COORDENADORES: Profa. Dra. Dejanira Franceschi de Angelis IB UNESP RC Prof. Dr. Otávio Antonio Valsechi CCA - UFSCar - Araras

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1 II CURSO DE MONITORAMENTO TEÓRICO E PRÁTICO DA FERMENTAÇÃO ETANÓLICA COORDENADORES: Profa. Dra. Dejanira Franceschi de Angelis IB UNESP RC Prof. Dr. Otávio Antonio Valsechi CCA - UFSCar - Araras RIO CLARO 2008

2 1. OBJETIVO O controle do crescimento da população microbiana dentro de um complexo industrial de açúcar e álcool objetiva essencialmente a diminuição das perdas de matéria-prima e, conseqüentemente, alcançar melhores rendimentos econômicos. 2. PONTOS DE AMOSTRAGEM E ANÁLISES OU TESTES DEPENDENDO DA INDÚSTRIA Pontos de amostragem Água de lavagem da cana Caldo primário Caldo misto Caldo antes da sulfitação ou calagem Caldo decantado Mosto e Mel Xarope, água de diluição, caldo cru Mosto antes e após os trocadores de calor Início de alimentação da dorna Final da alimentação Leite de leveduras ou cubas Análises que podem ser realizadas n bactérias/ml Redução de resazurina Plaqueamento (contagem geral) nº bactérias/ml Plaqueamento para produtores de goma e ácido nº bactérias/ml Plaqueamento para produtores de goma e ácido nº bactérias/ml Plaqueamento para produtores de goma e ácido nº bactérias/ml Plaqueamento para produtores de goma e ácido Redução de resazurina nº bactérias/ml Redução de resazurina Plaqueamento para produtores de goma e ácido Redução de resazurina nº bactérias/ml nº de células vivas/ml % de viabilidade % de brotamento % de brotos vivos Plaqueamento nº bactérias/ml % de células vivas % de brotamento % de brotos vivos Plaqueamento 1

3 3. COLETA DE AMOSTRAS As amostras devem ser coletadas com muito cuidado, sempre da mesma forma e por pessoas de alta responsabilidade. Da coleta correta das amostras, acoplado ao bom desenvolvimento laboratorial, depende o resultado de uma empresa. O ideal é que as coletas sejam feitas em frascos inquebráveis, autoclaváveis e transparentes. Existem frascos especiais de coleta, que podem ser autoclavados. Quando as análises são para microbiologia, os frascos são de 200; 300 a 500 ml. As amostras preferencialmente devem ser amostras mistas ou compostas. Uma vez coletadas as amostras, os frascos devem ser fechados e guardados sob refrigeração de 5 ± 2ºC, pelo menor tempo possível. Dependendo da amostra é conveniente anotar no momento da coleta a temperatura e o ph (ficar atento quando as amostras estão em etapa fermentativa, pois podem gerar pressão nos frascos). 4. AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE BACTÉRIAS A avaliação pode ser feita pelos seguintes métodos: MICROSCOPIA PLAQUEAMENTO (tanto para bactérias quanto para leveduras) FISIOLOGIA MICROSCOPIA A análise por contagem microscópica é importante, pois permite relacionar possíveis aumentos das bactérias no mosto proveniente das diferentes etapas do processo. Para contagem pode-se empregar várias técnicas, entretanto a câmara de Neubauer é simples e confiável. 2

