Técnicas de Purificação

Transcrição

1 Maria Alice Zarur Coelho Priscilla Filomena Fonseca Amaral Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

2 Introdução Meios de fermentação: - produtos extracelulares (solúveis e insolúveis), - produtos intracelulares, - fragmentos de células, - microrganismos intactos - substratos ou demais componentes não convertidos em produto. Diversidade: métodos de separação passíveis de utilização é muito vasto. suspensão diluída processo de separação e/ou purificação composto altamente purificado Quatro etapas similares, que ocorrem seqüencialmente: - remoção de material insolúvel Separação - separação dos produtos - purificação Purificação - polimento (geralmente associado a cristalização)

3 Etapas de Recuperação Separação Operações Unitárias: - centrifugação Remoção de material insolúvel - filtração - adsorção, Separação de produtos - extração com solvente Duas etapas vêm sendo combinadas em um único estágio; Nota-se um grande aumento da concentração do produto nesta fase

4 Etapas de Recuperação Separação Enzimas extracelulares: - Resfria-se o meio fermentado a 5 C (estabilidade e evitar contaminação) - ph ajustado Fungos filamentosos: - centrifugação - ou filtração (filtro-prensa/ filtro rotativo a vácuo) Leveduras e Bactérias: - prévia floculação (sulfato de alumínio, CaCl 2 ) - centrifugação - ou filtração (filtro-prensa/ filtro rotativo a vácuo)

5 Etapas de Recuperação Separação Enzimas hidrolíticas: centrifugação - bactérias gram-positivas tais como Bacillus subtilis (produtora da protease subtisilina) - bactérias gram-negativas como Klebsiella pneumoniae (produtora da pululanase): presença de membrana externa complicações: liberação apenas parcial da enzima no meio.

6 Etapas de Recuperação Extração Enzima localizada na parte externa da membrana celular (mas não é extracelular) liberação da enzima: destruição parcial ou total da célula (exemplo: autólise das células a 50 o C durante 14 horas). Obtenção de enzimas intracelulares: Técnicas de lise celular: - métodos físicos, - métodos químicos, - métodos enzimáticos

7 Etapas de Recuperação Extração Métodos enzimáticos: - Utilização de enzimas que catalisam a digestão de parede celular: Lisozima bactérias Glucanase, tripsina e protease leveduras - Pouco usado industrialmente: alto custo

8 Técnicas de Purificação Etapas de Recuperação Extração Tratamento prévio com EDTA Métodos enzimáticos: Ação da lisozima: hidrólise das ligações glicosídicas beta 1,4 entre resíduos do ácido N-acetilmurâmico (Mur2Ac) e N-Acetil-D-glucosamina (GlcNAc) num pepitídeoglicano

9 Etapas de Recuperação Extração Métodos enzimáticos: Glucanase, tripsina e protease leveduras

10 Etapas de Recuperação Extração Métodos químicos: - tratamentos com bases (NaOH) enzima tolerante a alto ph - choque osmótico (variação da concentração de soluto presente no tampão): Extrato resultante com pouca contaminação Bactérias Gram-positivas: alta pressão osmótica interna - tratamento com detergentes (Tween, laurilsulfato de sódio, triton) Agem sob condições de baixa força iônica, combinando as lipoproteínas da membrana para formar micélios - tratamento com solventes orgânicos (álcool isopropílico, etanol).

11 Etapas de Recuperação Extração Métodos físicos: - Congelamento / descongelamento: formação de cristais de gelo intracelulares Demorado Pode inativar enzima - Moagem com abrasivos: moinhos vibratórios com esferas de vidro largamente empregada Opera em batelada ou contínuo Necessita de sistema de resfriamento - Mixers ou liquidificadores: tecidos animais e vegetais

12 Etapas de Recuperação Extração Métodos físicos: - Cisalhamento líquido: passagem por pequenos orifícios sob alta pressão - Sonicação: aparelhos de ultrassom altíssimas frequências ruptura das células por cavitação Não muito aplicada em escala industrial O extrato enzimático contém muitos componentes celulares. Em particular, as células bacterianas lisadas liberam elevadas quantidades de ácidos nucleicos.

