FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA UNIR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL RENATA SANTOS RODRIGUES

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1 0 FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA UNIR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL RENATA SANTOS RODRIGUES CARACTERIZAÇÃO DAS CEPAS DE Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) TÍPICA E ATÍPICA ISOLADAS DE CRIANÇAS COM GASTROENTERITE AGUDA NA REGIÃO DE PORTO VELHO-RO PORTO VELHO-RO. 2013

2 1 RENATA SANTOS RODRIGUES CARACTERIZAÇÃO DAS CEPAS DE Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) TÍPICA E ATÍPICA ISOLADAS DE CRIANÇAS COM GASTROENTERITE AGUDA NA REGIÃO DE PORTO VELHO-RO Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Universidade Federal de Rondônia UNIR para defesa, a fim de obter o título de Mestre em Biologia Experimental. Área de concentração: Microbiologia Orientadora: Dra. Najla Benevides Matos Coorientadora: Dra. Tânia Aparecida Tardelli Gomes do Amaral Porto Velho RO

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4 3 FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA - UNIR PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL PGBIOEXP Candidata: Renata Santos Rodrigues Título da Dissertação: Caracterização das cepas de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) típica e atípica isoladas de crianças com gastroenterite aguda na região de Porto Velho-RO Orientadora: Dra. Najla Benevides Matos Coorientadora: Dra. Tânia Aparecida Tardelli Gomes do Amaral A comissão julgadora dos trabalhos de defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada em 30 de agosto de 2013, considera: (X) Aprovado (a) ( ) Reprovado (a) Examinador (a): Assinatura: Nome: Dra. Viviane Krominski Graça de Souza Instituição: Faculdade São Lucas - FSL Examinador (a): Assinatura: Nome: Dr. Roberto Nicolete Instituição: Fundação Oswaldo Cruz Rondônia FIOCRUZ/RO Presidente e Orientador(a): Assinatura: Nome: Dra. Najla Benevides Matos Instituição: Fundação Oswaldo Cruz Rondônia FIOCRUZ/RO

5 4 DEDICATÓRIA: Aos meus pais e familiares pelo apoio e incentivo prestado, a minha orientadora Dra. Najla Benevides Matos pela oportunidade concedida e pela ajuda prestada, ao Dr. Mauro Shugiro Tada pela autorização de realização de mais uma etapa em minha vida, e a Ângela Martins e Marlene Albuquerque pelo incentivo, dedico-lhes essa conquista com gratidão.

6 5 AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer primeiramente a DEUS, que está sempre comigo me auxiliando nos momentos mais difíceis, nos momentos em que pensei em desistir, foi ele quem me deu força para continuar nesta caminhada! Aos meus pais (Renato e Isaura) pela compreesão, apoio e incentivo prestado! A minha prima Stephany Feitosa e ao meu irmão Dérique pela ajuda! Um agradecimento especial para Marlene Albuquerque e Ângela Martins, que me incentivaram a fazer o mestrado, e me deram todo o apoio que eu precisei para concluir mais essa etapa em minha vida (muito obrigada!!). Ao Ronelson, pelo apoio, ajuda e compreensão. Ao Dr. Mauro Tada (Diretor Geral do CEPEM) que autorizou que eu fizesse o mestrado. A minha orientadora Najla Benevides Matos, agradeço pela oportunidade e confiança a mim concedida, pela ajuda prestada na realização da PCR, pela compreensão que sempre teve comigo, quando pensei em desistir e/ou trancar o mestrado e quando tudo o que eu estava fazendo estava dando errado! Najla, te agradeço por tudo!! A Rosimeire Dalla, pelo apoio e incentivo e por ter conseguido alguns dos artigos. Ao Elton Bill pelas fotos das células!! A Dra. Tânia Aparecida Tardelli Gomes do Amaral, pela colaboração prestada e pela coorientação. As meninas do Laboratório de Microbiologia (Érica, Grecy,Taíse, Sandra, Jaqueline, Alessandra, Fátima, Íris e Karina) quero agradecê-las pelo auxílio. Quero agradecer imensamente a Núcia Cristiane, por todas as vezes que me auxiliou nos experimentos, mesmo estando ocupada!! A Aldilene que me ajudou a realizar os testes de detecção de Betalactamases. Ao Altemárcio que ajudou nas extrações e nos Antibiogramas. Ao Esquerdo pela imensa ajuda no cultivo de células, nos testes de citoaderência e na leitura das lâminas. Ao pessoal da sala de lavagem (Dona Nair, Marilúcia e Odair) agradeço pela paciência, pelo preparo dos meios de cultura e dos materiais (Muito obrigado! Sem a ajuda de vocês esse trabalho não seria possível!). Ao Roger Lafontaine Mesquita Taborda, pelo auxílio nas análises estatísticas (muitíssimo obrigada Roger!!). Ao Luan Felipo Botelho Souza, pela ajuda nas PCRs e pelas sugestões em relação a dissertação! Ao Allison Carlos Assunção Silva, pela ajuda prestada e pelas sugestões na dissertação (Obrigada Allison mais uma vez! Você sempre me salvando nas horas que mais preciso!!). E... a todos do CEPEM que me sempre me ajudaram e que continuam me apoiando desde que comecei a trabalhar nessa instituição! A todos... Muito Obrigada!!!

7 6 Amo ao SENHOR, porque ele ouviu a minha voz e a minha súplica. Porque inclinou a mim os seus ouvidos, o invocarei enquanto viver... (Salmos 116:1-2)

8 7 RESUMO Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é considerada um importante agente causador de diarreia, principalmente nos países em desenvolvimento. Este patótipo de E. coli diarreiogênica é dividido em duas categorias tomando-se como base a presença de uma ilha de patogenicidade denominada Locus of Enterocyte Effacement (LEE) e do EPEC Adherence Factor (plasmídeo EAF) nas cepas de EPEC típica e ausência deste plasmídeo nas cepas de EPEC atípica. O objetivo deste estudo foi realizar a caracterização fenotípica e molecular das amostras de E. coli enteropatogênicas típicas e atípicas isoladas de crianças com gastroenterite aguda na região de Porto Velho Rondônia. Utilizamos neste estudo 15 amostras de EPEC típica e 102 de EPEC atípica isoladas de crianças de 0 a 6 anos de idade, admitidas no Hospital Infantil Cosme e Damião (HICD) com quadro clínico de gastroenterite aguda, no período de fevereiro de 2010 a fevereiro de Para a caracterização dos isolados realizamos testes de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA), testes fenotípicos e moleculares para a pesquisa dos genes bla TEM, bla SHV e bla CTX-M codificadores de betalactamases de espectro estendido (ESBL). Pesquisamos nos isolados tanto as propriedades de hemolisar hemácias, citoaderência, quanto a capacidade de formar biofilme. Neste estudo verificou-se uma elevada frequência de resistência aos antibióticos ampicilina (59,8%), trimetoprim-sulfametoxazol (57,7%) e tetraciclina (39,3%). Dezessete isolados (14,5%) foram considerados suspeitos para a produção da enzima betalactamase pelo teste fenotípico.vinte e oito (23,9%) apresentaram o gene codificador de ESBL do tipo bla TEM, 9 (7,7%) bla SHV e 23 (19,7%) bla CTX-M. Não houve relação estatística entre a presença destes genes com os isolados considerados suspeitos para produção de ESBL. Quanto aos testes de citoaderência, 14 isolados (12%) apresentaram uma adesão agregativa, 31 (26,5%) adesão localizada e 72 (61,5%) adesão localizada like. Nos ensaios de formação de biofilme, 16 isolados (13,68%) foram considerados fortemente aderentes e 15 (12,82%) fracamente aderentes. Quanto a atividade hemolítica verificou-se a presença de hemólise em 21 isolados (17,9%), sendo que 18 (15,5%) foram α-hemolíticos e 3 (2,6%) β-hemolíticos. Diante desses resultados, conclui-se que os isolados de EPEC analisados neste estudo apresentam diferentes padrões de citoaderência, ocorrendo a presença de cepas resistentes aos antibióticos, com capacidade de formação de biofilme e que apresentam atividade hemolítica. Este fato é preocupante visto que estes são considerados fatores de virulência adicionais que podem favorecer a persistência bacteriana e causar sérios danos ao hospedeiro. PALAVRAS CHAVE: Enteropatógenos, EPEC típica e atípica, gastroenterite aguda.

9 8 ABSTRACT Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is considered an important causative agent of diarrhea, especially in developing countries. This pathotype diarrheagenic E. coli is divided into two categories taking as basis the presence of a pathogenicity island called Locus of Enterocyte Effacement (LEE) and EPEC Adherence Factor (EAF plasmid) in typical EPEC strains and the absence of this plasmid in strains of atypical EPEC. The aim of this study was the phenotypic and molecular characterization of enteropathogenic E. coli isolated from typical and atypical children with acute gastroenteritis in the region of Porto Velho - Rondônia. Used in this study 15 samples of typical EPEC and 102 atypical EPEC isolated from children 0 to 6 years of age, admitted to the Hospital Infantil Cosme e Damião (HICD) with clinical symptoms of acute gastroenteritis in the period from February 2010 to February in For the characterization of the isolates we realize antimicrobial susceptibility tests (TSA), phenotypic and molecular tests for the detection of genes bla TEM, bla SHV and bla CTX-M encoding extended-spectrum beta-lactamases (ESBL). We researched in the isolates both the properties to hemolyze erythrocytes, cytoadherence, the ability to form biofilm. In this study there was a high frequency of resistance to ampicillin (59.8%), trimethoprimsulfamethoxazole (57.7%) and tetracycline (39.3%). Seventeen isolates (14.5%) were suspected to produce the enzyme beta-lactamase in the phenotypic test. Twenty eight (23.9%) presented the gene encoding ESBL of type bla TEM, 9 (7.7%) bla SHV and 23 (19.7%) bla CTX-M. There was no statistical relationship between the presence of these genes with isolates considered suspicious for ESBL production. As for cytoadherence tests, 14 isolates (12%) showed a aggregative adhesion, 31 (26.5%) localized adherence and 72 (61.5%) localizedlike adherence. In biofilm formation assays, 16 isolates (13.68%) were strongly adherent and 15 (12.82%) weakly adherent. As for hemolytic activity we verified the presence of hemolysis in 21 isolates (17.9%), and 18 (15.5%) were α-haemolytic and 3 (2.6%) β-hemolytic. Given these results, we concluded that EPEC isolates analyzed in this study have different patterns of cytoadherence, occurring the presence of antibiotic resistant strains, capable to form biofilm and presenting hemolytic activity. This is alarming since these are considered additional virulence factors that may contribute to bacterial persistence and cause serious harm to the host. KEYWORDS: Enteropathogens, typical and atypical EPEC, acute gastroenteritis.

10 9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Sítios de colonização de E. coli patogênica em humanos...17 Figura 2 Contribuição dos elementos genéticos móveis para evolução de E. coli patogênica...18 Figura 3 Representação esquemática do mecanismo de patogenicidade das seis categorias de Escherichia coli diarreiogênicas...19 Figura 4 Representação esquemática do Locus of Enterocyte Effacement (LEE) e do Plasmídeo EAF (EPEC Adherence Factor EAF)...21 Figura 5 Representação esquemática do Sistema de Secreção do Tipo III...23 Figura 6- Representação esquemática dos três estágios de patogênese de EPEC proposto por Donnemberg e Kaper (1992)...24 Figura 7- Estágio inicial da infecção por EPEC, conhecido como aderência localizada (AL)...25 Figura 8- Segundo estágio da infeção por EPEC e a interação entre intimina/tir...26 Figura 9- Microscopia eletrônica de transmissão demonstrando a Lesão A/E...27 Figura 10 Microscopia óptica de campo claro (1000X) das amostras de EPEC típica e atípica (A a F), dos controles positivos de EPEC típica (G e H), atípica (I e J) e EAEC O42 (K e L), e dos controles negativos (M a P), apresentando diferentes fenótipos de adesão em células HEp-2, após 3 horas e 6 horas de incubação...45 Figura 11 - Capacidade de formação de biofilme dos isolados de EPEC oriundos de crianças de 0 a 6 anos, com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO...47 Figura 12 Valores observados da densidade óptica dos isolados de EPEC (distribuídos em intervalo de classe), oriundos de crianças com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO, a um comprimento de onda de 640nm...47 Figura 13 Resultado do teste de formação de biofilme por espectrofotometria nos isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...48 Figura 14- Perfil de susceptibilidade aos antibióticos dos 117 isolados de EPEC oriundos de crianças de 0 a 6 anos com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO...50 Figura 15 Teste fenotípico para detecção de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) nos isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...52 Figura 16 Frequência de resistência dos isolados de EPEC típica e atípica oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...53

11 10 Figura 17 Teste confirmatório para a produção da enzima β-lactamase...55 Figura 18- Perfil de resistência dos isolados de EPEC suspeitos para a produção de ESBL oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...56 Figura 19- Presença de genes codificadores de ESBL do tipo bla TEM em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...58 Figura 20- Presença de genes codificadores de ESBL do tipo bla SHV em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...59 Figura 21- Presença de genes codificadores de ESBL do tipo bla CTX-M em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...59 Figura 22- Teste de atividade hemolítica em ágar sangue de carneiro 5% em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...62

12 11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Diâmetro do halo de inibição para cada classe de antibiótico testado, de acordo com as recomendações do CLSI (2012)...37 Tabela 2 Diâmetro dos halos de inibição aos antibióticos β-lactâmicos para detecção de ESBL...39 Tabela 3 Sequência de primers utilizados para amplificação de genes codificadores de β- lactamases do tipo bla TEM, bla SHV e bla CTX-M...40 Tabela 4- Perfil de adesão em células HEp-2 apresentado por cepas de Escherichia coli enteropatogênica típica e atípica, isoladas de crianças com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO...44 Tabela 5 Capacidade de formação de biofilme em isolados de Escherichia coli enteropatogênica oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...46 Tabela 6- Perfil de susceptibilidade aos antibióticos dos 117 isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO...51 Tabela 7 - Perfil de susceptibilidade aos antibióticos dos isolados de EPEC típica e atípica, oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...54 Tabela 8- Resultado do teste fenotípico para a detecção de betalactase de espectro estendido (ESBL) em cepas de EPEC oriundas de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO...55 Tabela 9 Frequência de genes codificadores de ESBL do tipo bla TEM e bla SHV nos isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO Tabela 10- Resultado do teste de hemólise dos isolados de EPEC oriundos de criança com gastroenterite em Porto Velho/RO...62

13 12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AA Aderência agregativa AD Aderência difusa aepec E. coli enteropatogênica atípica AL Aderência localizada ALL Aderência localizada like AMC - Amoxicilina + Ácido Clavulânico AMI - Amicacina AMP Ampicilina ATM - Aztreonama BFP- Bundle forming pili ClyA - Citolisina A CAZ - Ceftazidima CIP - Ciprofloxacina CLO Cloranfenicol CPD - Cefpodoxime CRO - Ceftriaxona CRX - Cefuroxima CTX - Cefotaxima DAEC - E. coli que adere difusamente DEC - E. coli diarreiogênicas DMEM - Meio Mínimo Essencial de Eagle modificado por Dulbeco EAEC - E. coli enteroagregativa EAF - EPEC Adherence Factor EIEC - E. coli enteroinvasiva EHEC - E. coli enterohemorrágica EhxA - Enterohemolisina EPEC - Escherichia coli enteropatogênica ESBL Betalactamase de espectro estendido Esps - EPEC secreted proteins ETEC - E. coli enterotoxigênica ExPEC - E. coli extraintestinal