4 PLAQUEAMENTO O plaqueamento embora não forneça o resultado imediato pode garantir a viabilidade dos microrganismos presentes, além de permitir avaliar a presença de microrganismos em volumes maiores. FISIOLOGIA O método de resazurina ou corantes diferenciais (azul de metileno e eritrosina) permitem avaliar de forma relativa à presença de atividade microbiana em função da mudança de cor no corante. A produção de ácido pode ser avaliada e comprovada mediante medida do ph, ou com aplicação de corantes como indicadores diferenciais, ou ainda nos meios os quais se adiciona CaCO 3. Quanto à produção de goma, que é o resultado da polimerização de açúcares simples glicose e frutose que formam respectivamente dextrana e levana. 5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1. Teste da Resazurina Preparar uma solução de NaCl 9 g/l, ajustar o ph a 7,0 com solução de NaOH. Solução de resazurina a 10 mg/l de solução de NaCl 9,0%. A solução não deve ser estocada por muito tempo (10 dias), e deve ser protegida da luz e de altas temperaturas. Preparar tubos com 9 ml de solução de resazurina, tampar com algodão, autoclavar 10 minutos a 121 ºC. Nos tubos com resazurina, adicionar 1 ml da amostra. Incubar em estufa ou banho-maria a 37 ºC. Anotar as mudanças de cor a cada 30 minutos (violeta-róseo-incolor), estão em relação direta com a atividade microbiana. 3

5 Modificação da cor (horas) Avaliação Tratamento da infecção violeta róseo incolor - 0,5 3,0 alta imediato 0,5 2,0 4,0 alta imediato 1,0 4,0 6,0 média imediato 3,0 5,0 7,0 fraca normal 3,0 5,0 - desprezível preventivo 5.2. Plaqueamento Para este teste deve-se dispor dos seguintes materiais: Autoclave; Estufa de incubação; Placas de petri; Tubos para diluição; Pipetas; Bico de bunsen; Algodão; Reagentes: meios de cultura que podem ser adquiridos prontos ou preparados a partir de seus componentes. Os meios podem variar de acordo com a necessidade e o ponto de amostragem. Preparo do material: Placas de Petri e pipetas devem ser esterilizadas embrulhadas em papel ou em recipientes próprios. A solução salina (NaCl a 0,85%) é colocada no volume de 9 ml em tubos. A seguir tampa-se com algodão e esteriliza-se em autoclave. Os meios de cultura quando preparados devem ser autoclavados para esterilização durante 15 minutos a 121ºC. A amostra a ser analisada deve ser representativa do ponto selecionado. 4

6 Das amostras são feitas diluições decimais utilizando-se soluções contidas nos tubos. Deve-se diluir a amostra para se atingir entre 30 e 300 UFC (Unidades Formadoras de Colônias) por placa. Feitas as diluições, selecionam-se as que serão processadas. A seguir, retira-se uma alíquota do tubo da diluição selecionada e transfere-se para a placa que conterá ou não o meio de cultura, dependendo da técnica a ser aplicada (superfície = 0,1 ml ou pour plate = 1 ml). Caso a placa não contenha o meio, este deverá ser colocado posteriormente, já liquefeito e a uma temperatura (± 50ºC), vertendo-o sobre a amostra, fazendo-se movimentos em forma de oito para homogeneizá-la no meio antes da solidificação (técnica pour plate ). Caso o meio já tenha sido colocado na placa, este deve estar frio e solidificado ao se colocar a amostra na superfície. Neste caso a amostra é espalhada com auxílio de uma espátula de Drigalsky (técnica de superfície). Marcar na placa o meio, a amostra, a diluição, o volume de amostra e a data do experimento. Após estarem solidificadas, as placas então são incubadas a 36 ºC (bactérias) ou 28 ºC (leveduras). Pode-se aplicar também uma temperatura de 30ºC para bactérias e leveduras, embora esta esteja abaixo do ideal para as bactérias que demorarão mais para crescer. A incubação deve ser por 24 a 48 horas e, a seguir, as colônias são contadas. O experimento deve sempre ser feito em placas com duplicatas. Ex. de contagem na diluição a 10-3, plaqueando-se 0,1 ml Placa 1: 110 colônias Placa 2: 130 colônias Média: 120 colônias 120 x 10 3 x 0,1 = 12 x 10 5 UFC/mL 5