13 Etapas de Recuperação Extração Extração a partir de Tecidos Animais e Vegetais - Tecidos animais: similares às técnicas empregadas em leveduras Homogeneização do tecido selecionado em uma solução tampão adequada é a técnica mais amplamente empregada. Segundo passo: se utiliza a centrifugação diferencial para selecionar a subfração celular apropriada. - Tecidos vegetais: Forças necessárias são elevadas Presença de compostos fenólicos facilmente oxidados

14 As características das etapas de um processo de purificação são, em grande parte, determinadas pela natureza do produto final e pela sua aplicação Existe necessidade para a purificação completa de uma enzima? Maioria das aplicações: suficiente um menor grau de purificação ainda que existam algumas atividades contaminantes desde que não afetem substrato(s), produto(s) ou enzima(s) envolvido(s) em um processo específico. Existem algumas aplicações (na medicina clínica, área farmacêutica, análises específicas, projeto de biosensores, engenharia genética) onde é essencial que a proteínas contaminantes sejam reduzidas ou completamente eliminadas.

15 Cuidados devem ser tomados para que ao passar de uma etapa a outra mínimas alterações nas condições de estabilidade, ph, temperatura, etc. sejam promovidas. As enzimas são moléculas de elevado peso molecular, cujas funções dependem de uma estrutura altamente ordenada. Tamanho, carga, hidrofobicidade, solubilidade e atividade biológica são as principais características proteicas utilizadas na etapa de purificação das proteínas

16 Concentração Precipitação - A solubilidade de uma proteína é o resultado de: interações polares com o solvente aquoso, interações iônicas com os sais presentes, forças eletrostáticas de atração e repulsão. - O desempenho do processo de precipitação depende também da composição da solução, incluindo as propriedades das demais proteínas presentes (coprecipitação). - Outros fatores determinantes na solubilidade das proteínas: ph, temperatura e força iônica.

17 Concentração Precipitação Isoelétrica: - Ponto isoelétrico: ph no qual as proteínas apresentam a carga líquida igual a zero. não ocorre migração das molécula se submetidas a um campo elétrico. Abaixo do PI: forma catiônica Acima do PI: forma aniônica. - Quanto maior o caráter iônico: maior a tendência à solvatação.

18 Concentração Precipitação com sais inorgânicos: - Sais inorgânicos neutros (NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4 ) que promovam a precipitação seletiva das proteínas. - Efeito salting-out: dependente da hidrofobicidade das proteínas. - Distribuição de grupos hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície da molécula de proteína: afeta enormemente sua solubilidade frente a vários solventes. Grupos hidrofóbicos: papel importante no comportamento das moléculas proteicas, devido à carga e aos grupos polares que apresentam;

19 Concentração Precipitação com sais inorgânicos: - A força iônica mede a concentração das cargas em solução. Variação da força iônica (concentração do sal) no meio. Solubilidade aumenta exponencialmente com a concentração do sal, passa por um máximo e depois decresce.

20 Concentração Precipitação com sais inorgânicos: - Salting-in: forças de atração entre os íons da proteína e os íons do sal; íons do sal: muito hidratados - contribuem para o aumento da camada de hidratação da molécula, favorecendo o aumento da solubilidade. - Salting-out: Aumento da concentração iônica decréscimo na atividade da água redução das interações entre a água e os grupos polares das proteínas Ptn s mais susceptíveis à aglomeração O fenômeno da salting out é bastante apreciável no ponto isoelétrico, onde a repulsividade eletrostática passa por um mínimo.

21 Concentração Precipitação com sais inorgânicos: Sulfato de amônio: - barato e de fácil obtenção; - não é tóxico; - alta solubilidade mesmo em baixas temperaturas; - efeito estabilizante em algumas proteínas, sendo normalmente utilizado no processo de armazenagem de enzimas comerciais; - alta concentração deste sal previne ação proteolítica e bateriana, o que reduz as perdas de atividade enzimática. OBS: a adição do sal deve ser lenta e sob agitação para favorecer a homogeneização

22 Concentração Precipitação com solventes orgânicos: - A adição de solventes orgânicos (acetona e álcool): diminui a sua solubilidade. abaixamento da constante dielétrica da solução, ou seja, diminuição da atividade da água. - Constante dielétrica: medida da polaridade do solvente, ou seja, da capacidade que ele apresenta de se colocar entre dois íons de cargas opostas e separá-los, solvatando-os. Constante dielétrica da água: muito elevada A água separa os íons de carga oposta, solvatando-os, e mantendo a proteína em solução. O solvente já o faz com mais dificuldade, permitindo maior atração entre as moléculas proteicas.

