOCANTINS. Nome dos autores: WESLANY SILVA ROCHA¹; ALOÍSIO FREITAS CHAGAS JÚNIOR² Nome do Aluno 1 ; Nome do Orientador 2 1 Aluno do Curso de Agronomia; Campus de Gurupi weslanythd@hotmail.com. PIBIC/UFT 2 Orientador(a) do Curso de Agronomia; Campus de Gurupi; chagasjraf@mail.uft.edu.br RESUMO Em solos com baixa disponibilidade de fósforo a habilidade de estirpes de rizóbio de solubilizar compostos de fosfato inorgânico é extremamente importante. Além disso, as bactérias rizobiais do solo fixadoras de nitrogênio sintetizam naturalmente o ácido indol acético (AIA). Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar fenotipicamente e determinar a capacidade de solubilização de fosfato de cálcio e fosfato de alumínio (P-Al) e produção de AIA de isolados de rizóbio isolados de feijão-caupi e espécies de adubação verde. Quanto à capacidade de solubilização de fosfato os isolados UFT R2052 (IS=11,67), UFT R2054 (IS=10,34), UFT R2059 (IS=5,25) e UFT R2061 (IS=13,66), obtiveram os maiores índices de solubilização. Todos os isolados de rizóbio estudados foram capazes de produzir AIA, em meio de cultura, sendo maior com a adição de L-triptofano. Palavras-chave: adubação verde, Fosfato de cálcio, fosfato de alumínio, ácido indol acético INTRODUÇÃO As leguminosas são preferência entre os agricultores e a principal razão é a fixação do nitrogênio atmosférico por bactérias, principalmente dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium, que vivem em simbiose com suas raízes. O fósforo é um dos nutrientes essenciais para o crescimento e desenvolvimento das plantas e, apesar de ser abundante em solos nas formas orgânicas e inorgânicas, muitos solos cultivados do mundo, são deficientes em P na forma disponível para as plantas. Essa baixa disponibilidade de P nos solos é devido à alta reatividade do P solúvel com cálcio (Ca), ferro (Fe) ou alumínio (Al) que atuam na sua precipitação. Diversos micro-organismos do solo, incluindo bactérias e fungos, possuem a capacidade de solubilizar fosfatos por meio de diferentes mecanismos, especialmente pela produção de ácidos (Chagas Jr & Oliveira, 2001).

2 O uso de microrganismos capazes de solubilizar fosfatos como bactérias fixadoras de N 2, pode ajudar a aumentar a disponibilidade de fosfatos para o crescimento das plantas leguminosas e não leguminosas (Schoenfeld et al., 2005). Em adição, estirpes de rizóbio envolvidas na solubilização de P podem aumentar o crescimento vegetal pelo aumento da eficiência da fixação biológica do nitrogênio. Alguns microrganismos endofíticos, como os rizóbio também têm apresentado a capacidade de estimular o crescimento das plantas por mecanismos como a produção de fito hormônios. Um dos mais importantes reguladores naturais de crescimento são as Auxinas e dentre as auxinas o AIA (Ácido indol-acético) predomina como sua principal forma. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar morfologicamente estirpes de rizobios e avaliar in vitro as suas capacidades de solubilização de fosfato de cálcio e alumínio e produção de ácido indol-acético por isolados de espécies utilizadas como adubo verde em solos do cerrado no estado do Tocantins. MATERIAL E MÉTODOS Para fonte de inóculos de rizóbio, foram obtidas diferentes amostras de solo de regiões do Estado de Tocantins, que visou avaliar as características de eficiência dos isolados de rizóbio nativo na fixação do N 2, usando feijão-caupi (Vigna unguiculata L. Walp.), crotalária (Crotalaria spectabilis, Crotalaria juncea L.), feijão porco (Canavalia ensiformis), lab-lab (Dolichos lab lab), mucuna preta (Mucuna pruriens L.), feijão guandu (Cajanus cajan L.), calopogônio (Calopogonium muconoides), soja (Glycine max L.) e invasora não identificada, como plantas iscas. O experimento deu-se em casa de vegetação e a coleta das plantas se deu no inicio da floração, seguido de uma lavagem e separação da parte aérea. O sistema radicular foi levado ao laboratório