7 5.3 Principais problemas microbiológicos envolvendo bactérias Produção de ácido Amostras de caldo são coletadas nos diferentes pontos do processo em frascos, tubos ou recipientes esterilizados. A seguir são colocadas em uma solução contendo indicador com faixa de variação curta (ex. púrpura de bromocresol ou verde de bromocresol). Ajustar o ph das amostras a ph 6,8 para púrpura de bromocresol e ph 5,0 para verde de bromocresol. Os tubos são incubados a 30ºC e observados de hora em hora. Descartar após 12 ou 24 horas. Quando ocorrer predominância de bactérias ácidas as alterações ocorrem aproximadamente após 3 horas Produção de goma Amostras devem ser coletadas como no caso anterior e colocadas diretamente na estufa, caso a presença de goma seja numerosa o meio mostra-se em 12 horas turvo e viscoso. Para acelerar a reação é conveniente acrescentar para cada 10 ml de amostra 2 ml de solução esterilizada de extrato de levedura. O número das bactérias formadoras de goma pode ser determinado pelo meio de Mayeux & Colmer ou ainda pelo meio CSN. As UFC aparecem convexas ou espalhadas, podem ser leitosas ou límpidas. 5.4 Principais problemas microbianos envolvendo leveduras VOLUME DE FERMENTO VIABILIDADE CELULAR E BROTAMENTO CELULAR FLOCULAÇÃO LEVEDURAS SELVAGENS Para uma avaliação geral da situação das leveduras a microscopia envolvendo a contagem auxilia muito. 6

8 5.4.1 Técnica de contagem de células ou partículas Rotineiramente emprega-se em Microbiologia a Câmara de Neubauer, considerada como precisa e de leitura rápida para quantificar células de leveduras, esporos, bactérias e outras partículas. A câmara de Neubauer é conhecida por lâmina hematimétrica. Presta-se à contagem de células ou partículas visíveis ao microscópio óptico. Retículo simples Retículo duplo De uma maneira geral a câmara é dividida em 16 ou 25 quadrados. Quando estiver dividida em 25, cada quadrado terá 0,2 mm. Quando estiver dividida em 16, cada quadrado terá 0,25 mm. Assim o volume útil de cada quadrado médio é: 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1mm = 0,004 mm 3 25 quadrados: 25 x 0,004 = 0,1 mm 3 0,25 mm x 0,25 mm x 0,1mm = 0,00625 mm 3 16 quadrados: 16 x 0,00625 = 0,1 mm 3 7

9 Como a profundidade da câmara é de 0,1 mm (1/10 cm) o seu volume equivale a: 1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 1/10 cm x 1/10 cm x 1/100 cm = 1/10000 cm 3 = 0,0001 cm 3 Lembrando que: 10 x 0,1 mm 3 = 1 mm x 0,001 mm 3 = 1 mm x 0,1 mm 3 = 1 cm 3 ou 10 4 x 0,1 mm 3 = 1 cm 3 8

10 Considerando a profundidade da câmara (1/10 mm) e que as contagens são anotadas em cm 3 (1 cm 3 = 1 ml) o volume de um quadrado grande é: 1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 1/10 cm x 1/10 cm x 1/100 cm = 1/ cm 3 ou 0,0001 cm 3. 0,0001 é o fator da lâmina = 1 x REGRAS DE CONTAGEM 1) Conte as células usando o quadrado grande do centro. 2) Conte as células dos quadrados médios e as células que estiverem tocando as linhas superiores e as linhas à direita. 3) Conte cerca de 200 a 250 células antes de determinar o número por cm 3. 9