23 Concentração Precipitação com solventes orgânicos: - Os solventes devem ser usados somente a baixas temperaturas (< 0 o C); - O uso de solventes tem diminuído nos últimos anos; - Mais usados: metanol, etanol e acetona inflamáveis; - Vantagem: recuperação do solvente para reutilização.

24 Concentração Precipitação com polímeros: - Polietilenimidas e polietilenoglicóis de diferentes pesos moleculares. - Mecanismo de precipitação: é similar ao existente com solventes orgânicos e resulta da mudança na solvatação das moléculas proteicas pela água. - Acredita-se que as moléculas de polímero ocupem o lugar das moléculas proteicas na solvatação. - Muitas enzimas precipitam com concentrações de polímero variando entre 15 e 20%.

25 Concentração Ultrafiltração: - Princípio: Uma membrana semipermeável permite a separação das moléculas de solvente das moléculas enzimáticas grandes porque apenas as moléculas pequenas podem penetrar na membrana quando a pressão osmótica é excedida. - O processo de ultrafiltração é empregado para concentração, dessalinização e fracionamento. - A força motriz é a diferença de pressão entre os lados da membrana.

26 Concentração Ultrafiltração: Vantagens do processo: - utiliza baixas pressões hidrostáticas; - não ocorre mudança de fase; - não utiliza reagentes químicos; - mantém força iônica e ph da solução concentrada; - evita desnaturação e inativação das enzimas. Desvantagens: - Concentração por polarização (acúmulo de moléculas grandes perto da superfície da membrana), - Formação de camadas de géis na membrana (reduz-se através da manutenção de escoamento turbulento ou laminar com alta vazão) - fouling (deposição) na membrana (especialmente agentes anti-espumantes usados nas fermentações ocasionam depósitos).

27 Concentração Ultrafiltração: - Materiais: Acetato de celulose e polímeros orgânicos (polisulfonas e polipropileno) - Fluxo inversamente proporcional a resistência. Como minimizar a resistência? - Aumentando o tamanho dos poros (até o máximo) - Aumentando a quantidade de poros; - mínima expessura da membrana; - Máxima hidratação da membrana; - Mínima viscosidade da solução;

28 Concentração Liofilização: - Concentração dos sais presentes na solução inicial - Pode provocar perda na atividade enzimática - Uma vez ativa em forma de pó: mais estável do que em solução aquosa - Cuidado: não descongelar durante o processo

29 Cromatografia A cromatografia pode ser considerada como uma separação diferencial dos componentes de uma amostra entre uma fase móvel e uma fase estacionária. Fase estacionária: partículas esféricas de um material insolúvel empacotado em uma coluna; A mistura de enzimas é introduzida na coluna pela fase móvel e forçada a migrar através da coluna; As enzimas que possuem maior atração pela fase estacionaria irão migrar de forma diferenciada das que tem maior afinidade pela fase estacionária.

30 Cromatografia Cromatografia de gel-filtração (permeação em gel, exclusão por tamanho ou peneira molecular) - Para o fracionamento e purificação de proteínas e aplicável à determinação de seus pesos moleculares. - Moléculas são separadas de acordo com seu tamanho efetivo quando em solução, utilizando matrizes (ou géis) com porosidade definida. Estabilidade, rigidez, tamanho de partícula, distribuição de poros e inércia química são fatores que podem afetar o tamanho da coluna, a vazão a ser adotada e a eficiência de separação. - Definição: partição difusional das moléculas de soluto entre a fase móvel, constituída pelo solvente, e a fase estacionária formada pelos poros do gel.