14 13 FCA Fracamente aderente FMA Fortemente aderente GEN - Gentamicina HICD Hospital Infantil Cosme e Damião HlyA- Alfa hemolisina HlyE- Hemolisina E HUS - Síndrome hemolítica urêmica I Intermediário IPM - Imipenen LEE - Locus of Enterocyte Effacement NA Não aderente NMEC - E. coli causadora de meningite neonatal N-WASP - Neural Wiskott-Aldrich Syndrome Protein OMS Organização Mundial de Saúde PAIs - ilhas de patogenicidade PPT - Piperaciclina+Tazobactam R - Resisstente RDEC - E. coli diarreiogênica em coelhos S- Sensível SFB - Soro Fetal Bovino SRO - Sais de reidratação oral SUT - Trimetoprim - Sulfametoxazol tepec E. coli enteropatogênica típica TET Tetraciclina TSA Teste de sensibilidade aos antimicrobianos TTSS - Sistema de Secreção do tipo III UFCs Unidades formadoras de colônias UPEC - E. coli uropatogênica UTI - Infecções do trato urinário UV ultravioleta

15 14 SUMÁRIO INTRODUÇÃO A GASTROENTERITE AGUDA Escherichia coli DIARREIOGÊNICA (DEC) Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAIS E MÉTODOS POPULAÇÃO E AMOSTRA LOCAL DO ESTUDO ASPECTOS ÉTICOS CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA ENSAIO DE ADESÃO EM CÉLULA (CITOADERÊNCIA) DETECÇÃO DE BIOFILME POR ESPECTROFOTOMETRIA TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA) TESTE DE SENSIBILIDADE PARA DETECÇÃO DE BETALACTAMASE DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESBL) EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ELETROFORESE TESTE DE HEMÓLISE ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS E DISCUSSÃO FREQUÊNCIA DOS ISOLADOS DE EPEC TÍPICA E ATÍPICA PERFIL DE ADESÃO EM CÉLULAS HEp CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME POR ESPECTROFOTOMETRIA PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS DETECÇÃO FENOTÍPICA DE BETALACTAMASE DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESBL) DETECÇÃO MOLECULAR DE GENES CODIFICADORES DE ESBL TESTE DE ATIVIDADE HEMOLÍTICA NOS ISOLADOS DE EPEC...61 CONCLUSÃO...64 REFERÊNCIAS...65 ANEXO I TCLE...70 ANEXO II PARECER CONSUBSTANCIADO...73

16 15 INTRODUÇÃO A diarreia é considerada uma das principais causas de morbidade e mortalidade infantil, principalmente nos países em desenvolvimento, representando um grave problema de saúde pública. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a diarreia é a segunda principal causa de morte entre crianças abaixo dos cinco anos de idade, sendo responsável pela morte de aproximadamente crianças a cada ano, ocorrendo cerca de 1.7 bilhões de casos por ano. As manifestações clínicas dessa doença são variáveis em características e severidade, estando relacionada com o estado imunológico do indivíduo e com a natureza do agente etiológico (THEA & KEUSCH, 1993; WHO, 2013). Existem três tipos clínicos de diarreia:1) Diarreia aguda aquosa, que dura vários horas ou dias, sendo caracterizada pela perda de grande quantidade de água durante a evacuação, promovendo uma alteração na consistência das fezes e podendo estabelecer rapidamente um quadro de desidratação; 2) Diarreia aguda sanguinolenta, também chamada de disenteria é caracterizada pela presença de sangue nas fezes, podendo haver presença de muco e pus, sugerindo inflamação ou infecção do intestino; 3) Diarreia persistente, dura 14 dias ou mais (BRASIL, 2009; GRANADO-VILLAR et al., 2012). De maneira geral, a diarreia é considerada um sintoma de infecção do trato gastrointestinal, podendo ser causada por uma variedade de micro-organismos tais como vírus, bactérias, protozoários, helmintos, ou ainda por agentes de origem não patogênica como nos casos de intolerância a lactose e glúten, ingestão demasiada de alguns alimentos, sais mal absorvidos, dentre outros. Porém, os casos de diarreia de origem infecciosa são os de maior importância para saúde pública devido a sua maior frequência (BRASIL, 2009; AHS et al., 2010; GRANADO-VILLAR et al., 2012). 1.1 A GASTROENTERITE AGUDA A gastroenterite aguda é resultado da infecção do trato gastrointestinal por vários agentes patogênicos que alteram a função intestinal, sendo definida como uma inflamação da mucosa do trato gastrointestinal e caracterizada por manifestações clínicas que podem incluir diarreia, vômito, febre, anorexia e cólicas abdominais. É uma doença muito comum entre crianças e uma das principais causas de hospitalização com significante mortalidade nos países em desenvolvimento (CHOW et al., 2010; LIMA & DIAS, 2010; GRANADO- VILLAR et al., 2012).

17 16 A transmissão desses agentes patogênicos pode ocorrer por via oral ou fecal-oral, em que os agentes patogênicos são excretados a partir do trato gastrointestinal de uma pessoa ou animal portador da doença e são ingeridos por outro, podendo a transmissão ocorrer de forma indireta, através da ingestão de alimentos, água contaminada, ou por contato com objetos contaminados (como: utensílios de cozinha, acessórios de banheiro ou equipamentos hospitalares), de forma direta, de pessoa para pessoa (como resultado da falta de higiene) e de animais para pessoas (BRASIL, 2009; AHS et al., 2010; LIMA & DIAS, 2010). O diagnóstico pode ser realizado clinicamente através de uma anamnese, onde devem ser coletadas informações sobre a idade do paciente, peso anterior, número de dias de diarreia, número de dejeções nas últimas 24 horas, consistência e características das fezes (aquosas ou sanguinolentas), associação da diarreia a vômitos, dor abdominal, febre, quantidade de líquido ingerido, aleitamento materno, medicação efetuada, viagem nas últimas duas semanas, contato com outros casos e patologias pré-existentes, a fim de se obter a história clínica do paciente para uma orientação diagnóstica e terapêutica (BRASIL, 2009; LIMA & DIAS, 2010). Quanto ao tratamento da gastroenterite aguda, é realizado principalmente para a prevenção ou tratamento da desidratação, incluindo reidratação oral com uma solução préformulada (Sais de reidratação oral SRO) ou com fluidos que podem ser preparados e administrados em casa, o uso de suplemento de Zinco também é recomendado. Tratamentos farmacológicos tais como o uso de antieméticos e medicamentos antidiarreicos, geralmente, não são indicados pois podem causar complicações (devido aos efeitos colaterais). O uso de antibióticos normalmente não é indicado, sendo necessário apenas para os casos de gastroenterite bacteriana complicada (ELLIOTT, 2007; LIMA & DIAS, 2010). De maneira geral, os mesmos agentes patogênicos são os responsáveis por causar gastroenterite em todo mundo, sendo que a frequência de cada patógeno pode variar dependendo da localização geográfica ou da população estudada. Além disso, as infecções entéricas também podem diferir de acordo com a idade ou a dieta da população, entre um ambiente rural ou urbano, ambiente hospitar e a comunidade, e também quanto ao período ou estação em que o estudo está sendo realizado. Embora ocorram essas diferenças, determinados micro-organismos como o Rotavírus, Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e Vibrio cholerae são os patógenos que contribuem significativamente com a morbidade e mortalidade infantil a nível mundial (AHS et al., 2010; LIMA & DIAS, 2010).

18 17 Os vírus (rotavírus, norovírus, astrovírus, adenovírus e calicivírus) são os responsáveis por aproximadamente 70% dos episódios de gastroenterite aguda em crianças, sendo o rotavírus o principal agente etiológico causador dessa doença em todo mundo. As infecções bacterianas correspondem por 10 a 20% dos casos, sendo que as infecções por Escherichia coli (E. coli) são as que apresentam as maior frequência nos países em desenvolvimento. Os protozoários (Cryptosporidium, Giardia lamblia e Entamoeba histolytica) e os helmintos (Strongyloides stercoralis) apresentam uma prevalência menor que 10% (AHS et al., 2010; ELLIOTT, 2007; CHOW et al., 2010; GRANADO-VILLAR et al., 2012). Nos países em desenvolvimento os enteropatógenos bacterianos desempenham um importante papel nos casos de gastroenterite, e as cepas de Escherichia coli diarreiogênica (E. coli enteropatogênica, enterotoxigênica, enteroagregativa, enteroinvasiva e enterohemorrágica) são os principais patógenos (REVELAS, 2012). 1.2 Escherichia coli DIARREIOGÊNICA (DEC) A bactéria Escherichia coli é um bacilo gram negativo, anaeróbio facultativo, que apresenta cepas móveis ou imóveis. É um membro da família Enterobacteriaceae, gênero Escherichia, tendo sido descrita pela primeira vez por Theodore Escherich em 1885, que a denominou de Bacterium coli commune, indicando a ocorrência universal desta bactéria no intestino de indivíduos saudáveis (NATARO & KAPER, 1998; RODRIGUEZ-ANGELEZ, 2002; VIDAL et al., 2007). E. coli faz parte da microbiota de muitos animais e humanos, e tipicamente coloniza o trato gastrointestinal de humanos poucas horas após o nascimento. Estas cepas comensais raramente causam doença, e geralmente coexistem bem em indivíduos saudáveis, exceto em hospedeiros debilitados ou imunocomprometidos, ou quando as barreiras gastrointestinais são violadas (NATARO & KAPER, 1998; KAPER et al., 2004). Embora seja considerada um habitante natural da flora intestinal, algumas cepas de E. coli tem adquirido fatores de virulência específicos que lhes conferem a capacidade de se adaptar a novos nichos e se tornar um patógeno altamente adaptado capaz de causar um amplo espectro de doenças, desde gastroenterite, infecções extra-intestinais do trato urinário, corrente sanguínea e sistema nervoso central (Figura 1) (KAPER et al., 2004; CROXEN & FINLAY, 2010; TORRES, 2010).

19 18 Figura 1 Sítios de colonização de E. coli patogênica em humanos. E. coli patogênica coloniza vários locais no corpo humano. 1) E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC) e E. coli que adere difusamente (DAEC) colonizam o intestino delgado e causam diarreia. 2) E. coli enterohemorrágica (EHEC) e E. coli enteroinvasora (EIEC) causam doença no intestino grosso; E. coli enteroagregativa (EAEC) pode colonizar o intestino delgado e intestino grosso; 3) e 4) E. coli uropatogênica (UPEC) entra no trato urinário e viaja para bexiga para causar cistite, e se não tratada, pode ascender para os rins e causar pielonefrite. 5) Septicemia pode ocorrer com UPEC e E. coli causadora de meningite neonatal (NMEC). 6) NMEC pode atravessar a barreira sangue-cérebro e entrar no sistema nervoso, causando meningite. Fonte: (Adaptada de CROXEN & FINLAY, 2010, v.8, p.27, tradução nossa). Tem sido postulado que cepas comensais de E. coli podem ser o reservatório natural de tipos patogênicos, porque esse tipo comensal normalmente inofensivo necessita somente adquirir uma combinação de elementos genéticos móveis para se tornar um patógeno capaz de causar doenças. A perda e ganho de elementos genéticos móveis tem um papel essencial na formação do genoma de bactérias patogênicas pois os fatores de virulência de E. coli são codificados por vários elementos genéticos móveis, incluindo transposons, plasmídeos e bacteriófagos, além disso as cepas comensais também podem sofrer deleções, mutações de ponto ou outros rearranjos de DNA que podem contribuir para virulência. Essas adições, deleções ou outras mudanças genéticas podem dar origem as formas patogênicas de E. coli capazes de causar diarreia, disenteria, síndrome hemolítica urêmica (HUS), infecções do trato urinário (UTI) e meningite (Figura 2) (KAPER et al., 2004; CROXEN & FINLAY, 2010; TORRES, 2010).

20 19 Figura 2 Contribuição dos elementos genéticos móveis para evolução de E. coli patogênica. Os fatores de virulência podem ser codificados por vários elementos genéticos móveis, incluindo transposons (por exemplo, a enterotoxina termo-estável (ST) de ETEC), plasmídeos (por exemplo, a enterotoxina termo-lábil (LT) de ETEC e os fatores de invasão de EIEC), bacteriófago (por exemplo, a shiga-toxina de EHEC) e ilhas de patogenicidade (PAI) (por exemplo, o Locus of enterocyte efacement (LEE) de EPEC/EHEC e PAIs I e II de UPEC). E. coli comensal pode sofrer deleções, mutações de ponto, ou outros rearranjos no DNA que podem contribuir para virulência. Estas adições, deleções e outras mudanças genéticas pode dar origem a formas de E. coli patogênicas capazes de causar diarreia (EPEC, EHEC, EAEC e DAEC), desinteria (EIEC), Síndrome Hemolítica Urêmica (EHEC) e meningite (NMEC). Fonte: (Adaptada de KAPER et al., 2004, v.2, p.134, tradução nossa). Atualmente oito categorias patotípicas distintas de E. coli patogênicas tem sido descritas, as quais são classificadas em E. coli diarreiogênicas (DEC) ou E. coli extraintestinal (ExPEC). Dois patótipos são extraintestinais, a E. coli uropatogênica (UPEC) e a E. coli

21 20 causadora de meningite neonatal (NMEC), enquanto que as espécies de E. coli diarreiogênicas (DEC) são divididas em seis categorias, baseadas em seu mecanismo de patogenicidade e quadro clínico: E. coli enteropatogênica (EPEC), Enterohemorrágica (EHEC), Enterotoxigênica (ETEC), Enteroinvasiva (EIEC), Enteroagregativa (EAEC) e E. coli que adere difusamente (DAEC) (Figura 3) (KAPER et. al., 2004; VIDAL et al., 2007; CROXEN & FINLAY, 2010). Figura 3 Representação esquemática do mecanismo de patogenicidade das seis categorias de Escherichia coli diarreiogênicas. São reconhecidas seis categorias de E. coli diarreogênicas, cada uma tendo características únicas na interação com as células eucarióticas. a) EPEC se adere a enterócitos do intestino delgado, destrói a arquitetura normal da microvilosidade, induzindo a lesão característica Attaching and Effacement (Lesão A/E), além da formação de microcolônias compactas devido ao BFP (Bundle-forming pilus Fímbria do tipo IV); 1. Adesão inicial; 2. Translocação de proteínas pelo Sistema de secreção do tipo III; 3. Formação de pedestal; b) EHEC também induz uma Lesão A/E, mas não no cólon, sendo a característica distinguível de EHEC a produção de Shiga toxina (Stx); c) ETEC se adere ao enterócito do intestino delgado e induz diarreia aquosa pela secreção de enterotoxinas termo-estável (ST) e termo-lábil (LT); d) EAEC se adere ao intestino grosso e delgado em um biofilme espesso e produz enterotoxinas secretoras e citotoxinas; e) EIEC invade células epiteliais do cólon, lisa o fagossomo e se move através da célula pela nucleação de microfilamentos de actina. f) DAEC induz um efeito de transdução de sinal característico nos enterócitos do intestino delgado, que se manifesta como um crescimento de projecções celulares semelhante a dedos longos, que se envolvem em torno das bactérias. Fonte: (Adaptado de KAPER et al., 2004, v.2, p.124, tradução nossa).