de microbiologia onde foram retirados três nódulos de cada repetição, sendo feito o isolamento e caracterização morfológica. Para avaliação da produção do fito hormônio AIA, as colônias de rizóbios de 2-3 mm de diâmetro crescidas em meio YMA (Vicent, 1970) foram transferidas para tubos de Erlenmeyer contendo 25 ml de meio YM líquido na presença de 100 ml L -1 de L-Tryptofano. Após quatro dias de crescimento sob uma mesa rotatória (100 rpm) a 26ºC ± 2ºC o sobrenadante bacteriano foi separado por rotação ( rpm) durante 15 minutos (Gordon & Weber, 1951). Para as análises colorimétricas de AIA foram utilizadas um parte do reagente de Salkowski [(FeCl 3 0,5 M + HClO 4 (35%)] e duas partes do sobrenadante obtido de cada bactéria. Após a comprovação qualitativa da presença de AIA (coloração rosa após 25 minutos de reação a 26±2ºC), o fito hormônio foi

3 quantificado espectrofotometricamente em 530 nm. As concentrações, em μg ml -1 foram calculadas a partir de uma curva padrão construída com a forma sintética de AIA. Os isolados foram também riscados em meios específicos para solubilização de fosfatos, contendo 10 g de Glucose, 2 g de Extrato de Levedura e 15 g de Ágar. Neste meio acrescentou-se uma solução A contendo 5 g de K 2 HPO 4 (50 ml de água) e uma solução B contendo 10 g de CaCl 2 (100 ml de água), para a formação do fosfato de cálcio precipitado. Foi acrescentado o corante azul de bromotimol no meio P-Ca, com o objetivo de visualizar a alteração do ph do meio pelas bactérias, em função da alteração da cor do meio (Hara & Oliveira, 2004), ajustando-se o ph para 6,5 para a formação do halo de solubilização de fosfato de cálcio. Com base nos índices de solubilização, as bactérias foram classificadas como isolados com baixa (IS < 2), média (2 IS < 4) e alta solubilização (IS > 4). RESULTADOS E DISCUSSÃO A caracterização morfológica foi avaliada através da observação de características fenotípicas (Tabela 1) dos isolados retirados dos nódulos das plantas iscas. Não foi possível separar os isolados de rizóbios em grupos semelhantes, pois os mesmos apresentavam características bastante variadas. Quanto ao índice de solubilização de fosfato de cálcio (Tabela 02) dos 13 isolados, apenas cinco (38,5%), UFT R2054 (IS=10,34), UFT R2052 (IS=11,67), UFT R2061 (IS=13,66), UFT R2059 (IS=5,25), obtiveram índices de solubilização altos sendo classificadas como precoce e acidificaram o ph do meio de cultura, e o isolado UFT R2058 (IS=0,5), obteve o menor índice,sendo classificado como baixa solubilização. Os isolados UFT R2053, UFT R2055, UFT R2060, UFT R2056, UFT R2057, UFT R2063, UFT R2051, UFT R2062 não apresentaram a capacidade de solubilizar fosfato de cálcio e alumínio. Porém todas, com exceção do UFT R2057 e UFT R2063, acidificaram o meio de cultura. Nenhum isolado solubilizou o fosfato de alumínio. Todos os isolados apresentaram capacidade de sintetizar AIA. Os isolados UFT R2051, UFT R2054 e UFT R2058 produziram as maiores concentrações de AIA nos tratamentos sem adição de L-triptofano. As concentrações de AIA produzidas pelos isolados sem adição de L-triptofano variou de 1,0 a 9,0 mg L -1 (Tabela 3). Com a utilização do L-triptofano, o isolado UFT R2060 foi superior aos demais isolados (Tabela 3), variando de 16,6 a 61,3 mg L -1. Os isolados UFT R2051, UFT R2054, UFT R2057, UFT R2061 e UFT R2062 apresentaram as menores concentrações, respectivamente. Na comparação dos tratamentos com e sem L-triptofano, houve diferença

