LEONARDO SILVEIRA VILLAR

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE ESTUDOS GERAIS INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA LEONARDO SILVEIRA VILLAR OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE METALOTIONEÍNAS POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA DE OSTRAS CRASSOSTREA RHIZOPHORAE (GUILDING, 1828) PARA APLICAÇÃO EM ESTUDOS AMBIENTAIS Niterói Abril/ 2006

2 LEONARDO SILVEIRA VILLAR OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE METALOTIONEÍNAS POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA DE OSTRAS CRASSOSTREA RHIZOPHORAE (GUILDING, 1828) PARA APLICAÇÃO EM ESTUDOS AMBIENTAIS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para a obtenção de Grau de Mestre em Química. Área de Concentração: Química Analítica Orientador: Prof. Dr. Ricardo Erthal Santelli Co-orientador: Prof.Dr. Mauro de Freitas Rebelo Niterói Abril/ 2006 ii

3 B 862 Villar, Leonardo Silveira Otimização de metodologia para extração e determinação de metalotioneínas por eletroforese em gel de poliacrilamida de ostras Crasostrea rhizophorae (Guiling, 1828) para aplicação em estudos ambientais/ Leonardo Silveira Villar. Niterói, RJ: [s.n], f.: il. Dissertação (Mestrado em Química) Universidade Federal Fluminense, Ostras ( Crassostrea rhizophorae). 2. Proteínas Metalotioneínas. 3. Eletroforese (SDS-PAGE). 4. Contaminação ambiental. I. Título. CDD iii

4 LEONARDO SILVEIRA VILLAR OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE METALOTIONEÍNAS POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA DE OSTRAS CRASSOSTREA RHIZOPHORAE (GUILDING, 1828) PARA APLICAÇÃO EM ESTUDOS AMBIENTAIS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para a obtenção de Grau de Mestre em Química. Área de Concentração: Química Analítica BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Ricardo Erthal Santelli - Orientador GEO /IQ/ UFF Prof.Dr. Mauro de Freitas Rebelo Co- orientador IBCCF UFRJ Prof.Dr. Richard Hemmi Valente FIOCRUZ Prof a. Dra. Silvia Maria Sella IQ - UFF iv

5 Niterói Abril/ 2006 AGRADECIMENTOS Aos meus pais pelo apoio, incentivo e motivação. Ao meu orientador Prof. Dr. Ricardo Erthal Santelli pela orientação, apoio, incentivo e paciência durante todo o curso. Ao meu Co-orientador Prof. Dr. Mauro de Freitas Rebelo pelos ensinamentos, apoio e críticas, fundamentais para o aprendizado e desenvolvimento deste trabalho. À CAPES pela bolsa concedida. Ao Prof. Dr. Marcelo Einicker Lamas (UFRJ) pelo apoio e suporte durante parte de meus experimentos e também ao Thiago pelo apoio e ajuda em experimentos realizados. Ao Dr. Richard Hemmi Valente (FIOCRUZ), pelos ensinamentos nos experimentos envolvendo eletroforese e sugestões metodológicas. Aos colegas de laboratório da UFF, UFRJ por todos os momentos em que dividimos, amizade e colaboração. Ao Dr. Francesco Dondero pela doação dos kits para dosagem por derivatização com bromobimano e pelas preciosas sugestões na extração das metalotioneínas. À todas as pessoas, que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho. v

6 SUMÁRIO LISTA DE TABELAS v LISTA DE FIGURAS vi LISTA DE ACRÔNIMOS vi RESUMO vii ABSTRACT viii 1. INTRODUÇÃO Separação de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) OBJETIVO Materiais e Métodos Reagentes e soluções Procedimento de limpeza Coleta de ostras Crassostrea rhizophorae Protocolos de extração Extração por precipitação com etanol (Viarengo et al., 1997) Extração através de tratamento térmico Separação de MTs por Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Estimativa da massa molecular das proteínas Quantificação de Metalotioneínas (derivatização com mbbr) Detecção imunológica das bandas contendo metalotioneínas Obtenção da diluição adequada de anticorpos (DOT BLOTTING) Imunodetecção RESULTADOS E DISCUSSÃO Extração e separação de proteínas Identificação e quantificação de MTs por Derivatização com mbbr Preservação de amostras Detecção imunológica das bandas contendo MTs CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44 vi

7 I LISTA DE TABELAS TABELA 1 Preparo do gel de empilhamento e fracionador 17 II LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Sítios para ligação com metais na metalotioneína 06 FIGURA 2 Indução e síntese da metalotioneína 07 FIGURA 3 Bromobimano (fórmula estrutural) 09 FIGURA 4 Ostra Crassostrea Rhizophorae 14 FIGURA 5 Representação esquemática do gel SDS-PAGE Tris-tricina 18 FIGURA 6 Dot Blotting 23 FIGURA 7 Gel SDS-PAGE 15%T, 2,67%C Tris-Glicina (Laemmli) 28 FIGURA 8 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C Tris tricina 30 FIGURA 9 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C (Ostras expostas à Cd 2+ ) 31 FIGURA 10 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C (Ostras expostas à Cd 2+ ) 32 FIGURA 11 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C (Bromobimano) 34 FIGURA 12 Curva analítica (mbbr) para gel demonstrado na Fig FIGURA 13 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C (Bromobimano) 37 FIGURA 14 Curva analítica (mbbr) para gel demonstrado na Fig FIGURA 15 Gel (Fig.14) visualizado em Coomassie Blue 38 FIGURA 16 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C (Amostras degradadas) 40 FIGURA 17 Membrana de nitrocelulose para imunodetecção 41 FIGURA 18 Membrana revelada após incubação de anticorpo 42 III LISTA DE ABREVIATURAS LCMM MBBr MTs TBS SDS-PAGE Laboratório de Cultivo de Moluscos Marinhos Bromobimano Metalotioneínas Tris Buffer Saline Eletroforese em gel de Poliacrilamida vii

