Laboratório de Microbiologia, Departamento de Patologia, Universidade Federal do Maranhão, São Luís, Brasil 2

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1 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Ocorrência de Escherichia coli produtora de toxinas "Shiga" (STEC) na microbiota intestinal de bovinos destinados ao abate no município de São Luís - MA / Brasil Occurrence of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) in intestinal microbiota of bovine destined to the slaughter in the city of São Luís - MA / Brazil Sofia S. Sales* 1,2, Francisca N. Costa 2, Lúcia M. C. Alves 2, Leandra M. Barrozo 2, Andreya M. Holanda-Viana 3, Emygdia R. Leal-Mesquita 3, Valério Monteiro-Neto 1 1 Laboratório de Microbiologia, Departamento de Patologia, Universidade Federal do Maranhão, São Luís, Brasil 2 Laboratório de Microbiologia de Alimentos, Departamento de Patologia, Universidade Estadual do Maranhão, São Luís, Brasil 3 Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Departamento de Biologia, Universidade Federal do Maranhão, São Luís, Brasil Resumo: Escherichia coli produtora de toxinas "Shiga" (STEC) pode causar uma infecção intestinal séria, a colite hemorrágica e a síndrome urémica hemolítica, sendo adquirida com frequência pela ingestão de alimentos cárneos contaminados. Tendo em vista a ausência de dados sobre a sua incidência na Região Nordeste, em particular no Estado do Maranhão, este estudo teve por objetivo investigar a presença de STEC na microbiota intestinal de bovinos oriundos de diferentes municípios do Estado. A colheita de fezes ocorreu entre os meses de Março e Julho de As amostras de fezes de 100 animais foram semeadas em meios de cultura selectivos e não selectivos. Fizeram-se pools de 10 colónias, que foram submetidos à análise molecular por PCR multiplex para os genes stx1, stx2 e eaea. A taxa de isolamento de STEC nos 100 animais analisados foi de 73%, com uma média de distribuição por município de 76,6%. Os principais perfis genotípicos de virulência detectados foram: 1) stx1/stx2 com 68,8%; 2) stx1 com 11,8% e 3) stx2 com 8,6%. Poucas estirpes de STEC (4,4%) possuíam o gene eaea em associação aos genes stx. Todos os municípios apresentaram animais com pelo menos um dos genes pesquisados. Esses resultados indicam que a bactéria está amplamente difundida nos bovinos do Maranhão, o que constitui um risco na medida em que pode, eventualmente, vir a causar infecções no Homem via cadeia alimentar. Summary: Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is the etiologic agent of a serious intestinal infection, designated hemorrhagic colitis and a renal dysfunction, hemolytic-uremic syndrome that are acquired by ingestion of contaminated meat food. This study aimed to investigate the presence of STEC in intestinal microbiota of bovine, which came from different regions of the Maranhão State. Feces samples were collected from March to July, Samples were obtained from 100 animals and submitted to examination onto selective and non-selective culture media. Colonies were grouped in pools analyzed by PCR multiplex for genes stx1, stx2 e eaea. The detection rate of STEC in the 100 animals was 73%, with an *Correspondência: sofiasales@uol.com.br Tel: +55 (98) ; Fax: +55 (98) average of 76.6% per city. The major genotypic profiles observed were: 1) stx/stx2 68.8%; 2) stx1 11.8%, and 3) stx2 8.6%. Few STEC strains (4.4%) harbored the eaea gene in association with any of stx genes. Bovines from all Cities possessed at least one of the virulence genes of STEC. These results indicate that STEC is widespread in our region and is able to, eventually, cause foodborne infection in men. Introdução Diferentes serótipos de Escherichia