31 Cromatografia Cromatografia de gel-filtração - Gel: matriz tridimensional, aberta, formada por ligações cruzadas, contendo poros de diferentes tamanhos que permitem o acesso de apenas algumas moléculas. Ex.: matrizes formadas por ligações cruzadas de dextranas (Sephadex): Moléculas maiores: eluídas mais rapidamente; Moléculas menores: movem-se mais lentamente por terem um maior caminho a percorrer.

32 Cromatografia Cromatografia de gel-filtração -Escolha do gel: depende da finalidade - Separação de moléculas maiores (enzima) de menores (sais): geis com poros pequenos - Separação de moléculas de tamanho próximo: géis que fracionam várias faixas de peso molecular - Parâmetros críticos para a otimização do processo de gel-filtração: - volume da amostra; - concentração da amostra; - vazão adotada; - altura do leito da coluna.

33 Cromatografia Cromatografia de gel-filtração - Vantagens: - não utilização de energia, - forças cisalhantes desprezíveis, - sistemas simples de automação - altas recuperação aliadas a máxima resolução. - Desvantagens: - quantidade de amostra aplicada: máx 1-2% do volume total da coluna; - géis, Sephadex e Sepharose (agarose), tendem a empacotar; - problemas de diluição no processo de eluição da coluna.

34 Cromatografia Cromatografia de gel-filtração - Equipamento: coluna, detector de UV coletor de frações Controle de fluxo (bomba peristáltica) - Utilizada para etapas finais de purificação, mas pode ser usada na dessalinização e na determinação de pesos moleculares.

35 Cromatografia Cromatografia de Troca-iônica - Fracionamento de substâncias biológicas que apresentem semelhanças em suas propriedades químicas e fisico-químicas, - Método de fracionamento baseado na fixação de substâncias carregadas a um suporte que contém uma carga oposta. A separação ocorre porque as interações eletrostáticas entre os grupos são reversíveis e dependentes da afinidade de cada substância pelo trocador. Esta afinidade é função do ph do meio, da temperatura, da força iônica, do tampão, etc.

36 Cromatografia Cromatografia de Troca-iônica - Suportes: trocadores iônicos ou resinas, sendo normalmente empregados em colunas. As resinas são obtidas pela introdução de grupamentos polares em matrizes insolúveis em água. Ex.: Celulose, poliacrilamida, géis de dextrana e copolímeros de estireno e divinilbenzeno. - Classificação: Permutadores de cátions: grupamentos ácidos (ativos em ph > pk) Permutadores de ânions: grupamentos básicos (ativos em ph < pk)

37 Cromatografia Cromatografia de Troca-iônica - Ativação do trocador catiônico: Trata-se a resina com um ácido forte (HCl) lava-se com água deionizada trata-se com uma base forte (NaOH) lava-se com água deionizada tratamento com tampão cujo ph deve ser superior ao pk do grupamento trocador Os trocadores catiônicos assim tratados são considerados ativos na sua forma sódica, ou seja: R-COOH NaOH R-COO - Na + Forma Inativa Forma Ativa

38 Cromatografia Cromatografia de Troca-iônica - Ativação do trocador aniônico: trata-se com uma base forte (NaOH) lava-se com água deionizada Trata-se a resina com um ácido forte (HCl) lava-se com água deionizada tratamento com tampão cujo ph deve ser inferior ao pk do grupamento trocador Os trocadores catiônicos assim tratados são considerados ativos na sua forma cloreto, ou seja: R-COOH HCl R-CO + Cl - Forma Inativa Forma Ativa

39 Cromatografia Cromatografia de Troca-iônica - Caso uma solução contendo um cátion X + for colocada em contato com um trocador catiônico ativo, este deslocará o cátion presente no trocador e será fixado: R-COO - Na + + X + R-COO - X + + Na + - Capacidade total de troca: função do tipo de trocador. Importância deste parâmetro: se excedido, os íons não serão totalmente retidos. capacidade disponível ou real de troca : capacidade de cada trocador em uma determinada condição experimental (ph, natureza do tampão, força iônica, etc.).

40 Cromatografia Cromatografia de Troca-iônica - Escolha do tipo de resina Proteínas com cargas positivas e negativas: Carga é função do ph do meio, Fator principal: estabilidade da molécula nos diferentes ph s. Proteínas labéis: trocadores fracos - Trocador catiônico (p.ex. CM-celulose), uma força iônica baixa e um ph = 5 são condições ideais para fixar as proteínas. (pk típico dos grupos carboximetílicos = 4) e a maioria das proteínas se encontrariam positivamente carregadas (abaixo do seu ponto isoelétrico).