8 IV RESUMO Neste trabalho de dissertação foram identificadas as melhores condições para a extração, isolamento e quantificação de metalotioneínas de ostras Crassostrea Rhizophorae (Guilding, 1828). Após a identificação do protocolo de extração mais adequado, as bandas protéicas referentes a estes extratos foram separadas utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio. Foram estudadas as melhores condições para a corrida eletroforética e revelação do gel. Foi testado o modelo proposto por Laemmli, que utiliza tampão contendo Tris e glicina, porém este não se mostrou adequado para resolver polipeptídeos de massas moleculares menores que 10 kda e desta forma não foi possível fazer a estimativa de suas massas moleculares. Então se testou o modelo proposto por Schagger e Von Jagow que utiliza tampão contendo tris e tricina, o qual se mostrou adequado para resolver polipeptídeos de massas moleculares menores que 10 kda, permitindo a visualização de bandas de até 2 kda. Para a quantificação de metalotioneínas foi utilizada a técnica de derivatização com bromobimano e, em paralelo, a transferência do gel obtido para membrana de nitrocelulose e imunodetecção. Os resultados obtidos mostraram que ambas as técnicas se mostraram bastantes específicas, podendo ser utilizadas em trabalhos de rotina. A derivatização com bromobimano possibilitou a quantificação da banda correspondente aos padrões de MTs e extratos contendo a metalotioneína. A técnica de imunodetecção confirmou, através da visualização das bandas contendo padrões e extratos, que estes aparecem na faixa de 7 kda e bandas menos nítidas devido a presença de uma forma dimerizada desta proteína. Foram utilizados padrões contendo bandas com massas moleculares conhecidas possibilitando assim uma estimativa da massa molecular das MTs. viii

9 V - ABSTRACT In this work, it was identified the best conditions to extract, isolate and identify metallothioneins in oysters Crassostrea rhizophorae (Guilding, 1828). After the extraction protocol identification, the bands containing proteins obtaind from extracts were separated using sodium dodecil sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). It was studied the best work conditions for electrophoresis and staining. It was tested the Laemmli model with Tris and glycine, but this model was not reliable for the separation of proteins with low molecular weight, below 10 kda. Those proteins are only partly or even not separated from the bulk of SDS. Then it was tested Shagger and Von Jagow model with tris and tricine buffer system. This model was enough to separate and to identify low molecular weight proteins, making possible the identification of protein with 2 kda molecular weight. For the quantification of metallothioneins it was used bromobimane that reacts with the cystein groups of MTs, making possible its identification and quantification. The fluorescence of the protein bands in the gel was evidenced with an transilluminator and a picture was taken using a camera. At the same time we made a western blotting to be shure about the localization of MTs bands. Western Blotting showed us that MTs bands appeared near 7kDa. The others bands observed (around 14kDa) are probably due to MTs oxidation and formation of intermolecular dissulfide bonds. ix

10 1 1 INTRODUÇÃO A Biota, em zonas costeiras, se encontra exposta a ameaças decorrentes de diversas atividades antropogênicas. Em particular destacam-se aquelas relacionadas ao despejo de efluentes ou poluentes tóxicos como, por exemplo, metais traço. As mais altas concentrações de contaminantes metálicos ocorrem em regiões costeiras de baixa profundidade, situadas próximas a centros urbanos industrializados. Estes ecossistemas se tornam vulneráveis a estes poluentes, que podem afetar diretamente as populações ou se acumular através da cadeia alimentar, com conseqüências para o homem (Baudrimont et al., 2005). Dentre esses contaminantes, destacam-se os metais pesados, pela sua abundância na crosta terrestre e alto potencial de toxicidade. Os metais pesados se encontram presentes sob diferentes formas no ambiente, especialmente como óxidos e hidróxidos. Ao alcançarem as zonas costeiras, eles podem reagir com os compostos da água do mar e alterar suas espécies químicas (formando sulfitos e sulfetos). Os íons metálicos podem reagir com o material orgânico dissolvido formando colóides metálicos que podem se adsorver ao material particulado em suspensão e argila, o que influencia sua disponibilidade para o meio (Carvalho et al.,1991). A concentração de metais totais em água do mar, sua biodisponibilidade e também sua concentração em organismos marinhos será uma função do metal traço envolvido (essencial ou não essencial), da origem do contaminante (urbana ou industrial) e do organismo em estudo. Todos estes fatores determinam em conjunto diferentes formas do padrão de distribuição destes metais em diferentes áreas (Carvalho et al.,1991).

11 2 As primeiras avaliações da qualidade do meio ambiente foram feitas por análises químicas dos compartimentos abióticos: alterações de ph, temperatura e oxigênio dissolvido, concentrações de diferentes metais na água e no sedimento. No entanto a determinação de metais pesados nesses compartimentos pode não refletir a biodisponibilidade desses compostos e menos ainda, a sua toxicidade. De acordo com Rainbow e Phillips (1993) a biodisponibilidade só pode ser apropriadamente medida pelo que é encontrado no tecido de organismos alvo. Por isso, o estudo da concentração total de metais em organismos fornece uma informação mais precisa do potencial dano desses contaminantes ao seu metabolismo e ao ambiente em geral (Bryan et al., 1980; Carvalho et al., 1991). Durante mais de 30 anos, a determinação de contaminantes nos tecidos dos organismos ditos sentinelas, tem sido a principal forma de avaliação da contaminação de ecossistemas costeiros. Programas de monitoramento com essa filosofia, como o Mussel Watch iniciaram nos anos 70 nos Estados Unidos e se espalharam por todo mundo, estando em vigor em muitas localidades até hoje (Cossa, 1989; O Connor, 1992 e 1998; GoldBouchot et al., 1995; Hunter et al., 1995; Amiard e Berthet, 1996; Hayes et al., 1998; Cantillo, 1998). Esses estudos levaram a noção de que também a toxicidade de um elemento só poderia ser corretamente avaliada utilizando organismos vivos (Cairns e Mount, 1992). Organismos indicadores do efeito da contaminação ambiental refletem o estado de saúde, respondendo prontamente, a um estresse de grande relevância toxicológica, e por isso podem ser utilizados como uma advertência indicadora da presença de contaminantes, antes que ocorram danos irreversíveis ao meio ambiente (Barea et al., 1994).

12 3 Moluscos bivalves são utilizados como organismos sentinelas da contaminação ambiental, através do monitoramento da concentração de metais considerados tóxicos nos seus tecidos (Cosson, 2000; Cajaraville et al., 2000). O sedentarismo e o hábito alimentar filtrador, fazem com que esses organismos estejam expostos a contaminantes em diversos compartimentos abióticos do ecossistema, favorecendo a concentração de poluentes em seus tecidos. Especialmente ostras do gênero Crassostrea têm sido amplamente utilizadas para avaliar contaminação em diferentes ecossistemas. Estes organismos destacam-se pela capacidade de acumulação de metais nos tecidos sem apresentar efeito tóxico, e a ampla distribuição ao longo do litoral brasileiro, indo do Paraná ao Rio Grande do Norte, tornando-se especialmente importante para estudos de avaliação de impacto ambiental (Ignácio et al., 2000; Rebelo et al., 2003). No Brasil, existem vários relatos de contaminação da água e organismos aquáticos por metais. Em alguns deles tem-se a ocorrência de bioacumulação em moluscos, devido à contaminação de sedimentos da Baía de Todos os Santos BA por Cd, Hg, Pb e Zn. Destaca-se também o despejo de esgoto urbano e rejeitos das industrias petroquímica e metalúrgica que contribuíram para a contaminação de sedimentos da Baía de Guanabara RJ por Cr, Cu, Mn e Zn. Finalizando, a Baía de Sepetiba RJ, destaca-se pela contaminação por Cd, Cu e Zn provocada por rejeitos de indústria metalúrgica (Eysink et al.,1987; Pfeifer et al.,1985; Jose, 1997). A região da Baía de Sepetiba apresenta um histórico de contaminação por Zn e Cd. Ostras coletadas na região estão presentes na alimentação da população local e também para a população da região metropolitana do Rio de Janeiro, e via cadeia alimentar, este alimento pode representar um potencial risco de saúde para o homem.