11 NOS 25 OU 16 QUADRADOS PODEM SURGIR 4 SITUAÇÕES: A) Coincidir de haver 200 a 250 células, neste caso conte as mesmas e multiplique por 10 4 para obter o número de células por cm 3. Ex: 200 células 2 x 10 2 x 10 4 = 2 x 10 6 B) Pode haver menos de 200 células por quadrado grande, neste caso será necessário a contagem de células de alguns quadrados grandes laterais para atingir cerca de 200. Divida o número de células pelo número de quadrados grandes e multiplique por 10 4 para achar o número de células por ml ou cm 3. C) Pode haver mais de 200 células por quadrado grande, neste caso conte as células dos quadrados médios até haver contado cerca de 200. Determine o número de células de um dos quadrados médios. Multiplique a média por 25 para obter as células por quadrado grande. Este número x 10 4 fornece o número de células por cm 3. Ex: 210 células em 3 quadrados médios. Cada um medindo 0,2 x 0,2 mm. Quantas células há por cm 3? 210/3 = 70 células por quadrado médio 70 x 25 = 1750 em 0,1 mm 3 (1750 células por quadrado grande) 1750 x 10 4 = ou 1,75 x 10 7 células/cm 3 D) O número de células é muito grande para ser contado. Neste caso a solução precisa ser diluída. Uma alíquota de 1mL diluído em 9 ml de água ou solução salina é uma diluição de 1:10 ou 1/10, neste caso o número de células contadas deve ser multiplicado por

12 CÁLCULO DA PORCENTAGEM DE CÉLULAS DE LEVEDURAS % Viabilidade = Vivas x 100 Vivas + mortas % Brotamento = Vivos x 100 Vivos + mortos % Viabilidade dos brotos = Brotos vivos x 100 Br. vivos + Br. Mortos Flocos por campo (ml) = Flocos x 100 N de quadrados 5.5 Soluções utilizadas na contagem de leveduras Solução A - Solução de sulfato azul de Nilo 20 g de sulfato azul de Nilo em 100 ml de água destilada Solução B - Solução de azul de metileno 0,2 g de azul de metileno em 100 ml de água destilada Uso: solução A + solução B em partes iguais Eritrosina - 1 g de eritrosina em 100 ml de água destilada. Diluir 1 ml desta solução em 50 ml de solução tampão (partes iguais de 0,2 M de Na 2 HPO 4 de 0,2 de NH 2 PO 4 ). Ficando solução corante de 1:5000. Guardar em refrigerador. 1 ml (suspensão de células) + 1 ml de solução corante. Examinar em câmara de Neubauer. Obs.: pode-se ainda utilizar a câmara de Petroff-Hauser. 5.6 Meios de cultura para leveduras Estes meios permitem o desenvolvimento de técnicas microbianas que possibilitem a identificação da presença de bactérias contaminantes e leveduras diferentes daquelas usualmente empregadas (Saccharomyces cerevisiae e S. uvarum) na fermentação etanólica. 11

13 5.6.1 Meio WLN Este meio permite avaliar o número total de células, as diferenças morfológicas entre colônias e a produção de ácido. Além disso, há a possibilidade de tornar o meio parcialmente seletivo pela adição de actidiona Preparo do meio Composição do WLN-modificado (quantidade para 100mL): Glicose... 5,0000g KH 2 PO ,0550g (a) KCl... 0,0425g (b) CaCl 2.2H 2 O... 0,0125g (c) MgSO 4.7H 2 O... 0,0125g (d) FeCl 3.6H 2 O... 0,2500g (e) MnSO 4.4H 2 O... 0,2500g (f) Peptona de caseína ,5000g Extrato de levedura... 0,4000g Ágar... 2,0000g Verde de bromocresol... 0,0022g (g) Ácido nalidíxico... 5,0000mg (h) Ampicilina... 5,0000mg (i) ph = 5,5 (HCl, 1 N) Observação: os ingredientes a, b, c, d, e, f, g, h e i serão adicionados na forma de solução. a) Solução de KH 2 PO 4 5,5 g/ 100 ml. Usar 1 ml para 100 ml de meio. b) Solução de KCl 4,25 g/ 100 ml. Usar 1 ml para 100 ml de meio. c) Solução de CaCl 2.2H 2 O 1,25 g/ 100 ml. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio. d) Solução de MgSO 4.7H 2 O 1,25 g/ 100 ml. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio. e) Solução de FeCl 3.6H 2 O 0,5 g/ 200 ml. Usar 0,1 ml para cada 100 ml de meio. f) Solução de MnSO 4.4H 2 O 0,5 g/ 200 ml. Usar 0,1 ml para cada 100 ml de meio. g) Verde de bromocresol 220mg/ 100 ml. Dissolver em 5 ml de álcool e completar para 100 ml com água. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio. 12