4 significativa, evidenciando o efeito positivo da utilização do L-triptofano como indutor para síntese de AIA (Tabela 3). A capacidade de solubilização de fosfato e produção de AIA pelos isolados de rizóbio avaliados sugere o uso potencial desses fungos como promotores do crescimento radicular de espécies vegetais de importância agrícola. Resultados semelhantes foram reportados para diferentes isolados de rizóbio, conforme documentado por (Chagas Jr. et al., 2009; 2010). Tabela1: Caracterização morfológica de isolados de Rizóbios de espécies recomendadas para adubação verde. Espécies Isolados T C ph DC FC EC BC TR CC TM QM Canavalia ensiformis UFTR 2051 < 3 Ác < 2 Cir Pl In N Br Bu Mui Dolichos lablab UFTR 2052 < 3 Ác < 2 Cir Pl Irr N Br Vi Po Crotalaria spectabilis UFTR 2053 < 3 Ác < 2 Cir El Irr N Br Vi Mui Cajanus cajan L. UFTR 2054 < 3 Ác < 2 Cir Pl In N Br Vi Po Cajanus cajan L. UFTR 2055 < 3 Ác < 2 Irr El Irr N Am Vi Mui Invasora não identificada UFTR 2056 < 3 Ác < 2 Cir El In N Br Vi Mui Vigna unguiculata L. Walp. UFTR 2057 < 3 Ác > 2 Cir El In N Br Vi Mui Calopogonium muconoides UFTR 2058 < 3 Ác < 2 Cir Pl In N Am Bu Po Mucuna pruriens UFTR 2059 < 3 Ác < 2 Cir Pl In N Br Bu Po Dolichos lab lab UFTR 2060 < 3 Ác < 2 Cir El In S Br Vi Mui Glycine max L. UFTR 2061 < 3 Ác < 2 Cir El In N Br Vi Mui Dolichos lab lab UFTR 2062 < 3 Ác < 2 Cir Pl In N Br Vi Mui Crotalaria juncea UFTR 2063 < 3 Alc < 2 Cir Pl In N Br Vi Po TC= tempo de crescimento; ph = ph do meio de cultura (Ác = Acidificou, Alc = Alcalinizou); DC = diâmetro da colônia em mm; FC = forma da colônia (Irr = irregular, Cir = circular); EC = elevação da colônia (El = elevada,pl= plana); BC = borda da colônia (In = inteira, Irr = irregular); TR = transparência da colônia (N= não, S = sim); CC = cor da colônia (Br = branca, Am= Amarela); TM= Tipo de muco (Bu= Butirico, Vi= viscos); QM=quantidade muco ( Mui= Muito, Po= Pouco). Tabela 2: Índice de solubilização de fosfato de cálcio, ph do meio e o tempo de solubilização de fosfato por rizóbios isolados de espécies de adubação verde ISOLADOS ESPECIES VEGETAL Inicio solub. IS¹ INICIAL IS¹ FINAL UFT R2054 Cajanus cajan L. 3 5,66 10,34 UFT R2052 Dolichos lablab ,67 UFT R2061 Glycine max L ,66 UFT R2053 Crotalaria spectabilis UFT R2055 Cajanus cajan L UFT R2058 Calopogonium muconoides ,5 UFT R2060 Dolichos lab lab UFT R2056 Invasora não identificada UFT R2057 Vigna unguiculata L. Walp UFT R2059 Mucuna pruriens 6 0 5,25 UFT R2063 Crotalaria juncea UFT R2051 Canavalia ensiformis UFT R2062 Dolichos lab lab = Índice de solubilização (Inicial e Final); 2 = Tempo de Solubilização; 3 = Capacidade de modificar o ph do meio de cultura

5 Tabela 3: Produção de AIA (mg L -1 ) por rizóbio isolados de espécies de adubação verde na ausência e presença de L-triptofano. 1 Tratamentos AIA (mg L -1 ) S Trip. C Trip. UFT R2051 9,0 ab 23,8 ca UFT R2052 5,9 bb 34,4 ba UFT R2053 5,2 bb 33,4 ba UFT R2054 7,4 ab 27,5 ca UFT R2055 6,2 bb 31,0 ba UFT R2056 5,2 bb 34,9 ba UFT R2057 1,0 cb 16,6 ca UFT R2058 8,5 ab 37,5 ba UFT R2059 1,1 cb 31,6 ba UFT R2060 4,8 bb 61,3 aa UFT R2061 4,6 bb 17,4 ca UFT R2062 5,6 bb 22,6 ca UFT R2063 4,6 bb 31,6 ba Média 5,3 B 31,1 A C.V. 2 11,9 13,2 1 Médias seguidas de mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem entre si pelo teste Scott Knott a 5%. 2 Coeficiente de variação. LITERATURA CHAGAS Jr, A.F; OLIVEIRA, L.A; OLIVEIRA, A. N. Produção de ácido indolacético por rizóbios isolados de caupi. Ver. Ceres, Viçosa, v.56, n.6, p , 2009 CHAGAS Jr, A.F; OLIVEIRA, L.A; OLIVEIRA, A. N.; WILLERDING, A. L. Capacidade de solubilização de fosfatos e eficiência simbiótica de rizóbios isolados de solos da Amazônia. Acta Scientiarum. Agronomy. Maringá, v.32. n.2, p , CHAGAS Jr., A.F.; OLIVEIRA, L.A. Tolerância de bactérias solubilizadoras de fosfatos à acidez e ao alumínio. Ciências Agrárias e Ambientais: Rev. Universidade Federal do Amazonas, 1(1/2): GORDON, S.A.; WEBER, R.P. Colorimetric estimation of indoleacetic acid. Plant Physiology,26: SCHOENFELD, R.; ALVES, J.B.; SCHUH, C.; SILVEIRA, M.S.; BINZ, A.; ANZANELLO, R.; SELBACH, P.A.; CAMARGO, F.A.O.; SÁ, E.L.S. Efeito da inoculação de rizóbios como bactérias promotoras de crescimento em arroz irrigado (Oruza sativa). In: XXX Congresso Brasileiro de Ciências do Solo. Recife. Anais... Palestra. CD ROOM AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio da UFT