13 4 A organização mundial de saúde estabelece que a dose ingerida tolerada de cádmio não deva ser superior a 500mg de Cádmio por semana ( WHO Organização Mundial da Saúde). Moluscos e crustáceos apresentam níveis elevados de cádmio (acima de 1,0 mg. kg -1 ), mesmo quando procedentes de água consideradas não poluídas por metais traço. Apesar da concentração de metais nos tecidos revelarem sobre a biodisponibilidade, o processo de metabolização dessas substâncias até que elas apareçam incorporadas nos tecidos é lento. Alem disso, muitos trabalhos (Wallner - Kersanach et al., 2000; Rebelo et al., 2003; Amaral et al., 2005) mostraram que as ostras são ótimos bioacumuladores, mas não são bons depuradores. Com isso, iniciouse uma busca por mecanismos biológicos que pudessem dar uma reposta mais rápida e mais específica a exposição do organismo aos metais do meio. O termo biomarcador foi originalmente definido como alterações bioquímicas, fisiológicas ou manifestações celulares, promovidas por um estresse ambiental (Gutiérrez et al., 2003). Neste contexto, o conceito de biomarcador, utilizado numa forma mais restritiva, de acordo com estudo realizado por Gadd e colaboradores (1992), está relacionado a uma alteração bioquímica subletal resultando de uma exposição do indivíduo a um poluente tóxico. Por esta razão, qualquer sistema celular que sofre uma alteração fisiológica detectável sob a influência de um estresse ambiental específico ou poluente pode ser considerado um biomarcador celular. Moléculas envolvidas nesta alteração ou mudança fisiológica podem ser consideradas como um biomarcador molecular. Uma das respostas bioquímicas mais estudadas em células animais quando expostas a metais é a indução de metalotioneínas (MTs Vallee,1991; Engel e Brouwer, 1989). Em muitas espécies, por exemplo, moluscos, peixes e crustáceos, a indução à síntese das MTs por íons metálicos foi demonstrada, sugerindo o potencial uso de concentrações de MTs em organismos como biomarcadores de exposição a metais (Amiard et al., 2005).

14 5 As metalotioneínas são proteínas que apresentam massa molecular entre 6 e 7 kda, contendo aproximadamente 60 aminoácidos dos quais cerca de 30% correspondem a cisteínas (que contém grupos sulfidrila) que são sítios para ligações com metais (Stillman et al.1995). As MTs possuem alta afinidade por metais formando quelatos com íons de metais essenciais (Zn 2+, Cu 2+, etc) ou não essenciais (Cd 2+,Hg 2+, Ag +, etc) (Viarengo,1989). Apresentam diferentes afinidades por cátions metálicos (Hg 2+ > Cu 2+ > Cd 2+ > Zn 2+ ).Outra importante propriedade é que possuem estabilidade frente ao calor e ausência de aminoácidos com grupos aromáticos. As MTs foram descobertas em córtex renal de eqüinos (Margoshes e Vallee, 1957) como uma proteína com característica de se ligar ao cádmio. Esta propriedade foi posteriormente investigada e estas foram denominadas metalotioneínas (Kagi e Vallee, 1960). As MTs foram encontradas em muitos grupos de organismos como eucariotos e procariotos, vertebrados e invertebrados (Roesijadi, 1996). As MTs se ligam a 7 equivalentes de íons metálicos divalentes, com grande afinidade, através da formação de clusters (domínios) metal-sulfidrila (Kagi e Schaffer, 1988; Chang et al., 2006; Vergani et al., 2003), de acordo como representado na figura 1.

15 6 Figura 1 Sítios para ligação com metais presentes na metalotioneína. Os círculos denotam íons metálicos divalentes (ex. Zn 2+, Cd 2+, Mn 2+, Cu 2+ ). Acredita-se que as metalotioneínas possuem um significante papel no controle homeostásico de metais essenciais do grupo I-B e II-B (Zn 2+, Cu 2+ ) e o seqüestro de metais tóxicos (Cd 2+, Hg 2+ ). Estas são capazes de proteger a estrutura celular de interações não específicas com metais traço e promover a detoxificação de metais essenciais em excesso no interior da célula (Hamer, 1986; Viarengo e Canesi, 1991; Roesijadi, 1992; Viarengo e Nott, 1993). Estes metais aumentam a taxa de síntese da metalotioneína (Tessier et al., 1996). A figura 2 mostra um esquema da indução de metalotioneínas por metais pesados (Revisão em Roesijadi, 1996), através da indução e síntese da metalotioneína. Devido a esta ser uma proteína que é induzida quando ocorre exposição a metais traço, as MTs são consideradas um importante e específico biomarcador, detectando a resposta do organismo frente a poluentes inorgânicos presentes no ambiente marinho.

16 7 Quando metais não essenciais (Cd, Hg, Ag) entram na célula, ocorre uma inevitável competição entre estes e metais essenciais (Cu, Zn) por ligantes intracelulares como metaloproteínas e as MTs atuam na detoxificação como representado na figura 2. A afinidade in vitro da proteína decresce segundo uma sequencia hierarquica Hg 2+ > Cu +, Ag +, Bi 3+ >>Cd 2+ > Pb 2+ > Zn 2+ > Co 2+ o que mostra que o Zn é espontaneamente substituído por outros metais geralmente considerados mais tóxicos. Figura 2 Modelo da indução da Metalotioneína e recuperação de ligantes comprometidos através de uma ligação não apropriada com Cd neste exemplo (Roesijadi, 1996). Embora as metalotioneínas tenham sido amplamente utilizadas para identificar respostas devido à poluição por metais traço, existe evidencia de que em vertebrados (mamíferos e peixes) a síntese das metalotioneínas é estimulada por diferentes agentes que podem ser endógenos ou exógenos (Kagi, 1993), ou quando o organismo é submetido a estresses como frio ou calor e também atividade física em excesso (Viarengo et al., 1999).