14 Procedimento a) Pesar a glicose em um becker. Coletar água em um becker (1/10 do volume total do meio, isto é, 10 ml) e acrescentar a glicose. Dissolver. Transferir para o tubo. Etiquetar glicose 5 g/ 10 ml para 100 ml de WLN. Esterilizar, após fechar com tampão e folha de alumínio. b) Coletar 83 ml de água destilada em um becker, acrescentar a peptona de caseína, extrato de levedura e as soluções. Dissolver em banho-maria, medir ph e ajustar com HCl 1N, se necessário. Acrescentar o ágar e voltar ao banho-maria. Após a dissolução, transferir para Erlenmeyer de 250 ml e etiquetar WLN sem glicose. Fechar com tampão de algodão e folha de alumínio. Esterilizar 10 minutos a 1 atmosfera (121 o C) Uso de antibiótico e preparação das soluções Para minimizar o crescimento bacteriano que prejudicaria os resultados, o meio WLN sofre a adição de antibióticos. Na rotina dos laboratórios III e IV do Departamento de Bioquímica e Microbiologia do Instituto de Biociências sa UNESP- Rio Claro, verificou-se a eficiência da combinação do antibiótico ácido nalidíxico com ampicilina. a) Preparo da solução de ácido nalidíxico (Solução h) Triturar 1 comprimido de 500 mg de ácido nalidíxico farmacêutico em almofariz. Dissolver a solução de NaOH 0,05N completando o volume para 100 ml. Guardar em geladeira. Usar 1 ml para cada 100 ml de meio de forma a obter 50 ppm (50 microgramas/ mililitro). A solução de ácido nalidíxico é autoclavável, podendo ser acrescentado ao meio antes da esterilização. b) Preparo da solução do antibiótico ampicilina (Solução i): Triturar 1 comprimido de 500 mg de ampicilina (farmacêutica) num almofariz. Dissolver em água destilada, completando o volume para 100 ml. Usar 1 ml para 13

15 100 ml de meio, de forma a obter a concentração final de 50 ppm (50 microgramas/ mililitro). Pode ser autoclavado Meio WLN sem bromocresol A preparação é idêntica à descrita em e , exceto pela ausência do verde de bromocresol Meio WLN com actidiona O meio WLN pode sofrer a adição de actidiona a um nível suficiente para inibir o crescimento de leveduras de processo e permitir o desenvolvimento daquelas espécies presentes que tenham menor sensibilidade ao produto. Vale lembrar que algumas espécies de leveduras são insensíveis a 1000 ppm. A actidiona inibe Saccharomyces cerevisiae e S. uvarum nas concentrações de 2,5 e 0,17 ppm. Por medida de segurança, trabalha-se com 5 ppm de actidiona. a) Preparação da solução de actidiona A actidiona deve ser manipulada com máxima cautela, com o objetivo de evitar sua ingestão ou contato com a pele. Solução estoque A: Pesar 0,2 g e dissolver em 1 ml de acetona. Juntar 9 ml de água e esterilizar por filtração em membrana millipore GSWP-01300, 0,22 micrometros. Essa solução terá a concentração de 20 mg/ml. Guardar em geladeira. Solução de trabalho B: Transferir 5 ml da solução A e adicionar 95 ml de água destilada estéril. A solução de trabalho terá a concentração de 1mg/mL. Usar 0,5 ml para cada 100 ml de meio já esterilizado e fundido. Guardar em geladeira. 14

