PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM DEAE -CELULOSE

Transcrição

1 PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM DEAE -CELULOSE Os assuntos abordados nessa aula são: - Dosagem de proteínas - Métodos cromatográficos para separação de proteinas e para a separação de imunoglobulinas

2 Métodos de Isolamento de Biomoléculas O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D e a compreensão de suas propriedades biológicas. Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez. Métodos de purificação 1 proteína isolada Proteínas de uma célula

3 Métodos de Isolamento de Biomoléculas Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis. Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias: Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas: 1. Tamanho Massa Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração) 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese) 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um reagente de fácil obtenção, disponível comercialmente)

4 MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) SOBRENADANTE ORGANELAS F 1 F 2 F 3 F 4 F 2.1 F 2.2 F 2.3 Precipitação com Sal/Solvente Precipitação com Sal/Solvente Lisossomos Mitocôndria Golgi Núcleo O fluxograma ao lado representa a marcha de purificação de uma proteína, mostrando as etapas sucessivas, cada uma consistindo de método, que levam ao isolamento de uma proteína presente numa mistura complexa. Observe a quantidade de proteínas (100g) presente no material inicial e quanto da proteína purificada se obtém no final (0,001g). Esses números são típicos para a purificação da maioria das proteínas, em especial enzimas. Cromatografia Troca Iônica F F F 2. 3.N F 2.3.N.X Gel Filtração 1 Proteína apenas (0.001g) a 0.5% total Cromatografia Troca Iônica (ph ou resina diferente) Em cada etapa, a proteína de interesse é separada das demais com base em uma propriedade diferente. Consequentemente, as proteínas ainda misturadas com aquela que está sendo isolada são cada vez mais semelhantes em suas características físico-químicas, exigindo métodos cada mais sensíveis, capazes de explorar pequenas diferenças, para se chegar à proteína pura.

5 Métodos para medida do conteúdo de proteína: Reagente de Biureto: sulfato de Cu 2 em tartarato Cu 2 reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 1. Cu 2 é quelado pela proteína [Cu 2 -proteina] 2. Reação redox Cu 2 (ligações peptídicas) > [Cu -proteína] Método de Lowry Ìons Cu 2 reduzidos a Cu em presença de proteínas e cadeias laterais de aminoácidos aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfomobidênio-tungstênio), dando um composto de cor azul. BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline Reagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-250 Método baseado em uma mudança espectral do reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor azul), quando interage com proteínas. Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina. Ìons Cu 2 reduzidos a Cu em presença de proteínas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul,

6 2.- Materiais e Método para preparação da coluna dedeae celulose para a separação de Ig G bovina Materiais DEAE celulose previamente embebido e carregado por tratamento com soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH) Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de amônio e dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna de DEAE celulose. A concentração protéica dessa coluna deve ser previamente determinada Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e preparada para ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de cânulas de pequenas pinças para regulagem do fluxo da coluna Tampão fosfato 0,01M ph 8, Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados com a numeração de 1 a 15.

7 2.2.- Método: Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar abrindo cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna para 12 gotas por minuto. Quando não houver mais tampão acima da resina e com a coluna fechada, deve ser adicionada a solução de gama globulina, com muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida, abrir vagarosamente a coluna para deixar a solução de gama globulina entrar na resina, fechando a coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado de modo a permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir o fluxo da coluna, começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o fluxo novamente para 12 gotas por minuto Testar de cada fração colhida, por coloração rápida e com reativo apropriado em uma microplaca, a presença de proteína, misturando-se l da fração com l do reativo Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no comprimento de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M ph 8, Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene a -20ºC para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese.

8 Gama-Globulina 12 gotas/min Assunto 04- figura 01 3ml

9 Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou quando colocadas em meio com ph próximo ao seu ponto isoelétrico. Proteína P.I. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Proteínas colocadas em meio com ph igual ao seu PI tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam a camada de solvatação menos organizada. Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1 Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas Solvente Água Dimetilformamida Metanol Etanol Acetona Clorofórmio Benzeno Constante Momento Dielétrica Dipolar Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação das proteínas. Os mais utilizados são etanol e acetona.

10 Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação. Membrana de celofane solvente Aos precipitados obtidos com sal ou solvente, adiciona-se água. Ao precipitado obtido com variação de ph, retornar ao ph original. solução a ser dialisada início Dt final Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise. -amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d. - o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja - excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente - após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.

