MESTRADO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA

Transcrição

1 MESTRADO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA (1º semestre 2015/16) ENGENHARIA GENÉTICA A0 - TRABALHOS LABORATORIAIS DE INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS Cristina Anjinho Viegas Área Científica-Pedagógica de Ciências Biológicas (Departamento de Bioengenharia, IST)

2 Regras básicas de Higiene, Segurança e Protecção do Ambiente nas aulas laboratoriais de Microbiologia e Engenharia Genética 1. É obrigatório o uso de bata de laboratório. 2. É obrigatório lavar as mãos, antes de sair do laboratório. 3. É proibido comer, beber, fumar ou manusear lentes de contacto na zona de trabalho. 4. É proibido pipetar à boca; usar apenas meios mecânicos nos procedimentos de pipetagem. 5. As superfícies de trabalho devem ser desinfectadas (p.ex. com solução de álcool etílico 70% (v/v), fornecida pelo docente), após qualquer derrame de culturas de células viáveis. 6. Culturas de células viáveis ou material sujo com células viáveis, não devem ser colocados no lixo/esgoto ou na zona de lavagem, sem antes terem sido sujeitos a tratamento adequado: - Material descartável sujo (p.ex. pontas plásticas de pipetas automáticas, tubos tipo Eppendorf, membranas filtrantes, etc.) deve ser recolhido em recipiente específico contendo solução de Extran 2% ou lixívia diluída 1:10 (fornecido pelo docente), visando a sua desinfecção antes da deposição no lixo. - Culturas de células viáveis devem ser colocadas em recipiente ou zona específica (indicado pelo docente), para serem destruídas por autoclavagem (121ºC/1bar, durante pelo menos min) antes da sua deposição no lixo. - Material não-descartável (p.ex. vidro) sujo deve ser colocado em zona específica (indicada pelo docente), para ser sujeito a autoclavagem ou desinfecção antes de se proceder à sua lavagem. 7. Todas as operações que envolvem o manuseamento de culturas de células viáveis, nomeadamente inoculação de meios líquidos e sólidos, repicagem e isolamento de colónias, colheita de amostras celulares, etc. são realizadas em condições de assepsia, junto à chama do bico de Bunsen.

3 Outros procedimentos de Higiene e Segurança: 1. Para prevenir acidentes por queimadura, durante a utilização da chama do bico de Bunsen, deve: - manter o corpo a uma distância adequada da chama; - apanhar o cabelo; - evitar tocar nas zonas quentes do material flamejado. 2. Não se esqueça de esterilizar a ansa de repicagem na chama do bico de Bunsen antes de a pousar na bancada, após a transferência da cultura microbiana. 3. Para prevenir acidentes por queimadura e incêndio, durante a esterilização de material (p.ex. vareta de vidro em L, pinça) pela acção combinada de álcool etílico e chama de bico de Bunsen, deve: - manter o recipiente contendo o álcool a uma distância adequada da chama, de modo a não deixar inflamar o álcool; - evitar tocar nas zonas quentes do material flamejado. 4. Para prevenir acidentes por queimadura com vapor de água, após a autoclavagem de material e meios de cultura, não deve colocar o tronco e a face sobre a autoclave, durante a sua abertura (a temperatura do vapor que sai da autoclave poderá ser > 80-90ºC).

4 NOTA: Pode encontrar conteúdos, ilustrações e animações sobre as técnicas básicas da Microbiologia utilizadas neste trabalho no Portal e-escola ( nas secções seguintes: 1) Preparação de meios de cultura sólidos (seguir Início > Biologia > Laboratórios de Biologia > Laboratório de Microbiologia >) 2) Esterilização pelo calor: autoclavagem (seguir Início > Biologia > Sub-temas e tópicos > Microbiologia > Controlo do crescimento microbiano>); 3) Meios de cultura (seguir Início > Biologia > Sub-temas e tópicos > Microbiologia > Técnicas microbiológicas básicas >). 4) Crescimento Microbiano e Crescimento de células em suspensão (seguir Início > Biologia > Microbiologia > Sub-temas e tópicos >) 5) Observação Microscópica de bactérias coloração de Gram (Seguir Início > Biologia > Laboratórios de Biologia > Laboratório de Microbiologia >)