17 8 A identificação, quantificação e caracterização estrutural das metalotioneínas constituem uma importante contribuição para o entendimento dos papéis específicos que a essa proteína desempenha nos organismos. Diferentes metodologias foram desenvolvidas para a determinação e quantificação de metalotioneínas através de técnicas eletroanalíticas, espectrofotométricas (U.V - visível), cromatográficas, ensaios de saturação por metal e métodos imunológicos. (Honda et al., 2005; Viarengo et al.,1997; Gharahdaghi et al., 1999) 1.1 Separação de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) As técnicas de eletroforese em gel de acrilamida são amplamente utilizadas para a separação de proteínas de um extrato. Os protocolos de extração das proteínas do organismo e as condições da separação por eletroforese devem estar de acordo com as características da proteína que se deseja visualizar. No caso das metalotioneínas muitos procedimentos distintos têm sido aplicados para extrair, identificar e quantificar essas proteínas oriundas da glândula digestiva de ostras. Primeiramente testou-se o tratamento térmico, que consiste no aquecimento do sobrenadante obtido após a homogeneização do tecido, precipitando proteínas de maior massa molecular (Erk et al. 2002). Outro protocolo utilizado foi o proposto por Viarengo e colaboradores (1997) que consiste na obtenção de uma fração contendo a metalotioneína parcialmente purificada através do tratamento das amostras com etanol e clorofórmio seguido pela precipitação utilizando etanol e HCl. Nos dias atuais, dois sistemas desnaturantes são mais empregados na avaliação das massas moleculares de polipeptídios, ou cadeias polipeptídicas presentes nas proteínas. Um deles é o sistema consagrado na literatura, Laemmli (1970), e o outro mais recente de Schagger e Von Jagow (1987). O segundo método

18 9 permite a resolução de pequenas proteínas utilizando menor concentração de acrilamida, uma vez que, quando se adota a utilização da glicina é necessário que o gel apresente um maior percentual de acrilamida. Além disso, o sistema Laemmli se mostra adequado para a resolução de proteínas de 100kDa até 20 kda. Porém proteínas abaixo de 20 kda não se separam adequadamente. Desta forma o modelo de Schagger se mostrou o mais adequado para este estudo. Independentemente do método de separação, a identificação das metalotioneínas não pode se basear apenas na massa molecular da proteína. Algumas técnicas são utilizadas para fixar as cisteínas dessas proteínas com um reagente fluorescente (Bromobimano figura 3). Associada a uma extração que privilegie o isolamento das proteínas de baixo peso molecular e a separação em gel de eletroforese, essa técnica pode confirmar o conteúdo de cisteína da proteína separada, caracterizando as MTs. Figura 3 Estrutura química do Mono-bromobimano. Uma outra possibilidade é a utilização de anticorpos contra a MT que podem revelar a proteína através de imunodetecção. O termo blotting se refere a técnicas de transferência de proteínas presentes em um gel de SDS-PAGE para uma matriz como uma membrana de nitrocelulose ou

19 10 PVDF. Obtêm-se então, após a transferência, as proteínas ligadas e imobilizadas nesta membrana. Ao mesmo tempo em que ocorre um aumento do tempo e complexidade devido a adição desta etapa após a separação eletroforética, tem-se como vantagem a alta sensibilidade e especificidade. Destaca-se também, maior acessibilidade às macromoléculas ligadas à superfície da membrana, quando comparada a estas dentro da matriz do gel. Dentre outras vantagens explicadas por Gershoni e Palade (1983), destaca-se que quando as macromoléculas estão imobilizadas em uma fina membrana, podem ser muito mais rápidas as reações de coloração e descoloração, incubações, lavagens, etc. A membrana contendo a metalotioneína permite a sua visualização através da imunodetecção de suas bandas. Este método apresenta as seguintes vantagens: (i) permite a ligação da MTs a anticorpos altamente específicos e reprodutíveis; (ii) é bastante sensível, possibilitando a identificação de até 30 ng de proteínas; (iii) não se utiliza componentes que oferecem risco à saúde do analista.

20 11 2 OBJETIVOS Geral: Este trabalho visa determinar um protocolo apropriado para extração, separação e identificação de metalotioneínas para estabelecer como rotina em laboratório. Específicos: 1. Adaptar e otimizar a metodologia para a separação e identificação de metalotioneína utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), através de um gel que proporcione uma boa resolução para proteínas de baixa massa molecular (região abaixo de 10 kda). 2. Identificar e quantificar as MTs pela alquilação de resíduos de cisteína das MTs utilizando o bromobimano. 3. Identificar e quantificar as MTs pela através de técnicas de imunodetecção como Imunoblotting com anticorpo policlonal anti-mt.

21 12 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Reagentes e soluções Todas as soluções utilizadas foram preparadas com reagentes de grau analítico e água de alta pureza (18,2MΩ.cm), purificada com sistema de filtração Milli-Q (Millipore). Os reagentes utilizados para a extração de proteínas, eletroforese e ensaios de imunodetecção foram provenientes da Sigma e Merck. Os padrões de massa molecular e de MTs utilizados nos experimentos foram adquiridos através da Sigma. 3.2 Procedimento de limpeza Para evitar contaminação a vidraria utilizada ficou de molho em Extran 5% e submetido a HNO 3 10% (v/v) por uma noite sendo posteriormente rinsados com água de alta pureza. O material utilizado na eletroforese, tais como cuba, espaçadores e vidros foram lavados com água destilada. Vidros, espaçadores e pentes foram submetidos à limpeza com etanol antes de sua utilização. 3.3 Coleta de Ostras Crassostrea rhizophorae. Foram utilizadas ostras de diferentes procedências para os diversos experimentos desse estudo. Ostras cultivadas na fazenda marinha da Universidade Federal de Santa Catarina foram gentilmente cedidas pelo LCMM. Ostras Crassostrea rhizophorae com aproximadamente 8 cm foram expostas a 2 concentrações de Cádmio (100 e 200 mg.l -1 ) por 48 e 96h. Após esse período os animais foram dissecados e seus órgãos internos fixados para posterior análise. Amostras de glândula digestiva foram processadas para extração de RNA com o reagente TRIZOL (Invitrogen). Após a remoção do sobrenadante contendo os ácidos nucléicos, o pellet remanescente foi