coli têm sido responsabilizados por patologias que apresentam alta gravidade para o Homem, entre os quais os produtores de toxinas "Shiga" (STEC), sendo estes considerados microrganismos patogénicos emergentes devido à sua identificação relativamente recente como um dos principais problemas de saúde pública em vários países (Griffin e Tauxe, 1991; Boyce et al., 1995; Nataro e Kaper, 1998). As estirpes de E. coli enquadradas naquela categoria produzem duas citotoxinas, isoladamente ou em associação, denominadas toxinas Shiga 1 e Shiga 2 (Stx1 e Stx2). A Stx1 é praticamente idêntica à citotoxina Stx produzida por Shigella dysenteriae tipo 1, enquanto que a Stx2 apresenta uma homologia de 56% na sequência de aminoácidos quando comparada com as anteriores (Paton e Paton, 1998b). As toxinas Stx1 e Stx2 são os principais factores de virulência associados com a doença denominada colite hemorrágica (CH), que em casos mais graves, resulta num quadro conhecido como síndrome urémica hemolítica (HUS) (Schmitt et al., 1999). A produção dessa toxina é essencial para a determinação de muitas características patológicas da infecção causada por 245

2 STEC, as quais podem apresentar diferentes manifestações clínicas (Beutin et al., 1998; Schmitt et al., 1999; Welinder-Olsson et al., 2002), provocando no Homem além da colite hemorrágica (CH) e da síndrome urémica hemolítica (HUS), a púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), diarreia não sanguinolenta e, inclusive, infecções assintomáticas (Karmali, 1989; Blanco et al., 1993). As STEC contêm uma "ilha de patogenicidade" denominada de região LEE (locus for enterocyte effacement), a qual codifica para todos os elementos necessários para a adesão e destruição das microvilosidades ou lesão AE (attaching and effacing) (Nataro e Kaper, 1998). A colonização da mucosa do cólon é o evento central para o estabelecimento da infecção intestinal (Baehler e Moxley, 2002; Robinson et al., 2006), mas os mecanismos envolvidos não estão ainda bem esclarecidos. Apesar dos esforços para identificar todas as prováveis adesinas, o único factor já demonstrado que desempenha um papel na interação com a célula eucariótica de estirpes LEE-positivas é intimina, uma proteína de membrana que está envolvida na adesão íntima da bactéria à mucosa intestinal e é producto do gene eae, o qual está localizado dentro da região LEE (Donnenberg et al., 1993; McKee et al., 1995). Contudo, alguns casos de doença severa, incluindo HUS, são causados por estirpes de STEC LEE-negativas (Paton et al., 2001), indicando que a região LEE não é essencial para a patogenicidade. Existem estudos que demonstram que a EHEC pode expressar outros factores relacionados com a colonização intestinal (Torres et al., 2005; Low et al., 2006). A incidência de STEC em todas as regiões do Brasil é desconhecida, mas a infecção causada por STEC em humanos já foi relatada (Cantarelli et al., 2000; Irino et al., 2002; Franzolin et al., 2005). Também foi detectada uma alta incidência dessas bactérias em bovinos oriundos de alguns estados brasileiros (Cerqueira et al., 1999; Irino et al., 2005). Como outras estirpes da sua espécie, as STEC tem seu habitat no solo, água contaminada e material em decomposição, sendo seu reservatório principal o tracto gastrintestinal de bovinos, embora também já tenha sido isolada do intestino de suínos, caprinos, entre outros (Keen et al., 2006). A contaminação de carcaças de bovino com conteúdo intestinal pode ocorrer durante as operações de abate, sobretudo durante a evisceração. Pode assim constituir um risco para a saúde, o consumo de carne e derivados cárneos contaminados, quando o tempo e a temperatura de processamento pré-consumo não são