5 1. PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA SÓLIDOS E LÍQUIDOS. TÉCNICAS DE ASSÉPSIA. INOCULAÇÃO DE MEIOS SÓLIDOS E LÍQUIDOS. TÉCNICAS DE REPICAGEM - ISOLAMENTO DE COLÓNIAS Preparação de meios de cultura sólidos (agarizados) e líquidos. a) Preparar 500 ml de meio base LB com a seguinte composição: MEIO LB Extracto de Levedura (Difco) Bacto-Peptona (Difco) NaCl 5 g/l 10 g/l 5 g/l (Verificar o valor do ph do meio de cultura e, se necessário, ajustar a 7) b) Para preparar um balão com meio de cultura LB líquido, colocar 25 ml do meio base preparado em a) no interior de um balão Erlenmeyer com capacidade de 100 ml. Rolhar os balões com algodão cardado e tapar com papel de alumínio. Esterilizar na autoclave, a 121 C (1 atm), durante 15 minutos. Deixar arrefecer. c) Para preparar placas de Petri contendo meio LB sólido (agarizado): adicionar uma quantidade adequada do agente solidificante agar (fornecedor: Iberagar) a 475 ml de meio base preparado em a), de modo que a concentração final de agar seja de 20 g/l. Em seguida, colocar o meio num frasco Schott de 1 L. Esterilizar na autoclave, a 121 C (1 atm), durante 15 minutos. Após esterilização, deixar arrefecer o meio até cerca de C e verter, em condições de assépsia (junto à chama do bico de Bunsen), cerca de 15 ml em cada uma das caixas de Petri previamente esterilizadas. Deixar solidificar e virar as placas. NOTA:.Os meios de cultura que não sejam imediatamente utilizados devem ser guardados no frigorífico (4 C). Identificar as placas e os balões com a designação do meio Inoculação dos meios e repicagem e isolamento de colónias Proceder à repicagem ou transferência de culturas puras de estirpes de duas estirpes bacterianas (pertencentes às espécies Escherichia coli e Sphingomonas elodea), fornecidas em placa de meio sólido ou em suspensão em meio líquido, para os meios preparados em 1.1., de acordo com o procedimento seguinte:

6 a) Todas as transferências e manipulações de culturas devem ser realizadas em condições de assépsia, junto a uma chama de bico de Bunsen. b) Para a obtenção de placas de manutenção das culturas microbianas com base no isolamento de colónias em estrias (também designados por riscados) na superfície do meio sólido contido em placa de Petri, recorra a uma ansa de repicagem e siga o esquema indicado na figura seguinte (de 1 para 5). O filamento metálico da ansa deve ser esterilizado na chama do bico de Bunsen (isto é, levado ao rubro) antes e depois de cada riscado. Sempre que a direcção das estrias é alterada, a ansa deve ser esterilizada na chama (e arrefecida no meio sólido), de forma a espalhar as células que estão sobre as estrias/riscados imediatamente anteriores Após inoculação, incubar as culturas a 37 C, durante 48 horas, até ao aparecimento de colónias visíveis na superfície do meio de cultura sólido. NOTA: Identificar todas as placas ou balões com a designação do microrganismo inoculado e com a data de inoculação. 3. Observação: Após 48 h de incubação a 37ºC, observar as culturas inoculadas tendo em atenção: (i) o aspecto (forma, tamanho, pigmentação) das colónias isoladas nas placas de isolamento com riscados; (ii) o aumento da turbidez nas culturas em meio líquido.

7 2. ACOMPANHAMENTO DO CRESCIMENTO EM DESCONTÍNUO DE UMA POPULAÇÃO DA BACTÉRIA Escherichia coli. 1. Introdução O crescimento da estirpe bacteriana Escherichia coli DH1 será conduzido em cultura descontínua ("batch"), em meio LB líquido, com agitação orbital (250 rpm, rotações por minuto) e à temperatura constante de 37 C. A curva de crescimento será obtida com base na determinação, ao longo do tempo, da Absorvância da cultura medida ao comprimento de onda de 640 nm (Densidade Óptica, DO 640nm ) (ver Anexo I). Será ainda avaliada a concentração de células viáveis presente na cultura após 0,5 h de incubação. A avaliação da população viável basear-se-á na contagem de Unidades Formadoras de Colónias (UFC), através da realização de diluições sucessivas da cultura bacteriana e espalhamento das suspensões diluidas em meio de cultura agarizado adequado ao crescimento da bactéria em causa (ver Anexo II). 2. Procedimento experimental NOTA: todas as manipulações devem ser efectuadas cuidadosamente e em condições de esterilidade Para obter o inóculo a usar na experiência de crescimento, inocular uma colónia de Escherichia coli DH1 (fornecida em placa de Petri) em 25 ml de meio de cultura LB (v. composição no TP1), contido num frasco cónico de 100 ml rolhado com algodão cardado. Incubar a cultura, durante a noite, a 37 C, com agitação. (Nota: esta parte do procedimento será realizada pelo docente) 2.2. Para iniciar a experiência de crescimento, inocular 25 ml de meio de crescimento líquido LB contido num frasco cónico de 100 ml rolhado com algodão cardado, com um volume adequado do inóculo líquido preparado em O volume de inóculo a usar deverá ser calculado de modo a que a DO640nm da cultura no início do crescimento seja aproximadamente igual a 0, Avaliar, imediatamente, a Densidade Óptica (DO 640 nm ) da cultura correspondente ao início (tempo zero) do crescimento, usando o procedimento descrito no Anexo I.