22 13 processado de acordo com as instruções do fabricante para extração das proteínas. Os extratos foram aplicados para comparação da expressão de MT em diferentes tempos e concentrações de Cd, além de testar a metodologia de extração proposta pelo fabricante, que permitiria dosagens de ácidos nucléicos e proteínas na mesma amostra. Ostras (Crassostrea rhizophorae) coletadas no mangue do Sapateiro - Guaratiba (Rio de Janeiro) foram utilizadas em extrações pelos diferentes protocolos propostos a seguir. Esses animais também foram utilizados para um experimento de exposição de 5 ostras em laboratório a 200 mg.l -1 por 48h. Ostras (Crassostrea rhizophorae), expostas à solução contendo Cd 2+, e coletadas na Ilha do Martins (Baía de Sepetiba) foram utilizadas em extrações pelos diferentes protocolos propostos a seguir, com a finalidade de testar a metodologia em amostras de animais expostos ambientalmente (nesse caso a Cd e Zn). No ambiente, as amostras de ostras foram coletadas utilizando espátula para removê-las das pedras. Foram coletadas cerca de 30 ostras com tamanho de concha variando de 5,1 a 7,0 cm. Após a coleta estas foram acondicionadas em sacos de malha plástica vazada e transportadas até o laboratório, aonde chegaram vivas e com as valvas firmemente fechadas. No laboratório, as ostras foram lavadas com água corrente, abertas e os tecidos moles foram cuidadosamente separados da concha utilizando uma pequena faca. A glândula digestiva foi isolada e a metalotioneína extraída imediatamente após a abertura da ostra (Figura 4).

23 14 Figura 4 Ostra Crassostrea rhizophorae ilustrando sua glândula digestiva, órgão utilizado na extração de Metalotioneínas. 3.4 Protocolos de extração Para a extração de proteínas foi utilizado glândula digestiva em virtude de este órgão apresentar mais alta concentração de MTs (Viarengo et al., 1989). Os protocolos utilizados para extração de proteínas se encontram detalhados abaixo, sendo o primeiro baseado em estudo realizado por Viarengo e colaboradores (1997). O segundo protocolo utilizado foi o proposto por Erk e colaboradores (2002). Metalotioneínas são propensas à oxidação, durante seu isolamento, devido ao seu alto teor de cisteína. Ocorre formação de pontes de sulfeto e as metalotioneínas podem sofrer dimerização ou, com outras proteínas, ser transformada em frações de maior massa molecular. Por isso, recomenda-se que durante todo o processo deve-se utilizar tampão desaerado ou na presença de um agente redutor. A etapa de homogeneização é seguida de centrifugação. O uso de uma centrífuga refrigerada é altamente recomendado.

24 Extração por precipitação com etanol (Viarengo et al., 1997). O tecido da glândula digestiva foi homogeneizado na proporção de 1 para 3 volumes de tampão 500 mmol.l -1 de sacarose, 20 mmol.l -1 do tampão Tris-HCl ph 8,6 e adição de 0,006 mmol.l -1 de leupeptina, 0,5 mmol.l -1 de PMFS (agente antiproteolítico) e 0,01% de beta mercaptoetanol (agente redutor). Deixou-se o material em repouso por 10 min e em seguida foi centrifugado a x g por 30 min. Ao sobrenadante contendo as metalotioneínas foi adicionado, para alíquotas de 1 ml, 1,05 ml de etanol absoluto gelado (-20ºC) e 80µL de clorofórmio. Deixou-se em repouso por 5 min e após este tempo de repouso as amostras foram centrifugadas a 6000 x g por 10 min a 4ºC. O sobrenadante, em alíquotas de 500 µl foi reunido e combinado com 40 µl de HCl (37%) e subseqüentemente com 3 volumes (1500 µl) de etanol absoluto gelado. A amostra foi mantida a -20ºC por 1 h e centrifugada a 6000 x g por 10 min a 4ºC. O pellet contendo as metalotioneínas foi então lavado com 870 µl de etanol absoluto gelado, 10 µl clorofórmio e 120 µl tampão de extração.o material obtido foi centrifugado a 6000 x g por 10 min e seco à temperatura ambiente. O pellet foi então solubilizado em SDS 1%(m/v). Dentre os reagentes utilizados no protocolo de extração de MTs, o β- mercaptoetanol garante um ambiente redutor (agente anti-oxidante) evitando a formação de dímeros devido a formação de pontes de sulfeto entre as MTs. Os agentes antiproteolíticos são utilizados devido à presença, de células digestivas que secretam enzimas proteolíticas (Viarengo et al., 1997). RNA também pode ser utilizado na extração como co-precipitante, melhorando a recuperação das metalotioneínas. Outra possibilidade é acidificar o meio facilitando a precipitação e proporcionando uma recuperação de aproximadamente 90% (Viarengo et al., 1997).

25 Extração através de tratamento térmico As amostras de glândula digestiva extraídas das ostras foram homogeneizadas em solução contendo sacarose 0,5 M, Tris-HCl 20 mm ph 8,6, leupeptina 0,006 mm, PMFS 0,5 mm (agente anti-proteolítico) e β-mercaptoetanol 0,01%. A solução foi então centrifugada a x g por 1 h a 4ºC. O sobrenadante contendo as metalotioneínas foi cuidadosamente separado do pellet com auxílio de uma pipeta e aquecido a 70ºC por 10 min. As amostras foram então centrifugadas a x g por 30 min e o sobrenadante contendo as MTs recolhido. 3.5 Separação de MTs por Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Os géis de SDS-PAGE foram preparados usando as proporções mostradas na Tabela 1. Utilizou-se um kitassato para o preparo dos géis, possibilitando assim fazer a sua desaeração por um período de 15 min, e posterior adição de persulfato de amônio e N,N,N,N tetrametil etileno diamino (TEMED). É importante explicitar que no preparo dos géis, após a montagem das placas (Mini Protean II), aplicou-se 3,2 ml do gel fracionador e 200 µl de H 2 O ultra pura impedindo assim o contato do gel com o ar durante a polimerização, cujo tempo é de aproximadamente 30 min. Depois de decorrido o tempo de polimerização, a água adicionada foi eliminada e foi adicionado o gel de empilhamento preparado como mostrado na Tabela 1. Para o preparo do gel foi utilizado uma solução estoque contendo acrilamida e bis-acrilamida 49,5%T, 3%C, e também o tampão do gel que contém Tris 3,0 M em SDS 0,3% e ph ajustado para 8,45.