suficientemente adequados para a inactivação de STEC (Hart et al., 1997). Considerando que, durante o abate, a carcaça pode ser contaminada por conteúdo intestinal e que a carne de bovino pode veicular microrganismos patogénicos para o consumidor, o presente estudo teve por objectivo avaliar a ocorrência de estirpes de E. coli produtoras de toxinas "Shiga" na microbiota intestinal de bovinos destinados ao abate no município de São Luís/MA, através da pesquisa dos genes stx1, stx1 e eaea nas referidas estirpes isoladas de amostras fecais. Material e métodos No período de Março a Julho de 2003, foram colhidas num matadouro do Município de São Luís/MA, amostras fecais de 100 bovinos procedentes de 12 municípios do interior do Estado. As amostras de fezes foram colhidas directamente do recto dos animais, em sacos de polietileno esterilizados, sendo devidamente acondicionados em caixa de material isotérmico. Após a colheita, as amostras foram imediatamente transportadas para o laboratório, onde foram submetidas a análises microbiológicas. O pré- -enriquecimento foi realizado adicionando-se 10 g de fezes a 100 ml de caldo verde brilhante bilis (2 %) lactose (Merck, Darmstadt, Alemanha), sendo em seguida homogeneizadas com auxílio de uma vareta de vidro esterilizada e incubadas à temperatura de 37 C durante 6 horas (Feder et al., 2003). Após a incubação, foi realizada a sementeira em caixas de Petri com meio ágar MacConkey (MAC, Difco, Becton Dickinson and Company, Sparks, EUA) e com meio ágar MacConkey base (Difco) suplementado com sorbitol - 1 g/100 ml, cefixima - 50 ng/ml e telurito de potássio - 2,5 µg/ml (CT-SMAC) (Zadik et al., 1993; Sanderson et al., 1995). Os meios depois de semeados foram incubados a 37 C durante 18 horas. A partir do crescimento no meio MAC, foram selecionadas 10 colónias consideradas fermentadoras de lactose, sugestivas de E. coli. A partir do meio CT-SMAC foram selecionadas as 10 colónias não fermentadoras de sorbitol. Cada uma destas colónias foi semeada em ágar nutritivo inclinado e incubadas a 35 C durante 24 horas para uma posterior caracterização bioquímica e pesquisa de genes de STEC. A partir do crescimento em ágar nutritivo foi preparado um pool com 10 colónias, que foram suspensas em 500 µl de água destilada estéril, submetidas à temperatura de 100 C durante 10 minutos e depois os tubos foram centrifugados à temperatura de 4 C durante 5 minutos a x g. Após a centrifugação, foram removidos 200 µl do sobrenadante (ADN molde) e colocados em tubos Eppendorf, sendo estes armazenados à temperatura de 20 C (Gioffre et al., 2002). O ADN molde foi utilizado nas reações de amplificação e caracterização dos genes em estudo, utilizando-se pares de oligonucleótidos iniciadores (primers). A análise de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), foi realizada utilizando-se uma técnica de PCR multiplex para a pesquisa dos genes: stx1, stx2 e eaea (Paton e Paton, 1998a). Na reação de amplificação foram utilizados 2 µl do ADN molde, 1 U 246

3 da enzima Taq polimerase, 2 mm de MgCl2, 200 µm de desoxinucleótido trifosfato (dntps), 10 mm de Tris-HCl, 50 mm de KCl (GibcoBRL Invitrogen/Brasil) e água MilliQ, para um volume final de 50 µl. Os primers utilizados na reação de amplificação estão descritos na Tabela 1 e as condições de amplificação foram modificadas do protocolo original (Paton e Paton, 1998a) e incluíram os seguintes ciclos de amplificação: 95 C durante 5 minutos para desnaturação inicial, seguidos de 30 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 C durante 1 min; annealing a 60 C durante 1 min 30 s e amplificação a 72 C durante 1 min. No final foi incluída uma etapa de amplificação adicional a 72 C durante 10 min. Como controlo