22 21 Dentre as categorias de E. coli diarreiogênicas, EPEC é considerada uma das principais causas de diarreia em crianças menores de dois anos em países em desenvolvimento, tendo como característica principal uma lesão histopatológica conhecida como lesão A/E ( Attaching and Effacing ), que envolve um mecanismo de patogenicidade complexo cujo resultado é a diarreia (MÜLLER et al., 2007; VIDAL et al., 2007; CROXEN & FINLAY, 2010). Uma das principais características da infecção causada por EPEC é a diarreia do tipo aquoso (de diversos graus de intensidade), vômitos, febre e má absorção, sendo esta doença causada quando a bactéria alcança a mucosa intestinal e desencadeia um mecanismo de patogênese complexo que leva a destruição da microvilosidade do enterócito e a saída maciça de íons na luz intestinal (RODRIGUEZ-ANGELEZ, 2002; VIDAL et al., 2007; CLEMENTS et. al., 2012). 1.3 Escherichia coli ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) E. coli enteropatogênica (EPEC) foi o primeiro grupo de E. coli diarreiogênica que se identificou por testes sorológicos e que se associou com os casos de diarreia infantil, recebendo este nome a fim de se diferenciar este tipo virulento de E. coli das cepas comensais presentes na microbiota humana (TRABULSI et. al., 2002; VIDAL et al., 2007; WONG et al., 2011 ARENAS-HERNÁNDEZ et. al, 2012). EPEC é considerada a segunda causa mais comum de diarreia após rotavírus, tendo sido estimado a prevalência de EPEC em 8,8% na comunidade, 9,1% em ambientes hospitalares e 15,6% em ambientes ambulatoriais (ARENAS-HERNÁNDEZ et al., 2012). Nos países desenvolvidos houve um declínio na incidência de diarreia por EPEC e a ocorrência de surtos por essa bactéria são raros, entretanto, nos países em desenvolvimento, EPEC continua sendo uma importante agente causador de diarreia infantil com sua prevalência variando de 6 a 54% (CLEMENTS et al., 2012). Este patótipo pertence a uma família de patógenos que produzem uma lesão histopatológica na superfície apical dos enterócitos, conhecida como lesão A/E, que consiste na destruição da microvilosidade e aderência íntima entre a bactéria e a membrana da célula epitelial intestinal. Outros membros desta família incluem E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli diarreiogênica em coelhos (RDEC), Citrobacter rodentium e a recentemente identificada Escherichia albertii (formalmente conhecida como Hafnia alvei) (CROXEN & FINLAY, 2010; WONG, et. al.; 2011).

23 22 As cepas de EPEC são capazes de produzir esta lesão A/E devido a determinantes específicos de virulência codificados por um plasmídeo denominado EPEC Adherence Factor (EAF) e por uma ilha de patogenicidade cromossomal chamada de Locus of Enterocyte Effacement (LEE) (Figura 4) (NATARO & KAPER, 1998; DEAN et al., 2005; CROXEN & FINLAY, 2010; ARENAS-HERNÁNDEZ et. al., 2012). Figura 4 Representação esquemática do Locus of Enterocyte Effacement (LEE) e do Plasmídeo EAF (EPEC Adherence Factor) a) Representação da região LEE, que compreende 5 operons (LEE 1 a LEE 5) e 41 genes, cuja função de quase todos é conhecida, sendo estes genes agrupados de acordo com a sua função. b) Representação do Plasmídeo EAF, que compreende dois clusters de genes, um contendo 14 genes que coficam para a biogênese do BFP e outro contendo 3 genes (PerA, PerB e PerC) que estão envolvidos na regulação transcricional. c) Agrupamento funcional dos produtos de LEE, demonstrando uma elevada proporção de genes envolvidos na formação do Sistema de Secreção do tipo III (TTSS). Fonte: (Adaptado de DEAN et al., 2005, v.8, p.29, nossa tradução). A presença do plasmídeo EAF, confere a EPEC a capacidade de produzir um modelo de aderência característico em cultura de células, denominado de Aderência Localizada (AL). Neste modelo de aderência, a bactéria se liga em áreas localizadas da superfície da célula, ocorrendo a formação de microcolônias compactas ( Clusters de bactérias) após 3 horas de

24 23 incubação. Este fenótipo ocorre devido a presença de genes que codificam para uma fímbria do tipo IV chamada de Bundle-forming pilus (BFP), que promove a aderência entre as bactérias que formam as microcolônias e possivelmente a aderência entre as células epiteliais (TRABULSI et al., 2002; KAPER et. al., 2004; ARENAS-HERNÁNDEZ et. al., 2012). O plasmídeo EAF pode apresentar um tamanho de 50 a 70MDa, e contém um cluster de 14 genes responsáveis pela biogênese do BFP e também o locus Per (Plasmid enconded regulator) que contém 3 genes (PerA, PerB e PerC) que atuam como um ativador transcricional. O cluster de Per codifica proteínas que formam um complexo regulador, que atua ativando a transcrição de vários genes tanto no plasmídeo EAF quanto no cromossomo, atuando inclusive nos genes necessários para a patogênese de EPEC (Figura 4) (NATARO & KAPER, 1998; CLARKE et al., 2003; KAPER et al., 2004). A presença desse plasmídeo não é essencial para a formação da lesões A/E, embora a sua presença possa aumentar a eficiência na formação da desta lesão, provavelmente, através da influência do cluster de genes reguladores Per, que aumentam a expressão dos genes cromossomais contidos na região LEE (TRABULSI et al, 2002). A região LEE é uma ilha de patogenicidade que codifica várias proteínas que são agrupadas em 6 categorias principais, compreendendo reguladores transcricionais, proteínas do Sistema de Secreção do tipo III (TTSS), translocadores, chaperonas, proteínas secretadas e a intimina (adesina) (DEAN et al., 2005). Este conceito de ilhas de patogenicidade (PAIs) foi introduzido pela primeira vez por Hacker e colaboradores em 1990, ao verificar que essas regiões cromossômicas apresentavam características próprias e propriedades diferentes do restante do genoma bacteriano, sendo as PAIs definidas como seguimentos de DNA inseridos no cromossomo bacteriano, que atribuem uma variedade de características de virulência aos micro-organismos que as possuem (VIEIRA, 2009 apud HACKER et. al., 1990). A presença de LEE no cromossomo de EPEC é o principal fator responsável pela capacidade de induzir a lesão A/E. Do ponto de vista funcional, LEE pode ser dividido em cinco regiões (operons policistrônicos) designados LEE1 a LEE5, e estão separados em três domínios funcionais: uma região codificando o TTSS (LEE1, LEE2 e LEE3), uma região (LEE4) codificando as Esps (EPEC secreted proteins) e uma região codificando as proteínas envolvidas com a aderência íntima (LEE5), contendo os genes que codificam para a intimina (eae), Tir (tir) e sua chaperonina (cest) (Figura 4) (NATARO & KAPER, 1998; KAPER et. al., 2004; NOUGAYRÈDE et. al., 2003; CROXEN & FINLAY, 2010; WONG et al., 2011). O TTSS é um complexo de proteínas montado por muitos patógenos bacterianos gram negativos (incluindo EPEC) que é projetado para translocar proteínas através da parede

25 24 celular bacteriana dentro da célula eucariótica hospedeira. Quanto à sua estrutura, uma proteína translocadora secretada designada como EspA, forma uma extensão longa filamentosa, enquanto que outras duas proteínas translocadoras, EspB e EspD, formam um poro na membrana da célula hospedeira permitindo a translocação de proteínas efetoras no citoplasma da célula hospedeira (Figura 5) (DANIELL et al., 2003; PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006). Figura 5 Representação esquemática do Sistema de Secreção do Tipo III O sistema de secreção do tipo III é um complexo de proteínas (ou complexo agulha) montado e utilizado por Escherichia coli enteropatogênica para translocar proteínas efetoras no citoplasma da célula hospedeira. Fonte: ( Adaptado de PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006). Muitos estágios estão envolvidos na produção da lesão histopatológica A/E produzida por cepas de EPEC. Em 1992, Donnenberg e Kaper propuseram três estágios modelos para a patogênese de EPEC consistindo: 1- Aderência Localizada; 2- Transdução de sinal (ou adesão frouxa) e 3- Aderência íntima (Figura 6) (NATARO E KAPER, 1998; LU AND WALKER, 2001).

26 25 Figura 6 - Representação esquemática dos três estágios de patogênese de EPEC proposto por Donnemberg e Kaper (1992). 1) Aderência Localizada (mediada pelo BFP); 2) Transdução de sinal (montagem do TTSS e injeção de proteínas efetoras); 3) Aderência íntima (mediada pela interação entre a intimina e seu receptor tir), que promovem alterações no citoesqueleto e o estabelecimento da lesão A/E. Fonte: Adaptado de LU AND WALKER, No primeiro estágio de patogênese de EPEC, que envolve a aderência inicial entre a bactéria e o epitélio intestinal da célula hospedeira, conhecido como aderência localizada (localized adhesion), os sinais do ambiente intestinal tais como a temperatura de 37ºC, ph neutro, cálcio, e outros, estimulam a expressão do BFP (Bundle forming pili), que é uma fímbria do tipo IV de cerca de 4 a 7 nm de diâmetro, na superfície da bactéria. Após receber estes estímulos e começar a expressar o BFP, EPEC se adere ao enterócito via BFP e estabelece o contato inicial ou adesão localizada. Nesta etapa, EPEC forma microcolônias compactas na superfície das células devido ao BFP, que permite a ligação bactéria-bactéria (Figura 7) (NATARO & KAPER, 1998; CROXEN & FINLAY, 2010). No segundo estágio da infecção, conhecida como transdução de sinal, após a aderência inicial de EPEC ao enterócito, ocorre a montagem do TTSS, que forma um poro na membrana da célula hospedeira para que ocorra a injeção de várias proteínas secretadas (Esps) e a uma proteína bacteriana translocada denominada Tir, no citoplasma da célula hospedeira (Figura 5) (NATARO & KAPER, 1998; VALLANCE & FINLAY, 2000; PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006).

27 26 Figura 7 - Estágio inicial da infecção por EPEC, conhecido como aderência localizada (AL) Quando EPEC chega na luz intestinal (fase 1) por influência de condições locais, como a temperatura de 37 C e os íons Ca++, por exemplo, BFP é estimulado e expresso (fase 2), em seguida se adere aos enterócitos e a outras cepas de EPEC presentes no intestino (fase 3). Fonte: Adaptado de SILVA & SILVA, Quando Tir se integra na membrana plasmática da célula hospedeira, dimeriza e funciona como um receptor para a proteína de membrana externa intimina. A interação intimina/tir promove a fosforilação de Tir no resíduo de tirosina 474 por duas quinases do hospedeiro (Fyn e Abl), induzindo o recrutamento da proteína adaptadora Nck, que por sua vez recruta o N-WASP (Neural Wiskott-Aldrich Syndrome Protein) e o complexo Arp2/3 (actin-related protein 2/3), levando a polimerização de actina e a formação de uma estrutura conhecida como pedestal (Figura 8). A actina se liga a proteínas como α-actinin, talina e vinculina para estabilizar a estrutura do pedestal. EPEC também induz outras cascatas de sinalização com a célula hospedeira, incluindo o fluxo de inositol trifosfato (IP 3 ), ativação de proteína quinase C, fosfolipase-cγ e NF- k B (PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006; CROXEN & FINLAY, 2010; CLEMENTS et al., 2012) O terceiro e último estágio da patogênese de EPEC é caracterizado pela Lesão A/E, que tem como característica a aderência íntima da bactéria na superfície do enterócito, devido a destruição das microvilosidades intestinais e formação de uma estrutura semelhante a pedestal (Figura 9) (NATARO & KAPER, 1998; PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006; CROXEN & FINLAY, 2010; CLEMENTS et al., 2012).

28 27 Figura 8 - Segundo estágio da infecção por EPEC e a interação entre intimina/tir. EPEC via TTSS injeta várias proteínas efetoras e o receptor Tir no citoplasma da célula hospedeira. Tir é inserido na membrana plasmática do hospedeiro, dimeriza, e atua como um receptor para a proteína de membrana externa intimina. A interação intimina/tir promove a fosforilação de Tir por Fyn e Abl, induzindo o recrutamento da proteína adaptadora Nck, que por sua vez recruta o N-WASP e o complexo Arp2/3 (actin-related protein 2/3), levando a polimerização de actina e a formação de uma estrutura conhecida como pedestal. Fonte: (Adaptado de PIZARRO-CERDÁ & COSSART, 2006, tradução nossa). Todo este mecanismo complexo de patogenicidade apresentado por EPEC acarreta o desenvolvimento da doença diarréica pela dramática perda da atividade de absorção pela microvilosidade, fato ocasionado devido a lesão A/E causada pela bactéria, levando o estabelecimento da diarreia devido a má absorção dos nutrientes. Entretanto, vale ressaltar que o mecanismo de patogênese apresentado acima, refere-se a cepas de E. coli enteropatogênica típicas, que possuem o Plasmídeo EAF e a região LEE, fato que não se aplica as cepas de EPEC atípicas que não possuem o plasmídeo EAF, e consequentemente o BFP, apresentando somente a região LEE (NATARO & KAPER, 1998; AFSET et. al., 2003).