8 2.4. Incubar, imediatamente, a suspensão celular preparada em 2.2., a 37 C e com agitação orbital (250 rpm). Iniciar a contagem do tempo Acompanhar o crescimento celular durante cerca de 2 horas (20 em 20 minutos), com base na leitura da Densidade Óptica da cultura ao comprimento de onda de 640nm como descrito no Anexo I. Diluir as amostras de modo a que o valor de DO640nm lido no espectrofotómetro não ultrapasse 0, Determinar a concentração de células viáveis (expressa em UFC/ml; UFC = Unidade Formadora de Colónia) na cultura após meia hora de incubação com agitação orbital a 37ºC. Para tal, proceder à contagem de Unidades Formadoras de Colónias (UFCs) como descrito no Anexo II. Nota: Ter o cuidado de homogeneizar sempre a suspensão celular antes da amostragem e após cada diluição. ANEXO I - ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA DA DENSIDADE ÓPTICA DA CULTURA Enquadramento: A avaliação da turbidez de uma cultura microbiana constitui uma forma rápida, embora indirecto, de estimar a concentração celular. Um feixe de luz focado numa suspensão microbiana é parcialmente desviado pelas células, sendo a percentagem de luz não desviada (% Transmitância, T) medida por recurso a um espectrofotómetro. A quantidade de luz que atravessa a suspensão celular depende da concentração de células na suspensão e do tamanho destas, da intensidade da luz incidente, do comprimento de onda da luz e do diâmetro do tubo que contém a suspensão celular. A Densidade Óptica (DO) da cultura corresponde ao valor da Absorvência (Abs). Este está relacionado com o valor da Transmitância (%T) com base na expressão Abs =-log(%t/100). Existe, dentro de certos limites, uma relação linear entre a DO da cultura e a concentração de células por mililitro de suspensão. Contudo, para suspensões celulares muito densas (por exemplo com DO superior a 0,4) menos luz é desviada por unidade de massa celular, pelo que é frequentemente necessário diluir as culturas de modo a que todos os valores de DO lidos estejam incluídos na parte linear da curva DO vs. concentração celular.

9 Este método não permite distinguir entre células viáveis e células mortas e não permite obter directamente valores absolutos da concentração de células, sendo especialmente utilizado quando se pretende confirmar se uma dada cultura se encontra em crescimento ou para acompanhar o crescimento celular pelo aumento da DO medida a um comprimento de onda particular. No presente trabalho, para medir a densidade óptica da suspensão bacteriana ao comprimento de onda de 640nm (DO 640nm ), recorrer-se-á a um espectrofotómetro PyeUnicam. Procedimento: 1. Ligue o espectrofotómetro e fixe o comprimento de onda a 640 nm, 10 a 15 minutos antes de proceder às leituras. 2. Calibre o espectrofotómetro com um Branco constituído por água destilada, fixando o valor da Absorvência a ZERO (corresponde a Transmitância igual a 100%). 3. Após homogeneização, por agitação em vórtex, da suspensão celular, proceda à leitura do valor da Absorvência 4. Registe os resultados experimentais na Ficha de Registo e Tratamento de Resultados fornecida a seguir. ANEXO II - CONTAGEM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLÓNIAS (UFC) Enquadramento: Após a realização de diluições sucessivas (1:10 ou 10-1 ) da cultura, é espalhado um volume conhecido (0,1 ml) de cada suspensão celular diluída sobre meio nutriente sólido apropriado para a multiplicação celular do microrganismo em causa contido numa placa de Petri. Pretende-se que as células fiquem distanciadas e que, após crescimento, originem colónias isoladas e visíveis a olho nu. O grau de diluição da suspensão celular deve ser escolhido de modo a que o número de colónias isoladas em cada placa seja aproximadamente > colónias e < 300 colónias. Por este processo contabilizam-se células capazes de se multiplicarem, isto é, células viáveis. Assume-se que cada colónia é originada a partir de uma única célula viável, o que nem sempre é verdade (p.e., duas ou mais células que formem um agregado darão origem a uma única colónia). Os resultados são normalmente expressos em termos de Unidades Formadoras de Colónias (UFC).