positivo foi utilizada a estirpe de E. coli enterohemorrágica (EHEC) EDL933 positiva para os genes stx1, stx2 e eaea e como controlo negativo foi utilizada a estirpe de E. coli K12 DH5α. Os produtos da amplificação foram detectados mediante análise electroforética em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio. O gel foi examinado usando-se um transiluminador de luz ultravioleta para a visualização dos padrões de bandas referentes aos genes pesquisados e então fotografados. sorbitol (na forma de 140 pools) para a pesquisa de sequências homólogas às dos genes que codificam para as toxinas Shiga (stx1 e stx2) e para a adesina intimina (eaea) através de PCR, empregando simultaneamente todos os primers na mesma reação (PCR multiplex). Em 67 (67%) dos 100 pools formados por colónias lactose-positivas, foi possível observar amplificação para um ou mais dos genes que codificam para os factores de virulência de STEC pesquisados. Entre os 40 pools formados por colónias bacterianas não-fermentadoras de sorbitol, 26 (65,0%) também apresentavam esses genes (Tabela 2). Dos 140 pools submetidos a PCR, 93 (66,4%) apresentaram produtos de amplificação com migração eletroforética compatível com a dos fragmentos de amplificação dos genes stx1, stx2 e eaea, presentes na estirpe controlo positivo EHEC EDL933 (Figura 1). Resultados e discussão A Tabela 2 apresenta a frequência de positividade nos pools com estirpes bacterianas portadoras de genes de virulência de STEC isoladas de 100 amostras fecais de bovinos abatidos num matadouro de São Luís. Foram analisadas 1400 colónias bacterianas, sendo 1000 fermentadoras de lactose e 400 não fermentadoras de Figura 1 - Electroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio representativo dos perfis genotípicos de virulência obtidos através da PCR multiplex para os genes stx1, stx2 e eaea. Poço 1 = padrão de peso molecular de 100pb; 2 = EHEC EDL933 (controlo-positivo); 3 = E. coli K12 DH5α (controlo-negativo); poços de 4 a 9 = pools de bactérias dos animais 52, 79, 80, 88, 90 Tabela 1 - Oligonucleótidos usados para a PCR multiplex Primers Sequência (5 3 ) Produto amplificado(pb) stx1 F ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC 180 stx1 R AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC stx2 F stx2 R GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT G 255 eaea F GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC 384 eaea R CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG Fonte: Paton e Paton (1998a) Tabela 2 - Número de pools com estirpes bacterianas portadoras de genes de virulência de STEC isoladas de 100 amostras fecais de bovinos abatidos num matadouro de São Luís/MA, 2003 Fenótipo das colónias (N o ) * N o de pools analisados N o de pools com genótipo de virulência (%) Lactose-positivas (1000) (67,0) Sorbitol-negativas (400) (65,0) Total (1400) (66,4) * As colónias fermentadoras de lactose foram selecionadas a partir do agar MacConkey e as não-fermentadoras de sorbitol foram selecionadas a partir do agar MacConkey-Sorbitol suplementado com telurito de potássio e cefixima; Cada pool era constituído por 10 colónias bacterianas isoladas de cada animal e de cada meio de cultura, quando havia crescimento; Nº de pools com reações de PCR-positivas para os genes stx1, stx2 e eaea 247