29 28 Figura 9 - Microscopia eletrônica de transmissão demonstrando a Lesão A/E (Attaching and Effacement) Lesão A/E caracterizada pela adesão íntima da bactéria a célula hospedeira, formando uma estrutura chamada de pedestal. Fonte: NOUGAYRÈDE et. al., Em 1995 Escherichia coli enteropatogênica foi dividida em dois grupos EPEC típica (tepec) e EPEC atípica (aepec) em um Simpósio Internacional em São Paulo, tendo sido definido que: EPEC são Escherichia coli diarreiogênicas que produzem uma lesão histopatológica característica conhecida como attaching and effacing (A/E) nas células intestinais e que não produzem Shiga, Shiga-like, ou verotoxinas. EPEC típica de origem humana possui um plasmídeo de virulência conhecido como EAF (EPEC adherence factor) que codifica aderência localizada em cultura de células epiteliais mediada pelo Bundle Forming Pilus (BFP), enquanto que EPEC atípica não possui esse plasmídeo. A maioria dos tipos de EPEC pertencem a certos sorotipos O:H bem reconhecidos como: O26;55, 86, 111, 114, 119, 125, 126, 127, 128, 142 e 158. Baseado nessa definição, as cepas de EPEC são consideradas típicas quando possuem a região LEE, que codifica para o TTSS, para intimina e as proteínas secretadas, e possuem o plasmídeo EAF, que codifica para o BFP, responsável pelo fenótipo de aderência localizada (AL), enquanto que as cepas atípicas se caracterizam apenas pela presença da região LEE (ilha de patogenicidade), não possuindo o plasmídeo EAF, e consequentemente a fímbria do tipo IV denominada de BFP (RODRIGUEZ-ANGELES, 2002; AFSET et. al., 2003). Tanto EPEC típica quanto atípica, possuem a capacidade de causar a diarreia, entretanto as cepas típicas produzem a adesão localizada (AL), com formação de microcolônias compactas em células HeLa/HEp-2 após 3 horas de incubação, e o crescimento destas microcolônias compactas é mediada pelo BFP, enquanto que as cepas atípicas são

30 29 incapazes de produzir LA e formam apenas microcolônias bacterianas soltas, que são detectados apenas depois de ensaios de adesão prolongados, ou seja, após 6 horas de incubação, formando o padrão de aderência localizada-like (ALL). Além destes padrões de aderência alguns tipos EPEC também podem apresentar o modelo de aderência difusa (DA) e de aderência agregativa (AA) (TRABULSI et al., 2002; HERNANDES et al., 2009; SCHMIDT, 2010). EPEC é um patógeno bacteriano muito versátil, podendo apresentar diversos fatores de virulência. Considerando seu repertório de genes de virulência, EPEC é um grupo muito heterogêneo, albergando genes que são encontrados em outros patótipos de E. coli diarreiogênica tais como os genes que codificam para hemolisinas e para a formação de biofilme (MAGALHÃES et al., 2011). As hemolisinas são toxinas que atuam sobre a membrana dos eritrócitos e de diversos tipos celulares. Este grupo de toxinas, ao contrário de outras, não são internalizadas pelas células alvo, mas agem ativamente sobre as membranas celulares, causando distúrbios em sua estrutura e função, manifestadas sob a forma de lise e morte celular. As hemolisinas não atuam somente sobre os eritrócitos, mas causam também dano a fibroblastos, plaquetas, monócitos, granulócitos e células endoteliais e do miocárdio. Tal grupo de toxinas é reconhecido como um dos principais fatores de virulência envolvido na patogênese bacteriana (MAGALHÃES et al., 2011). Várias hemolisinas tem sido identificadas entre diferentes patógenos, em E. coli três tipos tem sido identificadas, alfa hemolisina (HlyA), enterohemolisina (EhxA) e hemolisina E ou citolisina A (HlyE ou ClyA), dentre elas a alfa hemolisina é mais estudada e é produzida principalmente por ExPEC, ETEC, E. coli produtora de Shiga toxina e EPEC (MURASE et al., 2012). A capacidade de formação de biofilme é um outro fator de virulência e um mecanismo de resistência natural da bactéria, tendo sido demonstrada em vários patógenos, principalmente os associados a infecções crônicas. O termo biofilme refere-se a capacidade da bactéria se aderir tanto a superfície abiótica quanto biótica, sendo definido como uma comunidade microbiana associada a superfície, e rodeada por uma matriz de substância polimérica extracelular. Esta matriz exopolissacarídica formada no biofilme torna os microorganismos mais resistentes a ação de agentes químicos e físicos, impedindo a penetração de agentes antimicrobianos, dificultando a destruição das bactérias no biofilme e favorecendo a persistência bacteriana em casos de infecção (MACEDO, 2000; NORMARK & NORMARK, 2002; HALL-STOODLEY & STOODLELY, 2009; KASNOWSKI, et. al, 2010).

31 30 Em EPEC a capacidade de formação de biofilme já tem sido demonstrada, e acreditase que a formação de microcolônias é o estágio inicial para o desenvolvimento do biofilme, estando envolvida no processo várias adesinas incluindo o BFP e o EspA (MOREIRA et al., 2006). Além dos mecanismos diretamente relacionados à virulência, a resistência aos antimicrobianos tem sido considerada um fator extremamente importante a ser analisado, pois nas populações de E. coli verifica-se a ocorrência de resistência a múltiplos antibióticos. Dentre os mecanismos de resistência, as betalactamases de espectro estendido (ESBL) estão entre os determinantes de resistência mais importante em Enterobacteriaceae (REGUA- MANGIA, et al., 2009; MNIF et al., 2013). As betalactamases são enzimas capazes de hidrolisar o anel betalactâmico de penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos, tornando-os inativos, sendo este mecanismo de resistência mediado por plasmídeos. Estes plasmídeos também são portadores de genes de resistência a outros antibióticos, incluindo: aminoglicosídeos, cloranfenicol, sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclina, sendo assim, as bactérias que possuem esse plasmídeo são multirresistentes (GUPTA et al., 2003; JÚNIOR et al., 2004; DALMARCO et al., 2006; RIVA et al., 2008). As cepas de Klebsiella spp e Escherichia coli são as bactérias mais comuns produtoras de ESBLs, porém a presença desta enzima já foi detectada em outras espécies de enterobactérias. As ESBLs normalmente são codificadas pelos genes do tipo bla TEM (Temoniera) e bla SHV (Sulfidril Variável), entretanto nos últimos anos houve o aparecimento de outras ESBLs, como por exemplo as pertencentes a família bla CTX-M, bla PER, bla VEB, bla GES, bla TLA e bla BES ( JÚNIOR et al., 2004; DALMARCO et al., 2006). Em estudos anteriores realizados no laboratório de microbiologia do CEPEM, tais como o realizado por ORLANDI et al., (2006) e o realizado entre fevereiro de 2010 a 2012 (Dados não publicados), sobre a etiologia das infecções diarreicas, observou-se que E. coli diarreiogênica foi o segundo grupo de patógeno mais frequentemente isolado, sendo EPEC o patótipo mais prevalente. Em virtude disso e dada a importância de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) como agente causador da diarreia, decidiu-se fazer este estudo a fim de caracterizar estes isolados visto que EPEC pode apresentar outros fatores virulência como a capacidade de formação de biofilme, atividade hemolítica e a produção de betalactamase de espectro extendido (ESBL).

32 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Realizar a caracterização fenotípica e molecular das amostras de Escherichia coli enteropatogênicas típicas e atípicas isoladas de crianças com gastroenterite aguda na região de Porto Velho Rondônia. 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar o perfil molecular e celular das amostras de Escherichia coli enteropatogênicas isoladas. Determinar os diferentes padrões de citoaderência (AL, AD, AA e ALL) dos isolados de EPEC. Detectar a capacidade de formação de biofilme nas cepas de Escherichia coli enteropatogênica. Caracterizar e determinar o padrão de resistência aos antibióticos de EPEC por meio de testes fenotípicos e moleculares; Avaliar a atividade hemolítica dos isolados;

33 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 POPULAÇÃO E AMOSTRA O presente estudo foi realizado utilizando-se um total de 117 isolados de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) típica e atípica que estavam armazenados no Laboratório de Microbiologia do CEPEM. Tais amostras são provenientes da coleta de material fecal para realização do projeto intitulado: Caracterização etiológica e molecular dos vírus associados à gastroenterite em crianças de 0 a 6 anos de idade na região de Porto Velho-RO. Todas as amostras de EPEC são provenientes da coleta realizada para o estudo supracitado, onde foram coletados 593 amostras fecais de crianças de 0 a 6 anos de idade, admitidas no Hospital Infantil Cosme e Damião (HICD) com quadro clínico de gastroenterite aguda, no período de fevereiro de 2010 a fevereiro de Destas amostras fecais, um total de isolados foram identificados por testes bioquímicos como pertencentes a Eschechia coli, e submetidos a técnica de PCR multiplex para detecção de genes virulência que os caracterizavam como pertencente a alguma categoria de E. coli diarreiogênica, tendo sido identificado 233 isolados (14,3%) de E. coli diarreiogênica, destes 117 eram pertencentes a EPEC (50,2%), 109 (46%) EAEC, 5 (2,1%) ETEC e 2 (0,85%) EHEC (Dados não publicados). 3.2 LOCAL DO ESTUDO O estudo foi realizado no Hospital Infantil Cosme e Damião (HICD), principal centro de atendimento médico infantil do Estado de Rondônia, sendo uma das Unidades de Saúde pertencente à Secretaria de Estado da Saúde (SESAU/RO), e foi realizado mediante coleta de material fecal de crianças que aceitaram participar da pesquisa mediante autorização de seu responsável legal no Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), constante no ANEXO I, conforme estabelecido na Resolução CNS 196/96. O Hospital Cosme e Damião atualmente encontra-se localizado na Rua Benedito de Souza, nº 4045, Bairro Industrial, porém no período do estudo encontrava-se localizado na Rua Rafael Vaz e Silva, nº 3041, Bairro Liberdade.

34 ASPECTOS ÉTICOS O presente estudo utilizou amostras biológicas armazenadas, que foram coletadas para realização do projeto citado anteriormente e que foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas envolvendo seres humanos do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEP/CEPEM), sob o número de protocolo 0113/2010, parecer nº 19/2010. Por se tratar de pesquisa que utilizou material biológico de origem humana armazenado, e com a finalidade de cumprir o estabelecido pela Resolução CNS 196/96 e suas complementares, em especial a Resolução CNS 441/2011, que dispõe sobre o armazenamento de material biológico humano ou uso de material armazenado em pesquisas anteriores, este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisas envolvendo Seres Humanos do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEP/CEPEM) como uma nova pesquisa, sendo solicitado ao CEP a insenção da aplicação de um novo Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Vale salientar que conforme a Resolução CNS 441/2011, os projetos de pesquisas que pretendem utilizar amostras armazenadas em biobanco ou biorrepositório podem solicitar a isenção de aplicação de um TCLE específico para a nova pesquisa, quando fundamentada a impossibilidade de obtenção do consentimento, cabendo ao CEP autorizar ou não a utilização do material biológico humano armazenado. Sendo assim, este estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas envolvendo Seres Humanos do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEP/CEPEM), sob nº do CAAE: e Parecer consubstanciado nº (ANEXO II). 3.4 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA Todas as 117 amostras identificadas como EPEC típica ou atípica que estavam armazenadas no laboratório de microbiologia do CEPEM foram semeadas em placa contendo Ágar MacConkey (MC) para isolamento das colônias de Escherichia coli, e em seguida foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC por um período de 16 a 24 horas. Tal procedimento foi realizado para se verificar as características morfológicas das colônias, tais como o aspecto da colônia, a coloração (rosa ou incolor) e o odor, e também para se verificar se as amostras estavam puras (sem a presença de algum agente contaminante ou outra espécie de bactéria). Nos casos de dúvida em relação a morfologia das colônias, foram realizados testes bioquímicos de fermentação da lactose e glicose, produção de gás e ácido sulfídrico (Kingler

35 34 Hajna), uréia, indol, lisina, arginina, ornitina, manitol (mobilidade) e citrato, para identificação do agente bacteriano. 3.5 ENSAIO DE ADESÃO EM CÉLULA (CITOADERÊNCIA) Após essa etapa de caracterização fenotípica inicial, os isolados de EPEC típica e atípica foram submetidos a testes de adesão em células HEp-2, originárias de carcinoma de laringe humana, de acordo com a técnica descrita por Cravioto et al., (1979) com adaptações, a fim de se obter o perfil de aderência de cada isolado (AL, ALL, AD e AA). Para realização dos ensaios de citoaderência, células HEp-2 foram previamente cultivadas em garrafas de plástico para cultura celular de 25 cm 2, contendo 3 ml de Meio Mínimo Essencial de Eagle modificado por Dulbeco (DMEM), acrescido de 10% Soro Fetal Bovino (SFB) e Gentamicina (1:1000). Em seguida, os frascos de cultura celular foram incubados em estufa de CO 2 (SANYO CO 2 INCUBATOR), a uma temperatura de 37ºC e atmosfera de 5% de CO 2, por cerca de três a quatro dias. Após esse período, as células foram cultivadas em placas de cultura de células de fundo chato de 24 poços contendo lamínulas circulares de vidro (espessura 0,13-0,16mm VIDROBRAS) que foram previamente adicionados aos poços. Para realização do cultivo celular nas placas de 24 poços, os frascos de plásticos contendo as células HEp-2 foram retirados da estufa de CO 2 e o meio de cultivo foi removido. Logo após, a monocamada celular foi lavada com 1ml de meio incompleto (DMEM) e em seguida removido. Posteriormente, foram adicionados 500µl de tripsina EDTA para o desprendimento celular e logo após foi realizada a incubação em estufa de CO 2 por um período de 5 a 10 minutos. Após incubação, as células foram retiradas da garrafa e colocadas em um tubo falcon (15 ml) juntamente com 5 ml de meio incompleto, para posterior centrifugação a uma rotação de a rpm por um período de 5 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e 5 ml de meio completo (DMEM + SFB 10%) foram adicionados ao pellet e homogeneizado com o auxílio de um vortex. Após essa etapa, cerca de 10µl desta suspensão foram retirados e colocados em câmera de Neubauer para contagem das células em microscópio óptico de campo claro, tal procedimento foi necessário para se obter uma suspensão contendo 10 5 ( ) células por ml em uma quantidade apropriada de meio completo.

36 35 Em seguida, alíquotas de 1ml dessa ressuspensão celular foram distribuídas nos poços contendo as lamínulas, e as placas foram incubados em estufa de CO 2 a 37º C, sob atmosfera de 5% de CO 2, por 48 horas. Após um período 24 horas de incubação das células, as amostras de EPEC e os controles foram semeados em 4 ml de Caldo LB e incubados a 37ºC em estufa bacteriológica por um período de 18 a 24 horas, para sua posterior utilização no teste de adesão em célula. Como controle positivo do teste de adesão, foram utilizados uma cepa padrão de EPEC típica (E2348/69), uma de EPEC atípica (2103) e uma de EAEC O42, e para controle negativo foi utilizado uma bactéria não aderente DH10B (Escherichia coli K-12), além de ter sido reservado uma lamínula contendo células HEp-2 sem bactérias. Para realização do teste de citoaderência, as placas de 24 poços contendo as células HEp-2 que estavam incubadas em estufa de CO 2, foram inicialmente retiradas da estufa, e em seguida o meio de cultivo foi retirado de cada orifício da placa, e três lavagens com PBS foram realizadas. Posteriormente, 1ml de DMEM acrescido de 2% de SFB e 2% de D-manose foram adicionados em cada poço. Após essa etapa, 40µl de caldo LB, contendo as bactérias de interesse no estudo, foram acrescentados nos orifícios e logo em seguida as placas foram incubadas em estufa de CO 2 durante um período de 3 horas e 6 horas (OBS: Sempre que o teste de citoaderência foi realizado, duas placas de 24 poços foram incubadas simultaneamente, sendo uma para o ensaio de 3 horas e outra para o ensaio de 6 horas, visto que as cepas de EPEC típica apresentam um perfil de aderência localizada em 3 horas de incubação e as cepas de EPEC atípica apresentam um padrão de aderência localizada like em 6 horas). Após o período de incubação de 3 e 6 horas, o meio de cultivo foi removido e a monocamada celular foi lavada por cinco vezes com PBS, a fim de se retirar as bactérias que não se aderiram às células em cultivo. Em seguida, as células foram fixadas com uma solução fixadora contendo àcido pícrico 1,22%, formaldeído 40% e ácido acético glacial por um período de 10 minutos. Posteriormente, as células foram coradas com soluções INSTANT PROV II e III do Kit de coloração Panótico Rápido (INSTANT PROV NEWPROV) por um minuto. Decorrido esse tempo, os poços submetidos a coloração foram lavados com água de torneira (de três a cinco vezes, para retirada do excesso de corante) e as lamínulas foram retiradas dos orifícios das placas e deixadas a temperatura ambiente para secagem. Após isso, as lamínulas foram