10 Procedimento 1. Em condições de assépsia, junto à chama do bico de Bunsen, faça uma diluição 10-1 (ou 1:10) de 0,1 ml da amostra de cultura colhida em 2.6. (dilua em 0,9 ml de solução salina - NaCl 0,9%(p/v) - contida em tubo Eppendorf). Partindo da amostra diluida 10-1, faça diluições sucessivas de 1:10 em solução salina, até à diluição 10-6 (1: ). Tenha o cuidado de homogeneizar, no vortex, a suspensão celular obtida após cada diluição. 2. Junto à chama do Bico de Bunsen, transfira 0,1 ml das suspensões celulares diluidas 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6 para a superfície do meio sólido LB agarizado contido em placas de Petri (previamente preparado como descrito no TP 1). 3. Em cada placa, espalhe a suspensão sobre o meio sólido recorrendo a esferas de vidro previamente esterilizadas (adicione cerca de 6-8 esferas por placa de Petri e agite homogeneamente e em várias direções, mantendo a placa na posição horizontal sobre a bancada). Sob a chama do bico de Bunsen, transfira as esferas de vidro para uma caixa contendo lixívia. 3. Identifique as placas de Petri convenientemente, e coloque-as numa estufa de incubação a 37 C durante 24 horas. 4. No dia seguinte, conte as colónias presentes em cada placa de Petri. 5. Com base nos resultados experimentais obtidos, estime a concentração de células viáveis presentes na cultura, expressa em UFC/ml (registar na Ficha de Registo e Tratamento de Resultados fornecida a seguir).

11 MEBiom Engenharia Genética A0 CRESCIMENTO EM DESCONTÍNUO DE UMA CULTURA DA BACTÉRIA Escherichia coli. FICHA DE REGISTO E TRATAMENTO DE RESULTADOS Estirpe: Meio de cultura: Temperatura ( C): I. Acompanhamento da curva de crescimento da população bacteriana através da medição da Densidade Óptica da cultura ao comprimento de onda de 640 nm (DO 640nm ) ao longo do tempo de incubação. Tabela 1. Evolução da DO 640nm da cultura em função do tempo de incubação em meio líquido LB, a 37 C. Tempo (min) DO 640nm da cultura Tabela 2. Estimativa da concentração de células viáveis na cultura bacteriana (expressa em UFC/ml), após 30 minutos de incubação em meio líquido LB, a 37ºC. Tempo (min) Diluição Nº colónias (placa de Petri) UFC / ml (na suspensão diluida) Valor médio: UFC / ml (na cultura) UFC = Unidades Formadoras de Colónias

12 II. Representação gráfica da curva de crescimento da cultura (representação semi-logarítmica da DO 640nm em função do tempo de incubação). III Na figura acima, indique o intervalo de tempo correspondente à fase exponencial do crescimento da população bacteriana. IV Calcule a taxa específica de crescimento e o tempo de duplicação da bactéria nas condições ensaiadas. D. IDENTIFICAÇÃO DO GRUPO (nomes e números):

13 3. OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA DE BACTÉRIAS (COLORAÇÃO GRAM) e DE LEVEDURAS 1. Observação microscópica de bactérias (coloração de Gram) A observação de microrganismos reveste-se de dificuldades não só devido à sua reduzida dimensão mas, também, porque estes são transparentes e práticamente incolores. Com o propósito de estudar as suas propriedades e/ou de diferenciar os microrganismos em grupos específicos para fins taxonómicos e de diagnóstico, recorre-se normalmente a técnicas de coloração. Procederá à coloração Gram e observação microscópica das bactérias presentes num iogurte (espécies Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus) e da espécie Escherichia coli. Culturas fornecidas. Iogurte - cultura mista de Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus.. Cultura pura de Escherichia coli em placa de meio LB sólido Procedimento Coloração Gram das bactérias do iogurte 1. Preparar um esfregaço, espalhando uma gota de iogurte numa lâmina previamente desengordurada com xilol, com uma ansa esterilizada na chama do Bico de Bunsen. Secar ao ar. 2. Desengordurar o esfregaço, cobrindo-o com xilol durante 1 minuto. Secar ao ar. 3. Fixar o esfregaço desengordurado, cobrindo-o com álcool etílico a 95%(v/v), durante 5 minutos. Secar ao ar. 4. Corar a preparação pelo método de Gram (ver Anexo I). 5. Observar ao microscópio com a objectiva de imersão (x 100). Desenhar as células e descrever a sua morfologia e cor. Concluir quanto à resposta (+ ou -) ao teste de Gram e à estrutura da parede celular das células.