4 Tabela 3 - Distribuição dos pools de estirpes potencialmente STEC nos bovinos de acordo com o município de origem Origem dos animais Nº de animais Nº de animais Nº de pools com STEC analisados colonizados por STEC (%) * Açailândia 12 7 (58,3) 9 Altamira do Maranhão 3 3 (100) 3 Bom Jardim 5 4 (80,0) 7 Bom Jesus das Selvas 6 5 (83,3) 5 Cidelândia 8 7 (87,5) 9 Grajaú 3 3 (100) 4 Igarapé Grande 7 5 (71,4) 7 Olho D água das Cunhas (82,6) 24 Santa Inês 11 9 (81,8) 12 Santa Luzia do Paruá 6 4 (66,7) 4 São Pedro D água Branca 11 3 (27,3) 4 Zé Doca 5 4 (80,0) 5 Total (73,0) 93 * Foram consideradas potencialmente STEC as estirpes que apresentavam os genes stx1 ou stx2 (ou ambos) na PCR multiplex A Tabela 3 apresenta a distribuição dos pools de estirpes potencialmente STEC nos bovinos de acordo com o município de origem. Dos 100 animais analisados, 73 (73,0%) eram portadores de estirpes bacterianas com características de STEC no tracto intestinal, sendo que a frequência de distribuição por município variou de 27,3% a 100%, com uma média de 76,6%. Os municípios com maior índice de animais (superior à média) colonizados por estirpes STEC foram: Altamira do Maranhão (100%), Grajaú (100%), Cidelândia (87,5%), Bom Jesus das Selvas (83,3%), Olho D água das Cunhãs (82,6%), Santa Inês (81,8%), Bom Jardim (80%) e Zé Doca (80%). Contudo, o município Olho D água das Cunhãs foi o que apresentou a maior quantidade de animais colonizados por estirpes STEC em números absolutos, 19 entre 23 bovinos analisados. Entre os 40 animais onde foi possível analisar dois pools de bactérias por animal, um formado por colónias lactose-positivas e outro por colónias sorbitol- -negativas, 20 apresentaram resultados positivos na PCR nos dois casos. Isto possibilitou a detecção de um total de 93 pools bacterianos positivos, em 73 bovinos (Tabela 3). A Tabela 4 apresenta a distribuição dos diferentes perfis de virulência detectados nas estirpes bacterianas isoladas de fezes de bovinos procedentes de diferentes municípios do Estado. Todos os municípios apresentaram animais colonizados por estirpes STEC que apresentavam no seu genoma o perfil de virulência stx1/stx2. A frequência desse genótipo variou de 60,0 a 88,9% em animais provenientes de Bom Jesus das Selvas e de Cidelândia, respectivamente. Em animais oriundos de 8 municípios, foram detectados 11 (11,8%) pools bacterianos com potencial para produzir apenas a toxina Stx1, pois apresentavam apenas o gene que a codificava, enquanto que 8 pools isolados em animais oriundos de 6 municípios tinham o potencial de produzir apenas a toxina Stx2. Os genótipos eaea, stx2/eaea e stx1/stx2/eaea estavam presentes em bactérias de apenas 4 municípios, distintos para cada caso. O genótipo stx1/eaea não foi detectado em nenhum dos pools analisados. Na região Sudeste do Brasil, no Rio de Janeiro, foi relatada uma taxa de detecção de 82% estirpes de STEC (Cerqueira et al., 1999). Em São Paulo, em algumas manadas a taxa de isolamento foi de até 84,6% (Irino et al., 2005). Quando se analisa a distribuição das estirpes potencialmente STEC nos municípios maranhenses, verifica-se que os animais de 8 municípios apresentaram valores de colonização idênticos, variando de 80% a 100%. Ao contrário, no município de São Pedro D'água Branca 27,3% dos animais estavam colonizados por estirpes STEC, o que está bem abaixo da média de 76,6% determinada. Entre manadas têm sido observadas diferenças na excreção fecal de estirpes STEC e muitos factores são apontados para explicar este fenómeno, incluindo: a idade do animal, alimentação, condições climáticas e maneio. Neste último factor, são citadas: a quantidade de animais por curral, maneio dos dejectos e o sistema de currais (Faith et al., 1996; Shere et al., 1998). Embora não tenham sido avaliadas in loco as condições de criação dos animais, uma vez que as amostras foram colhidas em São Luís, contudo, é provável que alguns desses factores de risco possam ter contribuído para as diferenças por nós observadas. A transmissão horizontal entre bovinos tem sido apontada com a principal via de disseminação de estirpes STEC entre manadas (Cobbold e Desmarchelier, 2002). Portanto, o confinamento pode ser um factor de risco importante e o seu controlo um ponto crítico a ter em consideração quando se pretende reduzir a prevalência da bactéria numa fazenda. A importância desse controlo está relacionada com as características relacionadas à patogênese das 248