37 36 coladas em lâminas de ponta fosca com um esmalte incolor e visualizadas ao microscópio óptico de campo claro, com os aumentos de 400 e 1000 vezes. Para interpretação dos resultados observados nas lâminas, foram considerados os seguintes padrões de adesão: AL, caracterizada pela formação de microcolônias de bactérias aderidas a sítios localizados da célula; AD, com bactérias aderidas ao acaso, por toda a superfície celular; AA, quando as bactérias se aderem sobre a célula e nos espaços intercelulares, lembrando a disposição de tijolos empilhados ( stacked bricks ); ALL, quando as bactérias formam apenas microcolônias bacterianas soltas, que são detectados apenas depois de ensaios de adesão prolongados, ou seja, após 6 horas de incubação. 3.6 DETECÇÃO DE BIOFILME POR ESPECTROFOTOMETRIA Além da realização de testes de adesão em células HEp-2, as cepas de EPEC também foram testadas quanto a capacidade de formação de biofilme. Para isso, as amostras e o controle positivo (EAEC O42) foram previamente cultivados em 4 ml de caldo LB e incubados em estufa bacteriológica a 35ºC durante o período de 18 a 24 horas. Após esse período de incubação, as amostras foram retiradas da estufa e uma alíquota contendo cerca de 75µl do caldo LB com a bactéria foi retirada e diluída em solução salina (soro fisiológico) para obtenção de uma escala de turbidez equivalente a 0,5 Mac Farland (LABORCLIN), a qual corresponde a aproximadamente 1,5x10 8 unidades formadoras de colônias (UFCs). Posteriormente, 1µl desta solução na escala de 0,5 Mac Farland, foi retirado e colocado em 1,5 ml de caldo LB estéril, com a finalidade de obter uma concentração aproximada de UFC/ml. Em seguida, 200 µl desta solução foi distribuída nos poços de uma microplaca de 96 poços (fundo reto), em triplicata para cada amostra, inclusive para o controle positivo (EAEC O42) e para o controle negativo (ao qual foi utilizado o caldo LB sem a bactéria). Também foi feito o espelho da microplaca, a fim de se obter a informação correta quanto a localização das amostras. Posteriormente, a microplaca foi incubada em estufa bacteriológica a 35ºC por um período de 18 a 24 horas. Após o período de incubação, a microplaca foi retirada da estufa e o conteúdo de cada poço foi retirado e lavado 4 vezes com 200 µl de PBS (OBS: após cada lavagem, a microplaca foi levada ao agitador Kline por um período de 1 a 2 minutos). Posteriormente, a microplaca foi incubada em estufa bacteriológica a 60ºC por 1 hora para secagem. Logo após esse

38 37 período de incubação, a microplaca foi retirada da estufa e as amostras foram coradas com 200 µl de cristal violeta 5% por um período de 1 minuto. Em seguida, a microplaca foi lavada 4 vezes com 200 µl de água de torneira, e levada ao agitador Kline por um período de 1 a 2 minutos após cada lavagem. Na última lavagem todo conteúdo do orifício da microplaca foi retirado e 200 µl de SDS a 1% foi adicionado em cada poço por um período de 15 minutos. Após isso, foi realizada a leitura da microplaca em espectrofotômetro a um comprimento de onda de 640 nm. A intensidade de cor azul/violeta nos poços da microplaca indica aderência bacteriana. Baseando-se na intensidade da cor e nos valores obtidos no espectrofotômetro as amostras foram agrupadas em 3 categorias: Não aderente (NA), quando o valor da densidade óptica (DO) foi menor ou igual a 0,120 nm, Fracamente aderente (FCA), quando o valor da D.O foi entre 0,121 e 240 nm, ou Fortemente aderente (FMA), quando o valor da D.O foi maior ou igual a 0,241 nm. 3.7 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA) As amostras também foram submetidas ao teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA), pelo método de difusão em disco de Kirby & Bauer, conforme recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012), a fim de se detectar e estabelecer fenotipicamente o perfil de sensibilidade bacteriana in vitro, frente aos agentes antimicrobianos. Antes da realização do teste de sensibilidade, placas contendo o Àgar Muller-Hinton foram preparadas com uma espessura de aproximadamente 4 mm, o que corresponde a 25 ml do meio para placas de 90x15mm. As placas devem conter a espessura média de 4 mm não podendo ser inferior a 3 mm ou superior a 5 mm para não ter resultados falsos. Para realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos as amostras foram previamente cultivadas em 4 ml de caldo LB e levadas para estufa bacteriológica a uma temperatura de 37ºC durante um período de 16 a 24 horas. No dia seguinte, as amostras foram retiradas da estufa e cerca de 75 µl do caldo LB contendo a bactéria foi adicionado a uma solução fisiológica estéril (NaCl 0,85%) até se obter uma turvação compatível com o grau 0,5 (½) na escala Mac Farland. Posteriormente, um swab estéril foi embebido nesta suspensão bacteriana, sendo comprimido contra a parede do tubo para se retirar o excesso, e em seguida semeado em placa contendo Ágar Muller Hinton de forma a abranger toda a superfície da placa.

39 38 Após um período de 15 minutos, os discos impregnados com antibióticos foram colocados sobre a superfície do meio com o auxílio de uma pinça flambada e resfriada, exercendo-se uma leve pressão com a ponta da pinça para uma boa adesão dos discos. Em seguida, as placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC por horas. Posteriormente, as placas foram retiradas da estufa e com o auxílio de uma régua, o diâmetro dos halos inibitórios de cada disco de antibiótico foi medido e anotado para posterior consulta na tabela recomendada pelo CLSI, a fim de se determinar se a bactéria em análise é Sensível (S), Intermediário (I) ou Resistente (R) aos antibióticos testados (Tabela 1). Tabela 1 Diâmetro do halo de inibição para cada classe de antibiótico testado, de acordo com as recomendações do CLSI (2012). CLASSE ANTIBIÓTICO S I R Cefens Cefuroxima (30µg) Cefens Ceftazidima (30µg) Carbapenêmicos Imipenem (10µg) Combinações β-lactâmico com inibidor de β-lactamase Combinações β-lactâmico com inibidor de β-lactamase Inibidores de folato Piperaciclina - Tazobactam (100/10µg) Amoxicilina - Ácido clavulânico (20/10µg) Trimetoprimsulfametoxazol Aminoglicosídeos Gentamicina (10µg) Aminoglicosídeos Amicacina (30µg) Tetraciclinas Tetraciclina (30µg) Penicilinas Ampicilina (10µg) Fenicóis Cloranfenicol (30µg) Fluroquinolonas Ciprofloxacina (5µg) Doze discos impregnados com antibióticos foram utilizados para realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos: Cefuroxima (CRX), Gentamicina (GEN), Imipenen (IPM), Piperaciclina+Tazobactam (PPT), Tetraciclina (TET), Trimetoprim - Sulfametoxazol (SUT),

40 39 Amoxicilina + Ácido Clavulânico (AMC), Amicacina (AMI), Ampicilina (AMP), Cloranfenicol (CLO), Ciprofloxacina (CIP) e Ceftazidima (CAZ). 3.8 TESTE DE SENSIBILIDADE PARA DETECÇÃO DE BETALACTAMASE DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESBL) Para detecção fenotípica de β-lactamase de espectro estendido (ESBL), utilizou-se o método de disco difusão em ágar (ou método de aproximação de disco) juntamente com o método de duplo disco (ou disco combinado), segundo o recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012). Para realização de tal procedimento foram utilizados os seguintes antibióticos: Amoxicilina + ácido clavulânico (AMC) de 30μg, Cefpodoxime (CPD) de 10μg, Cefotaxima (CTX) de 30μg, Aztreonama (ATM) de 30μg, Ceftriaxona (CRO) de 30μg e Ceftazidima (CAZ) de 30μg, a uma distância de 20 a 30 mm de centro a centro, em relação ao disco central. Como controle positivo utilizou-se uma cepa padrão de Klebsiella pneumoniae ATCC produtora de ESBL. Para realização do teste utilizou-se um disco de amoxicilina + ácido clavulânico no centro de uma placa contendo ágar Muller Hinton (4 mm) previamente inoculada, pelo método de alagamento, com as cepas utilizadas no estudo, ajustadas a uma escala de Turbidez de 0,5 Mac Farland (1,5 x 10 8 UFC/mL), e ao redor deste disco central utilizou-se os demais antimicrobianos citados anteriormente, a uma de distância de 20 a 30 mm. Posteriormente as amostras foram incubadas em uma estufa bacteriológica por um período de 18 a 24 horas a uma temperatura de 37ºC. Após esse período de incubação, realizou-se a leitura do diâmetro dos halos, sendo anotado os valores do diâmetro de cada halo, e realizou-se a verificação de formação ou não de uma terceira zona, denominada de zona fantasma ( Ghost Zone ) entre qualquer um dos antimicrobianos testados em relação ao disco central contendo ácido clavulânico. Neste teste, a formação de uma zona fantasma é positiva para produção de ESBL (teste confirmatório) e a presença de um halo menor que os valores apresentados na tabela 2 é indicativo da produção de beta-lactamases de espectro estendido.

41 40 Tabela 2 Diâmetro dos halos de inibição aos antibióticos β-lactâmicos para detecção de ESBL. Agente antimicrobiano Cefotaxima (CTX) Aztreonama (ATM) Cefpodoxima (CPD) Ceftriaxona (CRO) Ceftazidima (CAZ) Halo de difusão do disco (mm) 27 mm 27 mm 17 mm 25 mm 22 mm * A presença de um halo menor que os valores apresentados é indicativo da produção de ESBL; * Os valores apresentados na tabela são derivados do CLSI EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO Os isolados de EPEC típica e atípica foram submetidos a extração de DNA genômico pelo método Fenol/Clorofórmio, e armarzenados a -20ºC para posterior utilização na pesquisa de genes de resistência aos antibióticos β-lactâmicos do tipo bla TEM, bla SHV e bla CTX-M. Para realização da extração de DNA genômico, as bactérias foram previamente cultivadas em 4 ml de caldo LB e incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC por um período de 16 a 24 horas. Após esse período, as amostras foram retiradas da estufa e 1,5 ml de caldo LB contendo as bactérias de interesse foram coletados e transferidos para microtubos de 1,5 ml do tipo Eppendorf para posterior centrifugação a RPM durante 10 minutos. Após a centrifugação, as amostras foram retiradas da centrífuga e o pellet formado foi ressuspendido em 300μl de tampão TEN (Tris 0,05M; EDTA 0,05M; NaCl 0,10M), seguido da adição de 30μl de lisozima (20mg/ml) e incubação a temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, foram adicionados 50μl de Triton X-100 a 10% e 20μl de NaCl 3M. Após isso, os microtubos contendo as amostras foram aquecidos a 60ºC em banho seco, por 5 minutos e deixados a temperatura ambiente até resfriar. Logo após essa etapa, foram adicionados 3μl de RNAse (10mg/ml) e os microtubos foram incubados em estufa bacteriológica a 37ºC por 30 minutos. Posteriormente, as amostras foram retiradas da estufa e foram adicionados 50μl de SDS 10% e 3μl de proteinase K (10mg/ml), seguida de uma nova incubação a 37ºC por 30 minutos. Logo após, foram adicionados 400μl de fenol, seguido de agitação por 5 min (sem auxílio de vortex) e centrifugação a RPM durante 10 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi recuperado e transferido para um novo microtubo do tipo Eppendorf.

42 41 Após a troca de microtubo, foram adicionados 400μl de clorofórmio, seguido de agitação por 5 min (sem auxílio de vortex) e centrifugação a RPM durante 10 minutos. Posteriormente o sobrenadante foi recuperado e foi realizado novamente a troca de microtubo, sendo adicionado 40μl de NaCl 3M e vagarosamente 1ml de etanol 100%. Em seguida, os microtubos contendo as amostras foram centrifugados por 10 minutos a RPM e o sobrenadante foi descartado. O sedimento contido no microtubo foi ressuspendido em 1ml de etanol 70% e uma nova centrifugação a RPM por 10 minutos foi realizada. Logo após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi levado ao fluxo laminar para secagem. Posteriormente, o sedimento foi ressuspendido em 200μl de tampão TE (Tris- EDTA) e estocado a -20ºC REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) Além do teste fenotípico de detecção de ESBL foram realizados testes moleculares, através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), a fim de se verificar a presença de genes de resistência codificadores de beta-lactamases de espectro estendido do tipo bla TEM, bla SHV e bla CTX-M para cada isolado, conforme sequência dos primers apresentadas na tabela 3. Tabela 3 Sequência de primers utilizados para amplificação de genes codificadores de β- lactamases do tipo bla TEM, bla SHV e bla CTX-M. Primer bla TEM-MR bla TEM-MF bla SHV-A bla SHV-B bla CTX-MR bla CTX-MF Sequência do primer 5 - ATAAAATTCTTGAAGACGAAA GACAGTTACCAATGCTTAATCA AAAGATCCACTATCGCCAGCAG ATTCAGTTCCGTTTCCCAGCGG TTTTTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA-3 5 -CGATATCGTTGGTGGTGCCATA-3 Produto esperado Referência 1080 pb Schmitt et al., pb Nasehi et al., pb Edelstein et al., Para os genes bla TEM e bla SHV as reações foram realizadas para um volume final de 10µl, contendo 0,5U de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 1x Buffer (10mM Tris-HCl ph 8,4, 50mM Kcl), 1,5mM MgCl2 (Cloreto de magnésio), 200µM de Desoxirribonucleotídeos trifosfatados (DNTP), 2 µm de cada Primer, 1µl de DNA da bactéria de interesse na pesquisa e água MiliQ autoclavada (2,8µl).