26 17 Tabela 1 Preparo dos géis: Concentrador (4%); fracionador (16,5%), utilizando a solução estoque de acrilamida. Solução Função Gel fracionador (16,5%) Gel (4%) concentrador Volume (ml) Volume (ml) Acrilamida + Bis-acrilamida (49,5%T; 3%C) Tampão do gel Acrilamida é o monômero e a Bis-acrilamida é o agente de ligação cruzada Eletrólitos do meio Tris +, Cl - 3,33 0,50 3,33 1,55 Glicerol 1,10 - Persulfato de amônio Gerador de radicais livres 0,033 0,050 TEMED Catalisador 0,0033 0,005 H 2 O Milli-Q 2,24 4,17 Durante a corrida eletroforética foi utilizada uma solução tampão para o anodo, contendo Tris 0,2 M, com ph ajustado para 8,9. E outro tampão para o catodo contendo Tris 0,1 M, Tricina 0,1 M em SDS 0,1% com ph ajustado para 8,25. O pente de Teflon foi colocado imediatamente após a aplicação do gel de empilhamento, e aguardou-se 30 min para a sua completa polimerização. Após decorrido o tempo necessário, o pente foi cuidadosamente retirado, e formaram-se pequenas cavidades para a aplicação das alíquotas da solução contendo as proteínas extraídas (Figura 5).

27 18 Figura 5 Representação esquemática do gel SDS-PAGE Tris-tricina (16.5% T, 3% C). As frações contendo as metalotioneínas obtidas através da extração foram tratadas com tampão de amostra (0,4 ml de β-mercaptoetanol, 2,4 ml de glicerol, 8 ml de solução de dodecil sulfato de sódio 10% (m/v), 1 ml de tampão Tris-HCl 1mol.l -1 ph 6,8, glicerol, 5 mg Coomassie Blue G 250) e então aquecidas por 30 min a uma temperatura de 40ºC. As amostras foram então centrifugadas a x g por 5 min para posterior aplicação no gel. A eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS e utilizando tricina como trailing íon foi feita de acordo com Schagger e Von Jagow (1987) com algumas modificações. Utilizou-se uma concentração de acrilamida 16.5% T; 3%C para o gel fracionador e uma concentração de 4%T, 3%C para o gel concentrador. Trabalhou-se com dois tampões de corrida, sendo um tampão do catodo e o outro para o anodo.

28 19 O tampão de anodo é colocado na base da cuba, ou seja, no anodo o que pode ser denominado tampão de fora. O tampão do catodo deve ser colocado no interior da cuba e pode ser denominado tampão de dentro. A corrida foi realizada em temperatura ambiente em um sistema Mini Protean II Biorad, durante aproximadamente 2 h e 45 min, utilizando uma corrente de 10 ma para cada gel individualmente até a linha de frente atingir o gel fracionador, quando aumentou-se a corrente para 20mA. A corrida eletroforética foi acompanhada com migração de Coomassie G presente no tampão de amostra. Foram utilizados padrões de MT Sigma purificadas de fígado de coelho e rim de cavalo (Sigma). Os géis, após a corrida, foram lavados com água por 15 min (2 vezes) e mantidas em solução fixadora contendo metanol, acido acético, água (40:10:50%) v/v por 30 min. Esta solução foi então descartada e adicionou-se solução contendo Coomassie Brillant Blue R 250 0,25 % por 1 h sob leve agitação. Os géis foram então descorados com solução de ácido acético 10% (v/v) trocando esta solução a cada intervalo de 30 min até se atingir a visualização das bandas protéicas. Para cada amostra, as corridas eletroforéticas foram realizadas em duplicata verificando assim a reprodutibilidade das corridas. Os géis, após sua revelação, foram digitalizados utilizando um scanner e então descartados. Para algumas amostras contendo baixas concentrações de metalotioneínas (banda pouco nítida) foi utilizada a impregnação por prata por ser um modo de revelação mais sensível (aproximadamente 100 vezes quando comparado com Coomassie Blue R 250). Na Impregnação por prata, conforme recomendado pela Amersham, o gel foi fixado por uma noite em solução contendo metanol, acido acético, água (40; 10; 50%)

29 20 sob agitação moderada. A solução foi trocada e o gel foi submetido à agitação por 30 min. A solução anterior foi então desprezada e o gel sensibilizado por 30 min, sob agitação moderada, com etanol 30%, glutaraldeído 0,5%(v/v), tiossulfato de sódio 0.2% (m/v), acetato de sódio anidro 7% (m/v) em água. O gel foi então lavado 3 vezes (15 min) com água. Adicionou-se nitrato de prata 0,25% (m/v), formaldeído 0,04% (v/v) e deixou-se por 20 min, sob agitação moderada. Lavou-se duas vezes por 1 min com água e revelou-se com carbonato de sódio 2,5%(p/v), formaldeído 0,02% (v/v), tiossulfato de sódio 0,001% (m/v) em água por 2 a 5 min agitando com auxilio das mãos. A solução anterior foi descartada e foi adicionado solução de EDTA- Na 2. 2H 2 O 1,5% (m/v) em água, mantendo-se por 10 min, sob agitação moderada. Lavou-se com água três vezes por 5 min e após esta etapa o gel foi estocado em solução de ácido acético 1%. 3.6 Estimativa da massa molecular das proteínas Para se estimar a massa molecular de proteínas extraídas de ostras e separadas por SDS-PAGE, as bandas obtidas foram comparadas com as de um padrão de proteínas de massas moleculares conhecidas (5µg µl -1 ). Foram utilizados também padrões de metalotioneína purificada, extraídos de cavalo e coelho (Sigma). Estes padrões foram aquecidos durante 30 min a uma temperatura de 40ºC e posteriormente centrifugados a x g por 5 min antes da aplicação no gel. 3.7 Quantificação de Metalotioneínas (derivatização com mbbr) O pellet obtido no processo de extração de proteínas (Viarengo et al., 1997), após a etapa de precipitação com etanol absoluto, foi solubilizado em 50 µl do tampão de extração (Viarengo et al., 1997). Preparou-se a solução padrão de metalotioneínas contendo 1µg. µl -1. Foi retirado uma alíquota de 2µL e adicionou-se 48 µl do tampão