5 Tabela 4 - Distribuição do número de pools de colónias potencialmente STEC com os diferentes de genótipos de virulência detectadas em fezes de bovinos procedentes de diferentes municípios do Estado do Maranhão/2003 Procedência Nº de pools com STEC Genótipo de virulência - Nº de pools de bactérias (%) stx1 stx2 stx1/stx2 stx2/eaea stx1/stx2/eaea eaea Açailândia 9 2 (22,2) 7 (77,8) Altamira do Maranhão (66,7) 1 (33,3) - - Bom Jardim 7 2 (28,6) - 5 (71,4) Bom Jesus das Selvas 5 1 (20,0) 1 (20,0) 3 (60,0) Cidelândia 9-1 (11,1) 8 (88,9) Grajaú (75,0) - 1 (25,0) - Igarapé Grande 7 2 (28,6) - 5 (71,4) Olho D água das Cunhãs 24 1 (4,2) 1 (4,2) 16 (66,6) 1 (4,2) 1 (4,2) 4 (16,6) Santa Inês 12 1 (8,4) - 9 (75,0) (16,6) Santa Luzia do Paruá 4 1 (25,0) 2 (50,0) 1 (25,0) São Pedro D água Branca 4-1 (25,0) 3 (75,0) Zé Doca 5 1 (20,0) 2 (40,0) 2 (40,0) TOTAL infecções por esse microorganismo: 1) a dose infectante baixa ( 10 2 UFC); 2) causa infecção aguda em humanos; 3) pode deixar sequelas a longo prazo, como a insuficiência renal e 4) nem sempre é clinicamente aparente nos animais portadores (Bell, 2002). De um modo geral, os resultados desta pesquisa indicam que as estirpes STEC estão amplamente difundidas no efectivo bovino do Estado, o qual parece representar um reservatório importante para o microrganismo. Isto está de acordo com as observações de alguns investigadores que sugerem que os bovinos podem ser os hospedeiros naturais de STEC mais adaptados à mesma (Beutin et al., 1993). Portanto, é por isso que a carne bovina e seus derivados são os mais frequentemente associados aos surtos de colite hemorrágica e de síndrome urémica hemolítica (Paton e Paton, 1998b). Tais infecções são descritas com frequência nos países industrializados do Hemisfério Norte, mas existem casos em alguns países do Hemisfério Sul, incluindo Argentina, Chile, Austrália e África do Sul (Nataro e Kaper, 1998). Com relação a essa associação entre os surtos de infecções por esse microrganismo e o consumo de carne de bovino contaminada, um facto interessante da epidemiologia das infecções por STEC é o que ocorre na Argentina e no Brasil onde, apesar da proximidade geográfica, a ocorrência de infecções humanas por STEC é muito diferente. Na Argentina, a síndrome urémica hemolítica é endémica, com aproximadamente 300 novos casos relatados anualmente (Rivas et al., 1998). No Brasil, pelo contrário, as infecções humanas estão restritas a casos esporádicos de diarreia não-sanguinolenta, principalmente em crianças (Irino et al., 2002; Franzolin et al., 2005). Contudo, um caso de síndrome urémica hemolítica associada à STEC do serótipo O26:H11 foi recentemente identificado (Guth et al., 2003). Apesar desta aparente baixa ocorrência de infecções há uma alta prevalência de estirpes de STEC em bovinos de algumas regiões do País (Cerqueira et al., 1999; Moreira et al., 2003; Irino et al., 2005), incluindo-se, a partir deste trabalho, os dados do Maranhão. Tabela 5 - Perfil genotípico de virulência dos 93 pools de estirpes STEC isoladas de 100 amostras de fezes de bovinos abatidos em São Luís/MA, 2003 Genótipos* Total (%) stx1 stx2 eaea (11,8) (8,6) (6,5) (68,8) (2,2) (2,2) * +, gene presente; -, gene ausente através de PCR multiplex Na análise dos diferentes genótipos de virulência, os 93 pools eram constituídos por bactérias que possuíam perfis de virulência distribuídos da seguinte forma: gene stx1, 11 (11,8%); gene stx2, 8 (8,6%); gene eaea, 6 (6,5%); stx1/stx2, 64 (68,8%); stx2/eaea, 2 (2,2%) e stx1/stx2/eaea, 2 (2,2%) (Tabela 5). Os dados epidemiológicos indicam que Stx2 é mais importante do que Stx1 no desenvolvimento da síndrome urémica hemolítica, principalmente se ela for produzida exclusivamente (Nataro e Kaper, 1998). Dos pools positivos para os genes pesquisados 8,6% das amostras eram do genótipo stx2 e 2,2% do genótipo stx2/eaea, ou seja, 10,8% seriam capazes de produzir apenas a toxina Stx2. Existem evidências de laboratório que demonstram que Stx2 é mais potente em induzir citotoxigenicidade do que Stx1. Contudo, Stx2 não representa uma classe homogénea de toxina, havendo diferenças de letalidade para ratos entre as variedades de Stx2 (Nataro e Kaper, 1998). O genótipo predominante das estirpes do Maranhão 249

6 foi stx1/stx2 (68,8%), seguido do stx1 (11,8%) e do stx2 (8,6%), sendo esses resultados similares aos observados em outros estudos (Beutin et al., 1993; Blanco et al., 1997). De acordo com alguns autores, as estirpes de STEC parecem ser patogénicas para o ser humano apenas quando possuem factores de virulência acessórios, particularmente o gene eaea, o qual se encontra presente na maioria das estirpes detectadas em infecções humanas (Gannon et al., 1993). Neste estudo observou-se apenas 4 (4,4%) dos 93 pools isolados da manada em associação com um gene stx (Tabela 5). Essa baixa frequência de amostras de STEC eaeapositivas é similar aos resultados de outros investigadores (Beutin et al., 1993; Blanco et al., 1997). Existem trabalhos que indicam que estirpes de STEC eaea-positivas estão mais associadas aos animais com quadro diarreico do que aos animais sadios (Blanco et al., 1997). Contudo, se o gene eaea fosse de fato um factor de virulência fundamental na patogenicidade de estirpes de STEC de origem humana então muitas estirpes de origem bovina não interfiririam com a saúde humana. Por outro lado, já existem estudos que demonstram que as estirpes eaea-negativas podem causar a HUS e a CH (Karmali, 2004; Tarr et al., 2005). Portanto, o papel da intimina, producto do gene eaea, não deve ser considerado como essencial para a virulência e a patogenicidade das estirpes de STEC eaea-negativas não pode ser excluída. Portanto, podemos concluir que a elevada taxa de isolamento de STEC indica que os bovinos são reservatórios importantes também em nosso Estado. Apesar do genótipo de virulência stx1/stx2 ter sido o predominante, outros perfis genéticos estão presentes em STEC do efectivo bovino do Maranhão o que pode representar um risco significante de aquisição da infecção caso as medidas de processamento adequado não sejam realizadas. Agradecimentos Agradecemos ao Professor João Andrade da Universidade Estadual do Rio de Janeiro pela doação da EHEC EDL933, às Professoras Rita Maria Seabra N. de C. Guerra da Universidade Estadual do Maranhão e Silma Regina P. Martins da Universidade Federal do Maranhão pela colaboração na execução deste trabalho. Bibliografia Baehler AA e Moxley RA (2002). Effect of culture conditions on Escherichia coli O157:H7-mediated attaching-effacing lesions in a bovine large intestinal mucosal explant model. FEMS Microbiology Letters, 212. Bell C (2002). Approach to the control of entero-haemorrhagic Escherichia coli (EHEC). International Journal of Food Microbiology, 78, Beutin L, Geier D, Steinruck H, Zimmermann S, Scheutz F (1993). Prevalence and some properties of verotoxin (Shiga-like toxin)-producing Escherichia coli in seven different species of healthy domestic animals. Journal of Clinical Microbiology, 31, Beutin L, Zimmermann S, Gleier K (1998). 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