43 42 Para o gene bla CTX-M a reação de PCR foi realizada para um volume final de 10µl, contendo 1U Taq DNA polimerase (Invitrogen), 1x Buffer (10mM Tris-HCl ph 8,4, 50mM Kcl), 2mM MgCl 2, 200µM de DNTP, 0,5µM de cada primer, 1µl de DNA de EPEC e água MiliQ autoclavada (6,2µl). As condições de amplicação para cada gene codificador de ESBL foram realizadas em um aparelho termociclador da Applied Biosystems sob as seguintes condições: bla CTX-M foi submetido a uma desnaturação inicial por 2 min a 94ºC, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 20 seg, anelamento a 54ºC por 30 seg, e extensão a 72ºC por 30 seg, e uma extensão final a 72ºC por 3 min. Para o gene bla SHV, uma etapa de desnaturação inicial a 94ºC por 2 min foi realizada, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 seg, anelamento a 70ºC por 1 min, e extensão a 72ºC por 1min, uma outra etapa de extensão final foi realizada a 72ºC por 5 min. Para o gene bla TEM, foi realizada uma desnaturação inicial a 94ºC por 2 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 min, anelamento 60ºC, e extensão a 72ºC por 1 min, finalizando com uma extensão final de 72ºC por 3 min. Uma cepa padrão de Klebsiella pneumoniae ATCC foi usada como controle positivo para o gene bla SHV, por possuir somente este gene codificador de ESBL, e uma outra cepa de Klebsiella pneumoniae CCBH 4955 foi utilizada como controle positivo para os genes bla CTX-M e bla TEM, por possuir os dois genes. Como controle negativo foi utilizado uma bactéria DB11 (Cepa padrão de Serratia marcescens, que não possui genes codificadores de ESBL) ELETROFORESE Para visualização dos produtos de PCR, as amostras foram submetidas à eletroforese (MiniRun GE-100) em gel de agarose 1% (para os genes bla TEM, bla CTX-M, e bla SHV ), contendo o tampão de corrida TBE (Tris Borato com EDTA) a uma concentração de 0,5x, e coradas com GelRed x (diluição de 1:500). Posteriormente, as amostras foram visualizadas em Luz Ultravioleta (UV) com o auxílio do transiluminador e fotoducumentadas por este mesmo aparelho TESTE DE HEMÓLISE O teste de hemólise também foi realizado a fim de se verificar a capacidade de atividade hemolítica nas cepas de EPEC. Tal procedimento foi realizado em uma placa

44 43 contendo ágar sangue base (Blood Agar Base), suplementado com 5% de sangue de carneiro e solução de CaCl 2 (Cloreto de Cálcio), a fim de se evidenciar a formação de um halo ao redor das colônias. O preparo das placas de ágar sangue deu-se da seguinte forma: um volume apropriado de sangue de carneiro desfibrinado foi submetido à centrifugação a rpm por 10 minutos, posteriormente iniciou-se a lavagem das hemácias, em que o sobrenadante foi desprezado e as hemácias foram suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) equivalente ao volume inicial do sangue. Após duas lavagens adicionais, as hemácias foram suspensas em PBS e acrescidas ao meio base resfriado a 45-50ºC, esterilizado por autoclavação, na concentração final de 5%, e solução de CaCl 2, na concentração final de 10 mm. Para semeio das bactérias em ágar sangue, as amostras foram previamente cultivadas em 4 ml de caldo LB a 37ºC por um período de horas, para isso utilizou-se colônia isolada em ágar MacConkey a fim de se verificar se as amostras estavam puras. Após incubação, as amostras que estavam em caldo LB foram semeadas em placas de ágar sangue (dividas em 3 partes), com o auxílio de uma alça de platina estéril e resfriada. Em seguida, as amostras foram incubadas a 37ºC durante horas, após esse período as placas foram examinadas quanto à presença de um halo de hemólise ao redor da colônia em 3 e 24 horas de incubação. A presença de um halo de coloração transparente em torno do crescimento bacteriano indica lise total dos eritrócitos, sendo denominado de Beta-hemólise. A presença de halo esverdeado ao redor das colônias semeadas (lise parcial dos eritrócitos), indica Alfa-hemólise, enquanto que a ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros, sem hemólise) é Gama-hemólise ANÁLISE ESTATÍSTICA As análises estatísticas aplicadas no presente estudo foram realizadas utilizando testes não paramétricos, através do programa GRAPHPAD PRISM 6.0 como o Teste Exato de Fisher e o Odds Ratio. A significância estatística foi definida como p<0,05.

45 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 FREQUÊNCIA DOS ISOLADOS DE EPEC TÍPICA E ATÍPICA Neste estudo foram utilizados 117 isolados de Escherichia coli enteropatogênica, destes 15 (12,8%) eram pertencentes a EPEC típica (tepec) e 102 (87,2%) a EPEC atípica (aepec). A maior frequência de isolados de aepec observada condiz com a literatura, pois alguns estudos epidemiológicos tem sugerido um aumento na identificação deste patógeno. No estudo de revisão realizado por Hernandes e colaboradores em 2009, verificou-se que houve um aumento na identificação de aepec tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento, sendo apresentado uma prevalência de EPEC atípica de 10,5% na Alemanha, México 7,6%, Espanha (Lugo) 5,2%, Iran 9,3%, São Paulo 5,4%, Salvador 10%, Espírito Santo 5,5%, Rondônia 4,0%, dentre outros (HERNANDES et al., 2009 apud KOZUB-WITKOWSKI et al., 2008; PANIAGUA et al., 2007; BLANCO et al., 2006; ALIKHANI et al., 2006; ARAÚJO et al., 2007; SPANO et al., 2008; Orlandi et al., 2006). Em Rondônia, no estudo realizado por Orlandi et al., (2006) sobre a etiologia das infecções diarreicas em crianças abaixo de 72 meses no Hospital Infantil Cosme e Damião, em Porto Velho/RO, aepec apresentou-se mais prevalente que tepec, com frequência de 4,0% para aepec e 2,1% para tepec, demonstrando que no período deste estudo as cepas de aepec já estavam emergindo como um importante enteropatógeno associado aos casos de diarreia. 4.2 PERFIL DE ADESÃO EM CÉLULAS HEp-2 Quanto ao perfil de adesão em células HEp-2 apresentados pelas cepas de EPEC, pode-se observar que 14 isolados (12%) apresentaram um fenótipo de adesão agregativa (AA), 31 (26,5%) adesão localizada (AL) e 72 (61,7%) adesão localizada like (ALL) (Tabela 4, figura 10). O maior número de isolados apresentando um padrão ALL é esperado visto que a maioria das amostras utilizadas neste estudo são pertencentes a aepec, que é caracterizado por este modelo de aderência (NATARO & KAPER, 1998; TRABULSI et al., 2002). Nos isolados de tepec verificou-se que além da aderência localizada apresentada por 8 isolados (53,3%), e que é uma característica deste patótipo, outros perfis de adesão foram observados tais como o fenótipo ALL observado em 6 (40%) amostras e o agregativo por 1 isolado (6,7%) (Tabela 4). Embora isso tenha ocorrido, ao se relacionar tepec com o tipo de

46 45 aderência esperado (AL), verificou-se que houve relação entre este tipo de EPEC e o perfil de adesão apresentado (valor de p=0,0239, significante). Este resultado já era esperado visto que as cepas de tepec são mais homogêneas em suas características de virulência quando comparadas com as atípicas, e em ensaios de adesão de célula são capazes de produzir aderência localizada em células HeLa ou HEp-2 após 3 horas de incubação, com formação de microcolônias compactas devido a presença do BFP (Figura 10) (TRABULSI et al., 2002; HERNANDES et al., 2006; MORA, et al., 2009). Tabela 4- Perfil de adesão em células HEp-2 apresentado por cepas de Escherichia coli enteropatogênica típica e atípica, isoladas de crianças com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO. EPEC Resultado do teste de adesão em células HEp-2 Adesão Agregativa Adesão localizada Adesão localizada like Típica (n=15) 1 (6,7%) 8 (53,3%) 6 (40%) Atípica (n=102) 13 (12,7%) 23 (22,5%) 66 (64,7%) Total (n=117) 14 (12%) 31 (26,5%) 72 (61,5%) Em aepec, 66 amostras (64,7%) apresentaram um fenótipo ALL, 13 (12,7%) AA e 23 (22,5%) AL. Nestes isolados, ao relacionar este tipo de EPEC com o fenótipo ALL, característico deste patótipo, verificou-se que não houve relação estatística (valor de p= , não significativo). Isso pode ser explicado devido a heterogeneidade de características de virulência apresentadas por aepec, que pode apresentar vários modelos de aderência (difusa, agregativa e localizada) (TRABULSI et al., 2002; HERNANDES et al., 2009). Neste estudo verificou-se que 22,5% de aepec apresentaram um fenótipo AL, sendo concordante com o o estudo realizado por Hernandes et al., (2006), em que nove amostras de aepec que foram caracterizadas e confirmadas quanto a capacidade de aderir a células HeLa formando microcolônias compactas semelhantes às formadas por tepec. Quanto as amostras que apresentaram um fenótipo AA, presume-se que alguma adesina agregativa esteja envolvida neste processo, sendo necessário outros estudos a fim de caracterizar a adesina envolvida.

47 46 Figura 10 Microscopia óptica de campo claro (1000X) das amostras de EPEC típica e atípica (A a F), dos controles positivos de EPEC típica (G e H), atípica (I e J) e EAEC O42 (K e L), e dos controles negativos (M a P), apresentando diferentes fenótipos de adesão em células HEp-2, após 3 horas e 6 horas de incubação. Em A) e B) é apresentado um fenótipo de aderência localizada (AL), em microscopia óptica, de uma amostra de EPEC típica (521) após 3 horas (A) e 6 horas de incubação (B). Em C) e D) uma amostra de EPEC atípica (909) apresentando um fenótipo de aderência agregativa (AA) em 3 e 6 horas respectivamente; Em E) e F) de uma amostra de EPEC atípica (842) apresentando uma aderência localizada like em 3 (E) e 6 horas (F), seguido da microscopia óptica dos controles positivos de EPEC típica (E2348/69) em 3 (G) e 6 horas (H) apresentando um fenótipo AL, EPEC atípica (2103) em I) e

48 47 J) apresentando um perfil ALL, e EAEC O42 (K e L) apresentando um padrão AA. Em M) e N) foi apresentado a microscopia óptica das células HEp-2 como um dos controle negativos, em 3 (M) e 6 horas (N) de incubação, bem como a bactéria DH10B que também foi utilizada como controle negativo (O e P). Um total de 8 isolados (6,8%) de aepec apresentaram a capacidade de invadir células HEp-2 nos ensaios de adesão, fato de extrema importância pois as cepas de EPEC são consideradas um patógeno extracelular e normalmente não apresentam esta capacidade. Além disso, deve ser considerado que a invasão pode contribuir para permanência da bactéria no intestino, resultando em diarreia persistente, pois um micro-organismo com capacidade invasora pode se proteger da destruição pelo sistema imune e de alguns antibióticos que não são capazes de penetrar nas células eucarióticas. Neste estudo verifica-se também a necessidade de realização do teste de invasão para confirmar se os isolados de EPEC realmente apresentam essa habilidade, pois alguns estudos tem demonstrado que EPEC é capaz de invadir células, mas o papel patogênico desta invasão ainda é desconhecido (HERNANDES et al., 2009). 4.3 CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME POR ESPECTROFOTOMETRIA Quanto a capacidade de formação de biofilme dos isolados de EPEC, verificou-se que 16 (13,7%) apresentaram um fenótipo fortemente aderente (FMA), 15 (12,8%) fracamente aderente (FCA) e 86 (73,5%) foram não aderentes (NA) (Tabela 5 e Figura 11). Na figura 12 é apresentado um gráfico contendo os valores da absorbância observados nos isados de EPEC e na figura 13 é apresentado o resultado do teste de formação de biofilme por espectrofotometria. Tabela 5 Capacidade de formação de biofilme em isolados de Escherichia coli enteropatogênica oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. Resultado do biofilme EPEC Não aderente Fortemente aderente Fracamente aderente Típica (n=15) 11 (73,4%) 2 (13,3%) 2 (13,3%) Atípica (n=102) 75 (73,5%) 14 (13,7%) 13 (12,7%) Total (n=117) 86 (73,5%) 16 (13,7%) 15 (12,8%)

49 48 Figura 11 Capacidade de formação de biofilme dos isolados de EPEC oriundos de crianças de 0 a 6 anos, com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO. Figura 12- Valores observados da densidade óptica dos isolados de EPEC (distribuídos em intervalo de classe), oriundos de crianças com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO, a um comprimento de onda de 640nm.

50 49 Nas cepas de tepec, 11 isolados (73,4%) foram considerados NA, 2 (13,3%) FMA e 2 (13,3%) FCA. Para aepec, 75 (73,5%) foram NA, 14 (13,7%) FMA e 13 (12,7%) FCA. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a frequência dos isolados formadores de biofilme e os não aderentes nas duas categorias de EPEC (p=1) (Tabela 5). Neste estudo pode-se observar que alguns isolados apresentaram a capacidade de formação de biofilme (26,5%), inclusive com um fenótipo fortemente aderente, fato que é preocupante, uma vez que a formação de biofilme é um fator de virulência adicional e um mecanismo de resistência natural da bactéria, tornando esses micro-organismos mais resistentes a ação de agentes químicos e físicos, e estando relacionado também com a persistência bacteriana em casos de infecção, pois a matriz exopolissacarídica formada no biofilme impede a penetração de agentes antimicrobianos dificultando a destruição das bactérias no biofilme (MACEDO, 2000; NORMARK & NORMARK, 2002; HALL- STOODLEY & STOODLELY, 2009; KASNOWSKI, et. al, 2010). Figura 13- Resultado do teste de formação de biofilme por espectrofotometria nos isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. Para cada isolado o teste foi realizado em triplicata. Como controle positivo foi utilizado uma cepa de EAEC O42 e como controle negativo utilizou-se o caldo LB sem bactéria, seguindo-se os mesmos procedimentos das demais amostras. Nesta imagem observa-se a presença de 4 amostras fortemente aderentes-fma (1304, 1489, 1188 e 422) e 3 fracamente aderentes-fca (1264, 1265 e 1269). As amostras que apresentam uma coloração transparente ou com coloração de roxo quase transparente são não aderentes. A capacidade de formação de biofilme verificada neste estudo também tem sido demonstrada por vários outros tipos de patógenos, sendo considerado uma importante

51 50 estratégia de sobrevivência microbiana, pois o desenvolvimento do biofilme permite que a bactéria sobreviva em ambientes hostis e colonize novos nichos por vários mecanismos de dispersão. Segundo Barnhart & Chapman (2006), bactérias entéricas tais como Escherichia coli e Salmonella spp. expressam fibras proteicas chamadas de curli (envolvidas no contato da bactéria a superfície e no contato célula-célula) desempenham papel importante no desenvolvimento do biofilme durante os estágios iniciais, porém muitas estruturas expressas na superfície bacteriana, incluindo curli, flagelos, pili e exopolissacarídeos atuam nas várias etapas do desenvolvimento de biofilme. No estudo realizado por Moreira et al., (2006) sobre a formação de biofilme por EPEC foi proposto que o Bundle forming pilus (BFP) e o EspA (adesinas que desempenham papel importante na formação de microcolônias compactas durante a patogênese de EPEC) estão envolvidos na formação de biofilme em superfícies abióticas, porém o mecanismo pelo qual EPEC forma biofilme e as adesinas envolvidas no processo ainda permanece desconhecido. 4.4 PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS Quanto ao perfil de susceptibilidade aos 12 antimicrobianos testados, os antibióticos ampicilina (AMP), trimetoprim-sulfametoxazol (SUT) e tetraciclina (TET) foram os que apresentaram uma maior frequência de resistência, em que 70 isolados (59,8%) apresentaram resistência a ampicilina, 64 (54,7%) ao trimetoprim-sulfametoxazol e 46 (39,3%) a tetraciclina (Figura 14 e Tabela 6). Os resultados apresentados estão concordantes com a literatura, pois segundo Arenas- Hernández et. al, (2012) a resistência mais comum apresentada por cepas de EPEC são a ampicilina, tetraciclina, estreptomicina e as sulfonamidas. Além disso, segundo Vila & Pal (2010) a porcentagem de resistência apresentada por EPEC é similar ao descrito para outras E. coli diarreiogênicas, com um nível de resistência a ampicilina, tetraciclina e trimetoprimsulfametoxazol acima de 23%. Em outros estudos, como o realizado por Mosquito et al., (2012) sobre o mecanismo molecular de resistência aos antibióticos em Escherichia coli diarreiogênicas isoladas de crianças, observou-se uma elevada frequência de resistência a ampicilina (83%), trimetoprimsulfametoxazol (78%) e tetraciclina (55%) entre os isolados. No trabalho desenvolvido por Moura et al., (2012) sobre a frequência de Escherichia coli e a sensibilidade aos antimicrobianos em menores de cinco anos hospitalizados por diarreia aguda, foi observado um alto nível de resistência a ampicilina (88,9%) e ao trimetoprim-sulfametoxazol (44,4%).