16 Preparação da amostra Toma-se um volume medido da amostra (por exemplo, 10 ml). Centrifuga-se com assepsia, resuspende-se em 9 ml de solução salina estéril. Após nova centrifugação, o sobrenadante é descartado e a massa celular é resuspensa em salina de forma a se reconstituir o volume inicial da amostra. A suspensão sofrerá diluição em série até O plaqueamento em meio WLN sem actidiona é feito em duplicata, nas diluições 10-5, 10-6 e O plaqueamento nos demais meios é feito nas diluições 10-1, 10-2 e Observação: a prática de cada laboratório indicará as melhores diluições Plaqueamento Plaquear em superfície 0,1 ml de suspensão de células por placa, espalhando com espátula de Drygalsky. Incubar em estufa a 28 o C e proceder às leituras de 2 a 5 dias Meio de lisina Preparo do meio Composição do meio de lisina modificado (para 100 ml de meio) YCB (Yeast Carbon Base)...1,17 g Lisina...0,10 g Ágar...2,00 g Ampicilina...5,00 g Ácido nalidíxico...5,00 g Preparo do meio a) Preparo da solução YCB concentrada 10 vezes. Tomar 11,7 g de YCB e preparar 100 ml de solução concentrada 10 vezes, usando água morna. Esterilizar através de membrana millipore GSWP (0,22 micrômetros) e pré-filtro AP Esta quantidade é suficiente para preparar 1000 ml de meio. 15

17 b) Preparo do meio sólido. Dissolver 2,0 g de ágar e 0,1 g (100 ml) de lisina em 88 ml de água destilada em banho-maria. Adicionar 1 ml de solução de ampicilina e 1 ml de solução de ácido nalidíxico preparados como nos itens a e b. Autoclavar 10 minutos a 1 atmosfera (121 0 C). Após autoclavagem, adicionar assepticamente 10 ml da solução de YCB concentrada 10 vezes Preparo da amostra e plaqueamento Seguir instruções dos itens e Meio de preservação de leveduras Meio Sólido de Sabouraud 4% Peptona ou triptona...10 g Glicose...40 g Ágar...17 g Água destilada ml Misturar os componentes e fundir em banho-maria. A seguir, distribuir em frascos ou tubos, tampar e esterilizar em autoclave por 10 minutos a 1 atmosfera (121 0 C). Observação: este meio pode ser preparado com 20 g de glicose Meio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) Glicose...20 g Peptona...20 g Extrato de levedura...10g ou 20 ml de hidrolisado de levedura Ágar...15 a 17 g Água destilada ml 16

18 Misturar os componentes, fundir em banho-maria e a seguir, distribuir em frascos ou tubos. Esterilizar durante 10 minutos a 1 atm de pressão Extrato de malte 2% Extrato de malte...20 g Ágar...15 a 17 g Água destilada ml Dissolver em banho-maria o extrato de malte e o ágar. A seguir distribuir em frascos ou tubos, tamponar e esterilizar durante 15 minutos a 1 atm de pressão (121 o ). Figura 1: Leveduras de dorna cultivada no meio WLN com verde de bromocresol onde se verifica diferentes biotipos. Figura 2: Leveduras selvagens cultivadas em meio WLN com verde de bromocresol e actidiona, onde se verifica diferentes biotipos. 17

19 6 LITERATURA CONSULTADA LIMA, A. O.; SOARES, J. B.; GRECO, J. B.; GRAUZZI, J. E.; CANÇADO, J. R. Métodos laboratoriais aplicados à clínica. 5 ed., p OLIVEIRA E SILVA, R.B. Leveduras contaminantes na produção de etanol industrial por processo contínuo: quantificação e identificação. Dissertação de Mestrado, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP, 1994, 145 p. SHARFM J. M. Métodos recomendados para o exame microbiológico de alimentos. Polígono, p. 239, SUSSMAN, A. S. Microrganismos, crescimento, nutrição e interação. Edart, p , TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R; CASE, C. L. Microbiologia. Ed. Artmed