30 21 utilizado na extração. Amostras e padrões foram submetidos a uma rápida centrifugação a x g durante 30 segundos sob temperatura de 4ºC. As amostras foram posteriormente aquecidas a 65ºC durante 15 min, e com estas ainda aquecidas, foram adicionados 5 µl de bromobimano em cada uma, mantendo estas protegidas da luz. Por último foram adicionados 55 µl de uma solução contendo 1 µl de β- mercaptoetanol e 1 ml do tampão de amostra. As amostras ficaram em repouso por 5 min em temperatura ambiente e foram submetidas à centrifugação a x g por 1 min em temperatura de 4ºC. A partir desta etapa as amostras foram submetidas à corrida eletroforética (SDS-PAGE). Após a realização da corrida, o gel foi lavado com água durante 15 min trocando-se a água 2 vezes. Após a última lavagem foi adicionado ao gel uma solução fixadora contendo (metanol 50%; ácido acético 10%; água 40%). O gel permaneceu então sob leve agitação por 30 min. Desta forma, elimina-se também o excesso de mbbr que não tinha reagido. Caso seja necessário guardar o gel para ser utilizado no dia seguinte, esta etapa é fundamental. Após a obtenção da imagem digitalizada do gel, esta foi tratada com o programa ImageJ. Então foi obtida a curva de calibração e a quantificação das amostras. 3.8 DETECÇÃO IMUNOLÓGICA DAS BANDAS CONTENDO METALOTIONEÍNAS Os anticorpos (anti-metalotioneína) utilizados para o desenvolvimento deste trabalho foram produzidos por Sá (1999). De acordo com este estudo, os anticorpos foram obtidos utilizando uma bola implantada subcutaneamente em coelhos, e o autor explica detalhadamente esta técnica.

31 Obtenção da diluição adequada de anticorpos (DOT BLOTTING) Quadrados de nitrocelulose (NC) 0,22 µm, de 1,0 cm 2 foram colocados individualmente em poços de placas de cultura. Aplicou-se 20 µl de amostra contendo metalotioneínas extraídas de ostra Crassostrea rhizophorae sobre cada pedaço de nitrocelulose. Após sua aplicação na membrana, as amostras permaneceram em repouso em temperatura ambiente por 15 min para a completa secagem. Em seguida, foram bloqueadas com 500 µl da solução de leite desnatado 5% (m/v) e então permaneceram por um período de 1h em agitação. Foram preparadas as seguintes diluições do anticorpo primário: (1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:1000). Incubou-se 200 µl do anticorpo primário em concentrações crescentes por 1 h, em agitação no escuro. As membranas de nitrocelulose foram então lavadas com a solução estoque de TBS diluída em uma proporção 1:5 em agitação. A primeira lavagem com duração de 15 min e as duas seguintes com duração de 5 min. O anticorpo secundário, marcado com peroxidase, foi diluído em solução de leite desnatado 2,5% (m/v) preparada em TBS e Tween %(v/v) obtendo assim uma diluição de 1:4000. As membranas de nitrocelulose foram então incubadas com 200 µl de anticorpo secundário anti-coelho por 1 h em agitação, ausência de luz e lavadas com a solução estoque de TBS diluída na proporção 1:5 em agitação. Para a primeira lavagem, foi utilizado um intervalo de tempo de 15 min e as duas seguintes 5 min. Os complexos formados (antígeno - anticorpo) foram revelados através do método de intensificação da quimiluminescência pelo luminol utilizando Kit luminescente ECL (Amersham Enhanced Chemiluminescence Western Blotting). Os filmes foram revelados com HC-110 (Kodak) e fixados (fixador para raios-x dental/ Kodak) em câmara escura (Figura 6). Os reagentes 1 e 2 do Kit foram misturados na

32 23 relação 1:1. As membranas foram então incubadas durante 1 min nesta solução onde utilizou-se um volume aproximado de 2,2 ml. Removeu-se então o excesso destes reagentes. A membrana foi colocada em uma placa de vidro limpa e coberta com filme de PVC evitando a formação de bolhas. Em total ausência de luz, cortou-se um pedaço de filme um pouco maior que a membrana e fez-se a exposição durante 15 min. A revelação foi feita passando o filme pelo revelador até o aparecimento das bandas. O filme foi inserido em solução de ácido acético 2% e finalmente na solução fixadora até que o filme se mostre transparente. Posteriormente este foi lavado em água corrente e seco. Figura 6 Dot Blotting para a definição da diluição ideal do anticorpo primário Imunodetecção Padrões de Metalotioneína purificado de rim de cavalo e extratos foram submetidas a SDS-PAGE 16,5% como descrito nesta dissertação. Após a eletroforese, as proteínas contidas nos géis foram transferidas para membranas de nitrocelulose utilizando tampão de transferência contendo 25 mm Tris, 192 mm glicina, 20% metanol ph 8,3 (tampão de transferência) em um sistema vertical apropriado da Biorad Mini Protean II de acordo com o procedimento explicitado a seguir:

33 24 Após a eletroforese, o gel foi submetido à lavagem com o tampão de transferência para retirar sais e detergente por um período de 5 min. Cortou-se então a membrana de nitrocelulose em um tamanho semelhante ao do gel, sempre manipulando a membrana com o auxílio de luvas e pinça. Os papéis de filtro e esponjas foram saturados com tampão de transferência, e em um recipiente plástico foi montado o cassete de Blotting com o lado preto voltado para o pólo negativo e o lado transparente para o pólo positivo (a transferência ocorre do lado negativo para o positivo). Acima do lado preto foram colocadas na ordem a seguir: esponja, papel de filtro, gel, membrana, papel de filtro, esponja. As bolhas foram evitadas para garantir uma transferência uniforme. O cassete foi então fechado, colocado no suporte. Todo o conjunto foi transferido para o tanque de transferência e enchido com o tampão de transferência. Um recipiente contendo gelo também foi inserido dentro do tanque. A fonte foi então ligada a 100 volts constantes por 1 h. Após a transferência das proteínas, monitoradas através da utilização de um padrão de MT purificado, as membranas foram coradas com solução de vermelho de Ponceau 0,2%(m/v) e ácido tricloroacético 3% (v/v) com o objetivo de se verificar a eficiência da transferência (Figura 19). Esta foi então lavada com água e foi iniciada a fase de bloqueio. Incubou-se a membrana de nitrocelulose utilizando leite desnatado em uma solução 5% (m/v) em TBS (diluição 1:5 a partir da solução estoque) à temperatura ambiente, agitando delicadamente durante 1h. 100µL do anticorpo primário foi diluído em 5 ml de solução de leite desnatado 2,5% preparado em solução TBS contendo 0,01% de Tween 20. Obteve-se assim a diluição 1:50, considerada a mais adequada (Figura 6).