52 51 Figura 14 Perfil de susceptibilidade aos antibióticos dos 117 isolados de EPEC oriundos de crianças de 0 a 6 anos com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO. *S= Sensível; *I= Intermediário; *R=Resistente; Em relação ao perfil de sensibilidade dos isolados de EPEC, observou-se uma elevada taxa de sensibilidade a ceftazidima (CAZ), ciprofloxacina (CIP), amicacina (AMI), cloranfenicol (CLO) e piperaciclina + tazobactam (PPT), com frequência de 94,9% (111/117) para ceftazidima, 93,2% (109/117) para ciprofloxacina, 89,7% (105/117) amicacina, 87,2% (102/117) cloranfenicol e 87,2% (102/117) para piperaciclina + tazobactam. Alguns isolados apresentaram o resultado de intermediário, porém de modo geral a frequência foi baixa, entretanto o antibiótico cefuroxima (CRX) apresentou uma frequência elevada com 92 isolados (78,6%) (Figura 14 e Tabela 6). A sensibilidade aos antibióticos ceftazidima, piperaciclina + tazobactam e imipenem condiz com estudo de Arenas-Hernández et al., (2012), em que segundo estes autores, os antibióticos recomendados para o tratamendo de diarreia por EPEC são: ceftazidima, ceftriaxoma, imipenem ou piperaciclina+tazobactam, aos quais a resistência não tem sido reportada. Quanto ao antibiótico cefuroxima, embora o perfil de resistência tenha apresentado uma baixa frequência (3,4%), houve um número elevado de isolados apresentando um

53 52 fenótipo de intermediário, fato que é preocupante visto que nessa categoria os antimicrobianos apresentam aplicabilidade clínica apenas em alguns sítios do organismo (onde ficam concentrados) ou quando uma dosagem maior que a normal pode ser utilizada, sendo que este resultado pode ser considerado como resistência em virtude do agente antimicrobiano poder apresentar uma eficácia terapêutica reduzida nesses casos. Tabela 6- Perfil de susceptibilidade aos antibióticos dos 117 isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite aguda em Porto Velho/RO. ANTIBIÓTICOS RESULTADOS (n=117) S % I % R % Cefuroxima (CRX) 21 17, ,6 4 3,4 Gentamicina (GEN) 96 82,1 9 7, ,3 Imipenem (IPM) 94 80, ,7 7 6 Piperaciclina + Tazobactam (PPT) , ,3 3 2,6 Tetraciclina (TET) 71 60, ,3 Trimetoprim- sulfametoxazol (SUT) 53 45, ,7 Amoxicilina + Ácido Clavulânico (AMC) 79 67, , Amicacina (AMI) ,7 8 6,8 4 3,4 Ampicilina (AMP) 47 40, ,8 Cloranfenicol (CLO) ,2 3 2, ,3 Ciprofloxacina (CIP) ,2 6 5,1 2 1,7 Ceftazidima (CAZ) ,9 6 5,1 0 0 *S= Sensível; *I= Intermediário; *R=Resistente; *%= Porcentagem; Em relação ao perfil geral de resistência aos antibióticos, verificou-se que 78 isolados de EPEC (66,7%), apresentaram resistência a pelo menos 1 (um) dos doze antibióticos, 34 (29%) foram classificados como intermediários e apenas 5 (4.3%) apresentaram sensibilidade a todos os antimicrobianos. Além disso, observou-se que dos 78 isolados que apresentaram resistência a pelo menos um antibiótico, um total de 12 isolados (10,3%) foram monorresistentes, 13 (11,1%) apresentaram resistência a dois antibióticos e 53 (45,3%) são multirresistentes (apresentando resistência a 3 ou mais antibióticos). Na figura 15 é apresentado o resultado do teste fenotípico de sensibilidade (TSA), em ágar Muller-Hinton, de um dos isolados de EPEC.

54 53 Figura 15 - Teste fenotípico para detecção de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) nos isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. Na placa da esquerda, pode-se observar a resistência a 3 antibióticos (gentamicina, tetraciclina e trimetoprim-sulfametoxazol) pois não houve a formação de halo de inibição, e os demais antibióticos apresentaram sensibilidade (cefuroxima, imipenem e piperaciclina+tazobactam). Na placa da direita, também observou-se resistência a 3 antibióticos (amoxicilina+ácido clavulânico, ampicilina e cloranfenicol), e os antibióticos ciprofloxacina e ceftazidima apresentaram sensibilidade, para amicacina foi classificado como intermediário. *CRX= Cefuroxima, GEN= Gentamicina, IPM= Imipenem, PPT= Piperaciclina + Tazobactam, TET= Tetraciclina, SUT= Trimetoprim-sulfametoxazol, AMC= Amoxicilina + Ácido clavulânico, AMI= Amicacina, AMP= Ampicilina, CLO= Cloranfenicol, CIP= Ciprofloxacina e CAZ= Ceftazidima. Este estudo mostrou-se concordante com a literatura em relação a emergência de resistência, onde foi possível observar que mais da metade dos isolados de EPEC (66,7%) apresentaram resistência a pelo menos 1 antibiótico e apenas 5 isolados foram sensíveis aos 12 antibióticos testados. Além disso, também observou-se um número elevado de isolados multirresistentes (43,5%), fato que é preocupante pois a ocorrência de resistência aos antimicrobianos tem aumentado drasticamente nos últimos anos, tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento, tornado-se um dos principais problemas de saúde pública, visto que a emergência de cepas resistentes aos antimicrobianos diminui as opções terapêuticas (VILA & PAL, 2010). Ao se analisar o perfil de susceptibilidade dos isolados de tepec (15 isolados), observou-se uma alta frequência de resistência a ampicilina (86,7%), trimetoprimsulfametoxazol (80%) e tetraciclina (66,7%), sendo que 10 destes isolados (66,7%) apresentaram resistência a três ou mais antibióticos, destes 8 (53,3%) eram resistentes a AMP,

55 54 SUT e TET simultaneamente, e nenhum isolado apresentou sensibilidade aos 12 antibióticos testados (Figura 16 e Tabela 7). Figura 16 Frequência de resistência dos isolados de EPEC típica e atípica oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. Nos 102 isolados de aepec observou-se que 57 (55,9%) eram resitentes a ampicilina, 52 (51%) a trimetoprim-sulfametoxazol e 36 (35,3%) a tetraciclina. Nestes isolados também observou-se que 42 (41,2%) eram resistentes a 3 ou mais antibióticos, destes 13 (12,7%) eram resistentes a AMP, SUT e TET simultaneamente, e apenas 5 isolados (4,9%) apresentaram sensibilidade a todos os 12 antibióticos testados (Figura 16 e Tabela 7). Estes resultados demonstram que tanto para tepec quanto para aepec, os isolados apresentaram uma alta frequência de resistência a AMP, SUT e TET, com um número elevado de cepas multirresistentes principalmente em tepec. Segundo Arenas-Hernández et al., (2012), há uma alta porcentagem de cepas de tepec que são multirresistentes, enquanto que para aepec a frequência de resistência tem sido baixa ou não tem sido reportada, pois segundo este mesmo autor aepec tem apresentado resistência somente ao trimetoprim.

56 55 Tabela 7 - Perfil de susceptibilidade aos antibióticos dos isolados de EPEC típica e atípica, oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. EPEC (n=117) EPEC Típica (n=15) EPEC atípica (n=102) Antibiótico S % I % R % S % I % R % CRX 4 26, ,7 1 6, , ,4 3 2,9 GEN ,3 1 6, ,4 7 6, ,8 IPM 14 93,3 1 6, , ,7 7 6,9 PPT 4 93, , , ,8 2 2,0 TET 5 33, , , ,3 SUT AMC 7 46,7 7 46,7 1 6, , , ,7 AMI ,2 5 4,9 4 3,9 AMP 2 13, , , ,9 CLO 13 86, , ,3 3 2,9 10 9,8 CIP 14 93,3 1 6, ,1 5 4,9 2 2 CAZ 13 86,7 2 13, ,1 4 3,9 0 0 *S= Sensível; *I= Intermediário; *R=Resistente; *%= Porcentagem;*CRX-cefuroxima; *GEN- gentamicina; *IPM: imipenem; *PPT: piperaciclina+tazobactam; *TET: tetraciclina; *SUT: trimetoprim-sulfametoxazol; *AMC: amoxicilina+ácido clavulânico; *AMI: amicacina; *AMP: ampicilina; *CLO: cloranfenicol; *CIP: ciprofloxacina; *CAZ: ceftazidima. No estudo realizado por Scaletsky et al., (2010) sobre a resistência antimicrobiana de 70 isolados de tepec e 79 de aepec foi observado que 60% dos isolados de tepec eram resistentes a ampicilina e 42,8% a tetraciclina, enquanto que para aepec 24% eram resistentes a AMP e 10,1% a TET. Neste estudo também foi demonstrado uma frequência maior de resistência entre os isolados de tepec, sendo que 43% eram resistentes a 3 ou mais antibióticos. Em outro estudo realizado por Alikhani1et al., (2013) sobre a prevalência e o padrão de resistência de E. coli diarreiogênica isoladas de adolescentes e adultos no Iran foi observado que 67,5% dos dos isolados de DEC são multirresistentes, sendo que a maioria era resistente a ampicilina, trimetoprim-sulfametoxazol e tetraciclina. 4.5 DETECÇÃO FENOTÍPICA DE BETALACTAMASE DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESBL) Nos testes fenotípicos para detecção de β-lactamases de espectro estendido (ESBL), 17 isolados (14,5%) apresentaram um fenótipo suspeito e 100 (85,5%) foram considerados não

57 56 produtores da enzima (Tabela 8). Neste estudo não houve nenhuma amostra confirmada como produtora da enzima β-lactamase, visto que não foi observado a presença da zona fantasma ( Ghost Zone ) entre qualquer um dos antimicrobianos testados e o disco central contendo amoxicilina + ácido clavulânico, que é confirmatório para produção da enzima. Os isolados considerados suspeitos para produção de ESBL apresentaram apenas uma diminuição do halo de inibição entre os antibióticos testados e o disco central, que é indicativo da produção da enzima betalactamase (Figura 17). Tabela 8- Resultado do teste fenotípico para a detecção de betalactase de espectro estendido (ESBL) em cepas de EPEC oriundas de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. EPEC Resultado do ESBL Não produtor Suspeito Produtor Típica (n=15) 13 (86,7%) 2 (13,3%) 0 Atípica (n=102) 87 (85,3%) 15 (14,7%) 0 Total (n=117) 100 (85,5%) 17 (14,5%) 0 Figura 17 - Teste confirmatório para a produção da enzima β-lactamase. Na placa a esquerda é possível observar a formação de 4 zonas fantasmas ( Ghost Zone ), entre os antibióticos testados e antibiótico central contendo amoxicilina+ácido clavulânico em uma cepa padrão de Klebsiella pneumoniae ATCC produtora da enzima. Na placa a direita, de um dos isolados de EPEC, a diminuição do halo de inibição (neste caso inexistência do halo) entre os antibióticos testados e o disco central, é indicativo da produção de beta-lactamases de espectro estendido. As setas pretas indicam a formação da zona fantasma.

58 57 Em relação aos isolados de tepec e aepec, não houve diferença estatisticamente significativa entre a frequência dos isolados (p=1), sendo que nas amostras de tepec verificou-se a presença de 2 (13,3%) isolados suspeitos e 13 (86,7%) não produtores, enquanto que para aepec 15 (14,7%) foram suspeitos e 87 (85,3%) não produtores (Tabela 8). Neste estudo não foi confirmado a produção da enzima β-lactamase pelo teste fenotípico. Um dos fatores que pode estar relacionado a isso, é a capacidade da bactéria produzir a enzima β-lactamase, pois depende da quantidade da enzima que é produzida, da habilidade da enzima hidrolisar o antibiótico e da velocidade que o betalactâmico penetra na membrana externa da bactéria (JÚNIOR et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2009). Em relação aos 17 isolados de EPEC que foram considerados suspeitos para a produção de ESBL, verificou-se que houve a diminuição dos halos principalmente para os seguintes antibióticos: Ceftriaxona CRO com 70,6% (12/17), Cefotaxima CTX com 58,8% (10/17) e 52,9% (9/17) para aztreonama-atm, sendo que a maioria destes isolados era resistente a estes três antibióticos (Figura 18). Figura 18 - Perfil de resistência dos isolados de EPEC suspeitos para a produção de ESBL oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. Neste gráfico foram considerados apenas os 17 isolados suspeitos, sendo calculada a frequência de resistência (halo de inibição diminuído) somente para essas amostras. CPD= Cefpodoxima; CTX= Cefotaxima; ATM= Aztrezonama; CRO= Ceftriaxona; CAZ= Ceftazidima.

59 58 Embora a produção de ESBL não tenha sido confirmada neste estudo, alguns isolados foram considerados suspeitos para a produção de β-lactamases de espectro estendido, que é um importante mecanismo de resitência apresentado por algumas espécies de enterobactérias. A existência de bactérias resistentes aos antibióticos betalactâmicos é preocupante pois quando uma bactéria é produtora desta enzima, torna-se altamente eficaz em inativar penicilinas, cefalosporinas de primeira, segunda e terceira geração diminuindo as opções terapêuticas (DALMARCO et al., 2006; JÚNIOR et al., 2004; RIVA et al., 2008). 4.6 DETECÇÃO MOLECULAR DE GENES CODIFICADORES DE ESBL Quanto a pesquisa de genes codificadores de ESBL, verificou-se que 28 isolados de EPEC (23,9%) apresentaram o gene bla TEM, enquando que 89 (76,1%) não apresentaram este gene. Para o gene bla CTX-M, 23 amostras (19,7%) foram positivas e 94 (80,3%) negativas, para bla SHV 9 (7,7%) foram positivas e 108 (92,3%) negativas (Tabela 9). Na figura 19, é apresentado a foto de um gel de agarose 1% com o produto de PCR amplificando para o gene bla TEM, na figura 20 para o gene bla SHV (gel de agarose 1%) e na figura 21 para bla CTX-M (gel de agarose 1%). Tabela 9 Frequência de genes codificadores de ESBL do tipo bla TEM e bla SHV nos isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. bla TEM bla CTX-M bla SHV EPEC Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Típica (n=15) 4 (26,7%) 11 (73,3%) 5 (33,3%) 10 (66,7%) 2 (13,3%) 13 (86,7%) Atípica (n=102) 24 (23,5%) 78 (76,5%) 18 (17,6%) 84 (82,4%) 7 (6,9%) 95 (93,1%) Total (n=117) 28 (23,9%) 89 (76,1%) 23 (19,7%) 94 (80,3%) 9 (7,7%) 108 (92,3%) Nas cepas de tepec, a frequência do gene bla TEM foi de 26,7% (4/15) e 73,3% (11/15) não apresentaram este gene. Para bla CTX-M a prevalência de amostras positivas foi de 33,3% (5/15) e 66,7% (10/15) foram negativas, enquanto que para bla SHV 13,3% (2/15) foram positivas e 86,7% (13/15) negativas. Nos isolados de aepec, para o gene bla TEM a frequência

60 59 de positividade foi de 23,5% (24/102) e 76,5% (78/102) apresentaram resultado negativo. Para bla CTX-M, 17,6% (18/102) foram positivas e 82,4% (84/102) foram negativas, já para bla SHV, 7 isolados (6,9%) apresentaram este gene e 95 (93,1%) não amplificaram. Não houve diferença estatisticamente significante quanto a frequência dos genes codificadores de ESBL (bla TEM, bla CTX-M e bla SHV ) entre as categorias de EPEC (típica e atípica), sendo que os valores de p foram: bla TEM ( p= 0,7537), bla CTX-M (p= 0,1703) e bla SHV (p= 0,3244). Neste estudo foi detectado a presença de genes codificadores de ESBL do tipo bla TEM, bla CTX-M e bla SHV nos isolados de tepec e aepec, sendo que os genes bla TEM e bla CTX-M foram os que apresentaram maior frequência, respectivamente. A detecção destes genes demonstrada por este estudo é de extrema importância pois nos últimos anos houve um aumento no aparecimento de resistência aos antibióticos betalactâmicos devido a presença destes genes, principalmente em cepas de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. No estudo realizado por MNIF et al., (2013) a presença destes três genes foi verificada entre os isolados de Escherichia coli produtores de ESBL em dois hospitais na Tunisia, sendo que dos 163 isolados produtores de ESBL, 118 apresentaram o gene bla CTX-M, 49 bla SHV e apenas 3 bla TEM, sendo o gene bla CTX-M o de maior frequência. Figura 19 - Presença de genes codificadores de ESBL do tipo bla TEM em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. 1080pb Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de PCR amplificados para detecção do gene bla TEM (fragmento de 1080pb). O gel foi corado com GelRed x (diluição de 1:500), visualizado e fotodocumentado em transiluminador de luz ultravioleta. Linha 1- Peso molecular (PM) de 100bp DNA Ladder (Invitrogen); Linha 2 a 13 - amostras de EPEC, sendo apresentado duas amostras positivas (11 e 121); Linha 14 e 15- Controle positivo de Klebsiella pneumoniae CCBH 4955; Linha 16- Controle positivo diluído (1:100); Linha 17- Controle negativo bactéria DB11 (Serratia marcescens).