11 Concentração Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas. Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia: Tempo zero Tempo 1 Tempo 2 Tempo n Amostra com diferentes componentes Resina embebida em tampão Mais tampão é colocado na coluna, forçando os componentes da amostra a interagirem com a resina Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de tampão Líquido que sae da coluna é recolhido em tubos de um coletor de frações Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como: massa molecular carga elétrica solubilidade afinidade Coletor de frações Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia. Tempo ou volume

12 Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades? Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: separação de moléculas pela massa molecular géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros Cromatografia de troca iônica: separação de moléculas pela carga elétrica géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica): separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso géis possuem carácter hidrofóbico Cromatografia de afinidade: separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante géis possuem ligante específico ligado covalente à resina

13 Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular proteína grande proteína pequena Tampão empurra moléculas através da resina Moléculas com massas diferentes Fluxo do tampão grão da resina poroso tubos grãos (beads) da resina com poros Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de volume morto (Vo). Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).

14 Massa molecular (kd) Absorbância a 280 nm Medida da ativ. biológica A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo Curva de calibração Observa r a escala log Além de purificar, por ser realizada em condições de ph, força iônica e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo. Para isso, é necessário calibrar a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gelfiltração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular. Moléculas maiores traçado da medida de atividade biológica nas frações Moléculas menores Ler a massa correspondente ml volume Kav de eluição ml Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao. volume

15 Cromatografia de troca iônica A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de ph. DEAE CM Trocadora de ânions Trocadora de cátions Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

16 Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose): A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 1) adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga; 2) eluição das proteínas adsorvidas. Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (ph ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina. Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentração do sal no tampão, pois alterações de ph podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna. Adsorção Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna Na Cl - Eluição Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.

17 Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico das proteínas na amostra e das condições escolhidas de ph e de força iônica. Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas Proteína P.I. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1 Proteínas apresentam carga positiva quando em meio ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em meio alcalino em relação ao seu pi. Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido ou básico é o PI da proteína, e não o ph do meio. ácido PI neutro básico - -COOH -NH 3 H -COO -NH 2 H A carga das proteínas varia em função do ph do meio, pois o ph influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos aminoácidos ácidos e básicos. -

18 Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o ph do tampão de eluição. As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente arrastadas pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina). CM (-) (-) (-) Eluição NaCl M M M DEAE _ () () () = _ = Eluição NaCl M M M (-) = = Não retidas () Não retidas Carboximetil~celulose (trocadora de cátions) Dietilaminoetil~celulose (trocadora de ânions)

19 Tipos de Resina de troca Iônica Tipos de Resina de troca Iônica NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH 2 N (CH 3 ) 3 Troca aniônica resina de polistireno Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO - 3 H Troca Catiônica resina de polistireno DEAE - celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas - CH 2 CH 2 N (C 2 H 5 ) 2 ácidas e neutras CM - celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas - CH 2 COOH básicas e neutras DEAE - Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração básico - CH 2 CH 2 N (C 2 H 5 ) 2 e troca iônica de proteínas ácidas e neutras CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração ácido - CH 2 COOH e troca iônica de proteínas básicas e neutras * Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio Rad Laboratories Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

20 Cromatografia de afinidade: Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas. A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes (eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H) ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto). Partículas de gel recobertas de anticorpos anti-a Coluna empacotada com esse gel Ex: cromatografia de imunoafinidade Adsorção Mistura de proteínas Lavagem Desprezar proteínas não retidas Eluição ph 2,0 ou sal Anti-A interage apenas com a proteína A Antígeno A puro Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no ph e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre - Complexo Ag-AC é desfeito

21 Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade 1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo - análogos de substratos ou inibidores de enzimas - agonistas ou antagonistas de receptores - haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos - ligantes com tag ou marcação - glutationa-s-transferase - poli-histidina 2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos: Ligante grupo-específico Proteína A Proteína G Concanavalina A Cibacron Blue lisina arginina benzamidina calmodulina heparina Metais de transição Especificidade Região Fc de IgG Região Fc de IgG Grupos glicosil- ou manosil- Várias enzimas, albumina Plasminogênio, RNA ribossomal proteinases tipo tripsina proteinases tipo tripsina Proteínas reguladas por calmodulina Fatores de coagulação, lipases, hormônios, receptores estoróides, etc Proteínas e peptídeos com resíduos de His expostos 8-AEA-cAMP 8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate (ligante para proteínas com afinidade por camp ou cgmp) Sítios de ligação das proteínas A, G e L à imunoglobulina, que permitem a purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade

22 Preparo da resina de afinidade: Passo 1. Ativação da resina Estratégias para acoplamento de ligantes à resina Reagente Alvo no ligante Passo 2. Acoplar o ligante Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade ou impede sua ligação à resina. A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco. Braço espaçador covalente entre a resina e o ligante ligante Molécula-alvo (analito) Ligação reversível não covalente