14 Coloração Gram de células de Escherichia coli. 1. Preparar uma suspensão celular de E. coli em água destilada. Para tal, transferir para um tubo de ensaio contendo 0,2 ml de H2O esterilizada, um pouco da cultura pura fornecida, com uma ansa esterilizada. Homogeneizar a suspensão. 2. Preparar um esfregaço da suspensão celular preparada em 1., espalhando uma gota da suspensão celular numa lâmina desengordurada. Secar ao ar. 3. Para fixar o esfregaço pelo calor passar rapidamente a lâmina contendo o esfregaço pela chama do bico de Bunsen. Repetir este procedimento duas vezes. 4. Corar a preparação pelo método de Gram (ver Anexo I). 5. Observar ao microscópio com objectiva de imersão (x 100). Desenhar as células e descrever a sua morfologia e cor. Concluir quanto à resposta (+ ou -) ao teste de Gram e à estrutura da parede celular das células. 2. Levedura Procederá à observação microscópica, em preparação fresca, de células pertencentes à espécie Saccharomyces cerevisiae Prepare uma suspensão em água destilada esterilizada (contida em tubo Eppendorf) da cultura de S. cerevisiae fornecida em placa de Petri (meio sólido YPDA) Coloque uma gota dessa suspensão na superfície de uma lâmina desengordurada. Colocar uma lamela em cima Observe no microscópio óptico de contraste de fase com objectiva 40x (ampliação total: 400x) Registe as suas observações.

15 ANEXO I - Coloração Gram I.1. Cobrir o esfregaço da cultura em estudo, que foi previamente fixado à lâmina de vidro, com uma solução de cristal violeta. Deixar actuar durante 1 minuto. I.2. Escorrer o corante e lavar com água. Secar com papel de filtro, sem esfregar. Cobrir a preparação com reagente de Lugol e deixar actuar durante 1 minuto. I.3. Escorrer a solução de Lugol, lavar com água e secar. I.4. Diferenciar pelo álcool a 90%, deixando cair a solução de alcool gota a gota sobre a preparação até que não saia mais corante. I.5. Lavar com água, escorrer e secar com papel de filtro. I.6. Tornar a corar a preparação, durante 5 minutos, com uma solução de safranina. I.7. Escorrer o corante, lavar com água e secar. Observações: As células que se apresentarem coradas de violeta escuro (cor do complexo insolúvel resultante da associação do iodeto com a molécula do corante cristal violeta) são Gram positivas (Gram +). As células que apresentarem cor rósea (perderam a coloração violeta durante a diferenciação pelo álcool e retomaram a cor do reagente de contraste - safranina) são Gram negativas (Gram -). Este processo de coloração baseia-se no diferente teor lipídico da parede celular das células Gram + e Gram -. Em ambos os grupos de células, o corante cristal violeta é fixado no citoplasma. Nas células Gram -, cuja parede celular apresenta um elevado teor lipídico (devido à presença da membrana externa), grande parte dos lípidos são dissolvidos, os poros da parede celular tornam-se maiores e o complexo corado sai. Estas células tomam a cor do 2º corante. Nas células Gram +, a pequena quantidade de lípidos é dissolvida pelo álcool criando poros diminutos na parede celular que serão fechados devido à acção desidratante do alcool. Assim, o corante fica retido no interior das células.

16 ANEXO II. Soluções dos corantes Solucão de Cristal Violeta Solução A cristal violeta 1 g alcool 95% 10 ml Solução B Oxalato de amónio 0,8 g água destilada 80 ml Misturar as duas soluções. Reagente de Lugol Iodo Iodeto de potássio água destilada 1 g 2 g 300 ml Solução de Safranina Safranina 0,25 g (dissolvido em 10 ml de álcool etílico a 95%) água destilada 100 ml

17 MEBiom Engenharia Genética A0 OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA DE BACTÉRIAS e LEVEDURA FICHA DE REGISTO DE RESULTADOS Desenhe as células e estruturas observadas e associe-lhes uma legenda explicativa. A. BACTÉRIAS (coloração Gram). No lado direito de cada círculo, descreva a morfologia e cor das células. Indique o tipo de resposta (+ ou -) à coloração de Gram e descreva resumidamente a estrutura da parede celular das células. A1. Bactérias do iogurte A2. Suspensão de Escherichia coli observação com objectiva de imersão:100 x (ampliação total = 1000 x) B. LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae observação com objectiva de imersão: 100 x (ampliação total = 1000 x) observação com objectiva 40x (ampliação total: 400x) C. IDENTIFICAÇÃO DO GRUPO (nomes e números):