61 60 Figura 20 - Presença de genes codificadores de ESBL do tipo bla SHV em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. 231pb Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de PCR amplificados para detecção do gene bla SHV (fragmento de 231pb). O gel foi corado com GelRed x (diluição de 1:500), visualizado e fotodocumentado em transiluminador. Linha 1- Peso molecular (PM) de 100bp DNA Ladder (Invitrogen); Linha 2 a 13 - amostras de EPEC, sendo apresentado três amostras positivas (340, 367 e 400); Linha 14- Controle positivo de Klebsiella pneumoniae ATCC ; Linha 15- Controle positivo diluído (1:100); Linha 16- Controle negativo bactéria DB11 (Serratia marcescens). Figura 21 - Presença de genes codificadores de ESBL do tipo bla CTX-M em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. 544pb Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de PCR amplificados para detecção do gene bla CTX-M (fragmento de 544pb). O gel foi corado com GelRed x (diluição de 1:500), visualizado e fotodocumentado em transiluminador. Linha 1- Peso molecular (PM) de 1kb DNA Ladder (Biolabs); Linha 2 a 15 - amostras de EPEC, sendo apresentado nove amostras positivas (120,136, 145, 213, 253, 255, 256, 501 e 508); Linha 16- Controle positivo de Klebsiella pneumoniae CCBH 4955; Linha 17- Controle negativo bactéria DB11 (Serratia marcescens). No trabalho realizado por MAINA et al., (2012) com 52 isolados de E. coli e Klebsiella pnemoniae o gene bla CTX-M foi detectado em 88,5% (46) dos isolados, seguido de 34,6% (18) para bla TEM e 25% (13) para bla SHV. Em outro estudo realizado por LIM et al.,

62 61 (2009) com 47 isolados de E. coli oriundos de hospitais públicos da Malásia demonstraram que 35 isolados apresentaram o gene bla TEM, 3 bla SHV e 8 bla CTX-M. Análises estatísticas foram realizadas a fim de se relacionar a presença dos genes bla TEM, bla CTX-M e bla SHV com a produção de ESBL nos isolados de EPEC. Os resultados demonstraram que a presença destes genes não está relacionada com a produção de ESBL nas amostras estudadas, com valores de p não estatisticamente significativos (p= 0,2345 para o gene bla TEM, p= 0,3534 para bla SHV e p= para bla CTX-M ). Este resultado pode ser devido a existência de outros genes de resistência codificadores de ESBL, devendo ser investigado a presença de outros genes codificadores de ESBL. Além disso, deve-se considerar que a presença de genes de resistência a antibióticos betalactâmicos não indica a produção fenotípica da enzima betalactamase, visto que o micro-organismo pode apresentar o gene e não expressar a enzima através da produção da mesma (JÚNIOR et al., 2004;DALMARCO et al., 2006; RIVA et al., 2008). A presença dos três genes codificadores de ESBL também foram analisados quanto aos antibióticos que apresentaram maior frequência de resistência (AMP, SUT e TET) a fim de se verificar se havia alguma relação. Para o gene bla TEM e o antibiótico ampicilina o valor de p foi considerado estatisticamente significante (p=0,0003), sendo reforçado pelo valor do Odds-Ratio (OR= 8,148; IC 95%= 2,293 a 28,95), que indica que quem tem a presença deste gene de resistência, tem aproximadamente 8 vezes a chance de ser resistente a ampicilina. A associação estatística encontrada entre a presença de resistência a ampicilina e o gene bla TEM é esperada visto que a ampicilina é um antibiótico betalactâmico e a presença deste gene codifica para resistência a antibióticos betactâmicos tais como penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos (JÚNIOR et al., 2004). A positividade para bla TEM também foi relacionada com a resistência a trimetoprimsulfametoxazol, e o valor de p foi considerado estatisticamente significativo (p=0,0044; OR= 4,103 e o IC95%= 1,518 a 11,09), sugerindo que a presença deste gene esteja influenciando na resistência a este antibiótico. Para este mesmo gene e o antibiótico tetraciclina o valor de p foi considerado não significativo (p= 0,1926), indicando que não há relação entre este gene e a resistência ao antibiótico tetraciclina. Para o gene bla SHV e o antibiótico ampicilina o valor de p foi considerado não significativo (p= 0,3109), o mesmo ocorreu com a tetraciclina em que o valor de p foi igual a 0,7368, indicando que este gene não está associado com o perfil de resistência a esses dois antibióticos. A presença do gene bla SHV foi considerado estatisticamente significante para trimetoprim-sulfametoxazol, cujo valor de p foi igual a 0,0391(OR=7,429; IC95%= 0,8976 a

63 62 61,48). Não houve relação estatística entre a presença do gene do tipo bla CTX-M e os antibióticos ampicilina (p=0,4789), trimetoprim+sulfametoxazol (p=0,2506) e tetraciclina (p=1). Neste estudo verificou-se uma associação entre a presença de genes codificadores de ESBL (bla TEM e bla SHV ) e a resistência a outros antibióticos não betalactâmicos (como é o caso do trimetoprim-sulfametoxazol). Essa associação pode ocorrer devido a presença de genes de resistência a antibióticos não betalactâmicos em plasmídeos que codificam para resistência a ESBL, visto que estes plasmídeos geralmente estão associados com a resistência a diversas classes de antibióticos não-betalactâmicos, incluindo resistência a aminoglicosídeos, trimetoprim, sulfonamidas, tetraciclinas e cloranfenicol (JÚNIOR et al., 2004; DALMARCO et al., 2006). Quando considerada a resistência a pelo menos 1 dos 12 antibióticos testados no teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) e a presença dos genes codificadores de ESBL, o valor de p foi considerado extremamente significante para bla TEM (p= 0,0001; OD= 20,12; IC= 2,615 a 154,7) e bla SHV (p= 0,0001; OR= 4123; IC95%= 77,30 a ). Para o gene bla CTX-M não houve associação estatística entre o gene e a resistência a um dos 12 antibióticos (p= 0,3239). A associação estatística entre a presença de genes codificadores de ESBL (bla TEM e bla SHV ) e a resistência a pelo menos 1 antibiótico também pode ser explicada devido a presença de genes que conferem resitência a antibióticos estarem localizados no mesmo plasmídeo de resistência a ESBL (JÚNIOR et al., 2004). 4.7 TESTE DE ATIVIDADE HEMOLÍTICA NOS ISOLADOS DE EPEC O teste de hemólise em ágar sangue foi realizado a fim de se verificar a presença ou não de atividade hemolítica nos isolados de EPEC, tendo sido observado que 21 isolados (17,9%) apresentaram atividade hemolítica e 96 (82,1%) não apresentaram. Dos 21 isolados que demonstraram um perfil de hemólise, 18 (15,4%) foram alfa-hemolíticos e 3 (2,6%) betahemolíticos (Tabela 10 e Figura 22). Nas cepas de tepec 02 isolados (13,3%) apresentaram atividade hemolítica (alfa hemólise) e 13 (86,3%) não apresentaram hemólise (gama hemólise). Em aepec 16 (15,7%) foram alfa-hemolíticos, 3 (2,9%) foram beta-hemolíticos e 96 (82,1%) gama-hemolíticos (Tabela 10). Não houve diferença estatisticamente significante entre a frequência de isolados que apresentaram atividade hemolítica e os que não apresentaram entre as categorias de EPEC (p=1).

64 63 Tabela 10- Resultado do teste de hemólise dos isolados de EPEC oriundos de criança com gastroenterite em Porto Velho/RO. EPEC Resultado do teste de hemólise Alfa hemólise Beta hemólise Gama hemólise Típica (n=15) 2 (13,3%) 0 (0%) 13 (86,3%) Atípica (n=102) 16 (15,7%) 3 (2,9%) 83 (81,4%) Total (n=117) 18 (15,4%) 3 (2,6%) 96 (82,1%) Figura 22 - Teste de atividade hemolítica em ágar sangue de carneiro 5% em isolados de EPEC oriundos de crianças com gastroenterite em Porto Velho/RO. Na placa a esquerda, observa-se que os 3 isolados de EPEC apresentaram α-hemólise, devido a presença de um halo esverdeado ao redor das colônias (indica hemólise parcial do eritrócitos). Na placa a direita, observou-se que os 3 isolados apresentaram β-hemólise, devido a presença de um halo transparente ao redor das colônias (indica hemólise total dos eritrócitos). Neste estudo verificou-se a presença de cepas de EPEC apresentando atividade hemolítica, fato que é de suma importância pois indica que estes isolados estão apresentando um fator de virulência adicional aos descritos para E. coli enteropatogênica pois a atividade hemolítica não é uma característica do mecanismo de patogenicidade desse tipo de bactéria. A presença de atividade hemolítica tem sido descrita em vários patógenos e em E. coli muitas hemolisinas tem sido identificadas, porém a mais estudada é a α-hemolisina (HlyA) produzida por algumas cepas de E. coli uropatogênicas (UPEC) e em E. coli enterohemorrágica (EHEC), a hemolisina Ehx. Em alguns isolados de EPEC tem sido relatado a presença de uma enterohemolisina (Ehly). No estudo realizado por Magalhães et al., (2011)

65 64 sobre a capacidade de hemólise expressada por aepec, foi demonstrado que esses isolados apresentam atividade hemolítica devido a expressão de enterohemolisinas (Ehlys) e/ou ClyA (citolisina A). Neste estudo verifica-se a necessidade de melhor avaliar o papel da presença de atividade hemolítica nos isolados de EPEC, estabelecendo quais os genes envolvidos nesse processo.

66 65 CONCLUSÃO Os resultados apresentados neste trabalho permitiram realizar a caracterização dos isolados de Escherichia coli enteropatogênica, sendo possível determinar diferentes padrões citoaderência (AL, ALL e AA) nesses isolados. Além disso, foi possível verificar que as cepas de EPEC estão apresentando fatores de virulência adicionais, tais como a capacidade de formação de biofilme e a presença de atividade hemolítica, que favorecem a persistência bacteriana e que causam sérios prejuízos ao hospedeiro. O perfil de resistência aos antibióticos, bem como a detecção de ESBL por testes fenotípicos e moleculares também foi estabelecido neste estudo, e esses resultados poderão contribuir para o conhecimento acerca da resistência bacteriana em isolados de EPEC, visto que poucos estudos desta natureza são realizados nessa região, e também para uma futura orientação terapêutica.

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72 71 ANEXO I TCLE TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO O seu filho está sendo convidado como voluntário a participar da pesquisa: Caracterização etiológica e molecular dos vírus associados à gastroenterite em crianças de 0 a 6 anos de idade na região na Porto Velho-RO. A doenças diarréica aguda é umas das principais causas de morte em crianças menores de 6 anos de idade. Os rotavírus e adenovírus, astrovírus e norovírus são os agentes mais implicados com quadros de diarréias graves. Por isso convidamos o responsável pelo menor a participar deste estudo que tem como objetivo avaliar a presença desses vírus nas crianças com diarréia internada nesta unidade hospitalar, para que medidas adequadas em relação ao tratamento sejam adotadas. As amostras de fezes serão coletadas através de evacuações espontâneas diretamente da fralda, após autorização dos pais ou responsável que irá preencher e assinar uma ficha com dados pessoais e clínicos da criança. O estudo não acarretará qualquer risco ou prejuízo para a criança ou seus responsáveis. O resultado do exame estará disponível dentro de 24 horas a partir da coleta e será encaminhado ao médico responsável pelo atendimento da criança para auxiliar no diagnóstico. A criança não será identificada em nenhum momento do estudo e as informações serão guardadas em sigilo e apenas os dados do estudo serão divulgados. O responsável tem o direito de receber informações adicionais sobre o andamento do estudo em qualquer momento no Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Porto Velho-RO, sendo livre para recusar-se a participar, retirar seu consentimento ou interromper a participação a qualquer momento. A participação é voluntária e a recusa em participar não irá acarretar qualquer penalidade. Uma cópia deste consentimento informado será arquivada no Laboratório de Microbiologia do CEPEM, e outra será fornecida ao responsável pela criança. Estou ciente de que a participação do meu filho (a) é voluntária e que se eu preferir não participar ou deixar de participar deste estudo em qualquer momento, isso não acarretará qualquer tipo de penalidade. Eu,.

73 72 Responsável pelo menor li e ouvi o esclarecimento acima e compreendi para que serve o estudo e qual procedimento meu filho será submetido. A explicação que recebi esclarece os objetivos, riscos e benefícios do estudo. Portanto sei que o nome do meu filho não será divulgado, que não terei despesas e não receberei dinheiro por participar do estudo. Eu concordo em participar do estudo. Porto Velho.../.../... Assinatura do responsável legal Documento de Identidade Impressão Digital Assinatura do pesquisador responsável Telefone e do pesquisador : (69) / /najla_matos@yahoo.fr (69) / / sandra.amarall@hotmail.com

74 73 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Eu, Responsável pelo menor,, estou sendo convidado (a) e aceito participar da pesquisa Intitulada - Caracterização Etiológica e Molecular dos vírus associados a gastroenterite em crianças de 0 a 6 anos de idade na região de Porto Velho-RO. Fui informado da justificativa, objetivo e procedimentos que serão utilizados na pesquisa. Estou ciente de que a participação do meu filho (a) é voluntária e que se eu preferir não participar ou deixar de participar deste estudo em qualquer momento. Porto Velho, de Assinatura do responsável:

75 ANEXO II PARECER CONSUBSTANCIADO 74