34 25 Incubou-se a membrana de nitrocelulose com o anticorpo primário por uma noite a 4ºC com o recipiente mantido protegido da luz. Após este período, esta foi submetida à lavagem com solução estoque de TBS (diluída na proporção 1:5), fazendo 5 lavagens. Cada uma teve a duração de 3 min e foi feita sob lenta agitação e temperatura ambiente. O anticorpo secundário foi então diluído em solução de TBS obtendo a diluição de 1:4000. A membrana permaneceu então 1 h incubada com o anticorpo secundário sob leve agitação à temperatura ambiente. Após o período de incubação a membrana foi submetida à lavagem 3 vezes com a solução diluída de TBS. Cada lavagem teve a duração de 3 min sob lenta agitação e à temperatura ambiente. A partir desta etapa, a membrana foi utilizada para revelação, seguindo o mesmo procedimento explicitado para o Dot Blotting.

35 26 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Extração e separação de proteínas Nos experimentos iniciais realizados para o desenvolvimento desta dissertação, foram testados diferentes protocolos de extração com o objetivo de realizar a identificação do mais adequado para a utilização futura em trabalhos de rotina. O protocolo de precipitação por etanol (Viarengo et al., 1997) para a avaliação da concentração de metalotioneínas em glândula digestiva de ostras foi obtido a partir do método de Dieter e colaboradores (1987), utilizado para tecidos de mamíferos. Para este trabalho, as amostras foram rigorosamente preparadas sob condições redutoras utilizando β-mercaptoetanol 0,01%, evitando a formação de produtos de maior massa molecular (>20 kda). Isto pode ocorrer devido à oxidação da metalotioneína através da formação de pontes de sulfeto durante a etapa de purificação. Este método consiste no fracionamento utilizando etanol e clorofórmio obtendo uma fração parcialmente purificada da metalotioneína seguido de uma precipitação utilizando etanol e HCl. Esta acidificação, provavelmente, leva à desestabilização dos clusters formados entre o metal e a metalotioneína. E finalizando, em uma última etapa, foi realizada uma lavagem final da metalotioneína utilizando uma solução contendo etanol e clorofórmio (87:1%) com o objetivo de eliminar possíveis contaminações residuais. O protocolo foi seguido com e sem a adição de HCl, e os resultados obtidos, mostrados na corrida eletroforética (Figura 8), revelam que a extração se mostrou eficiente. Foi possível a visualização de bandas suficientemente nítidas na região de 7

36 27 kda nos poços 3 e 6 da Figura 8. Em todos os poços foram aplicados iguais volumes dos extratos obtidos. O segundo protocolo utilizado (Erk et al., 2002), através do aquecimento (70ºC), ocorre à desnaturação e precipitação de proteínas de alta massa molecular obtendo um sobrenadante contendo as MTs, que são termoestáveis. O extrato, obtido de acordo com este protocolo, se apresenta no poço 7 (Figura 8) apresentando banda suficientemente nítida na faixa de 7 kda, onde se espera a visualização da banda referente as metalotioneínas. Ao se comparar o extrato 7 com os extratos 5 e 8 (Viarengo et al., 1997) foi possível à verificação de que ambas as extrações apresentaram resultados comparáveis (Figura 8). A figura 7 mostra um gel de eletroforese (Laemmli) para os extratos das amostras de ostras coletadas em Barra de Guaratiba. No primeiro gel, foi utilizado β- mercaptoetanol 0,01% (v/v) com o objetivo de testar a influência deste reagente sobre os extratos aplicados. Têm-se 5 colunas, sendo que numeradas de 1 a 3 correspondentes às replicatas de uma mesma amostra. No primeiro e último poço, foram plicados padrões de proteínas de massas moleculares conhecidas (de 14,40 a 94,00 kda). Para o segundo gel, onde não foi utilizado β-mercaptoetanol no tampão de corida, tem-se 4 colunas, sendo que numeradas de 1 a 3 que correspondem às replicatas de uma mesma amostra. No primeiro poço, foi aplicado padrão de proteínas de massas moleculares conhecidas (de 14,40 a 94,00 kda). Ao se atingir o término da corrida, os géis foram revelados com Coomassie Blue R-250 0,2% (p/v), Etanol 40%, Ácido acético 10% em água.

37 28 Figura 7 Imagem de um gel obtido por SDS-PAGE 15%T, 2,67%C para amostras de ostras coletadas em Barra de Guaratiba. As condições sugeridas por Laemmli não se mostraram eficientes para a visualização de bandas abaixo de 10 kda, mesmo utilizando o método de impregnação por prata para a revelação do gel. Então se testou a separação eletroforética como proposto por Schaggger e Von Jagow (1987), utilizando tampão contendo tris e tricina, onde foi possível a visualização de bandas de até 2 kda como mostrado na Figura 8. Este sistema se mostrou adequado para a identificação de proteínas na faixa de 2 a 10 kda, e sua superioridade se deve à introdução de tricina como trailing íon. O empilhamento de pequenas proteínas na presença de SDS é difícil porque pequenos peptídeos formam complexos proteína detergente (micelas) de tamanhos e cargas muito próximas (Andrews, 1986). A glicina (pk A 9,60) e a tricina (pk A 8,15) se comportam diferentemente no empilhamento de proteínas. A glicina, utilizada no sistema Laemmli, favorece o empilhamento de proteínas de maior massa molecular, porque sua migração é muito lenta no gel de empilhamento que apresenta ph ácido (Schagger et al., 1987).

38 29 Para uma faixa de ph usual de 6,8 a 8,8, utilizados no gel de empilhamento, a tricina apresenta maior velocidade de migração quando comparada com a glicina, mesmo tendo maior massa molecular. Isto ocorre porque, na migração, uma maior quantidade de tricina se encontra na forma aniônica favorecendo o deslocamento do limite de empilhamento para uma faixa de menor massa molecular (Schagger et al.,1987). A Figura 8 mostra um gel de eletroforese obtido para os extratos das amostras de ostras coletadas em Barra de Guaratiba RJ. Este gel apresenta 9 colunas, numeradas de 1 a 9. No poço 1 temos as bandas referentes ao padrão que contém proteínas de massa molecular conhecida (de 14,40 a 94,00 kda). No poço 2, temos as bandas referentes ao padrão de peptídeos que contém proteínas de massa molecular conhecida (de 2,51 a 16,95 kda). Nos poços 3 e 4, temos respectivamente as bandas do padrão de MTs de coelho e cavalo. Nos poços de número 5 até o nove foram aplicados os extratos obtidos, sendo que no extrato 5 e 8 foram aplicados iguais volumes dos extratos (20µL) submetidos ao protocolo de extração proposto por Viarengo e colaboradores (1997) sem a utilização de HCl para a precipitação das MTs. No poço 7 foi aplicado o extrato submetido ao protocolo térmico. Nos poços 6 e 9 foram aplicados extratos submetidos ao protocolo de extração proposto por Viarengo e colaboradores (1997) utilizando HCl para a precipitação das MTs.