41 Cromatografia Cromatoenfoque: - As proteínas são eluídas de uma coluna de troca iônica utilizando-se um enfraquecedor - Efeito de enfoque: concentra a enzima de interesse - A coluna é equilibrada com um tampão e, depois da aplicação da amostra, se utiliza um segundo tampão, enfraquecedor de ph (para a eluição). - Geração de um gradiente linear de ph in situ como conseqüência da capacidade enfraquecedora da resina. - Este gradiente de ph tem efeito de enfoque e as moléculas com o ponto isoelétrico específico se concentram conjuntamente.

42 Cromatografia Cromatografia de adsorção: - Os componentes da amostra serão retidos ou não sobre a superfície da fase estacionária por forças do tipo van der Waals, ligações hidrogênio ou interações eletrostáticas. - O deslocamento das partículas adsorvidas será função da maior ou menor interação destas com a fase estacionária.

43 Cromatografia Cromatografia de afinidade: - Cromatografia de adsorção onde o suporte apresenta afinidade específica com a substância a ser isolada. - É capaz de fornecer um alto grau de purificação. - Acopla-se covalentemente uma molécula ligante apropriada a uma matriz insolúvel. - A molécula ligante adsorve da solução a substância a ser isolada, sendo eliminadas as que não apresentam nenhuma afinidade com o suporte. - Dessorção: mudanças nas condições experimentais ([substrato], coenzimas). - Isolamento de substâncias de acordo com sua função biológica

44 Cromatografia Interação hidrofóbica: - Observou-se: proteínas são retidas nos géis de afinidade contendo braços de hidrocarbonetos (C2 a C10). - As interações hidrofóbicas são mais fortes em alta força iônica sendo, portanto, convenientemente utilizadas após a precipitação com sais ou cromatografia de troca iônica. - A eluição pode ser efetuada alterando o ph do solvente, a força iônica ou usando um modificador orgânico (como etilenoglicol).

45 Cromatografia Eletroforese: - Existência de grupos ionizáveis nas moléculas biológicas - Quando em solução podem existir como espécies eletricamente carregadas. - A taxa de migração destas partículas, quando submetidas a um campo elétrico, é proporcional a força do campo e a carga efetiva das partículas e inversamente proporcional ao atrito, dependo da sua forma e tamanho.

46 Cromatografia Eletroforese: - Papel: simples e mais usado Em alguns casos, não se obtém uma boa separação. - Em gel: amido, agarose e poliacrilamida Utilização de outros fatores como a difusão e a separação por peneiramento molecular, além do campo elétrico. Mais conhecida: SDS-poliacrilamida usada na determinação de peso molecular e da pureza da amostra.

47 Cromatografia Eletroforese: - Sódio dodecilsulfato (SDS): detergente aniônico que se liga fortemente as proteínas causando sua desnaturação e fornecendo uma carga negativa constante por unidade de massa. - Os complexos SDS-proteína: movem-se para o anodo durante a eletroforese. - Propriedades de peneira molecular do gel: mobilidades são inversamente proporcionais ao logaritmo de seus pesos moleculares. - Proteínas padrão de peso molecular conhecido são aplicadas: o peso molecular das amostras proteicas pode ser determinado. - Relevação do gel: Comassie Brilliant Blue, Bromofenol ZnSO 4 ácido acético ou Nitrato de prata.

48 Cromatografia Géis bidimensionais: - Amostras são parcialmente separadas por diferenças entre pontos isoelétricos, usando uma coluna cilíndrica. - O anodo possui um ph menor que o catodo e um gradiente estável de ph é mantido. - Proteínas abaixo do seu pi: carregadas negativamente e migrarão para o catodo, até uma região onde o ph corresponda a seu pi, cessando o movimento de migração. Oposto: proteínas acima do seu pi. - Esta técnica é conhecida como enfoque isoelétrico.

49 Cromatografia Géis bidimensionais: - Após separação parcial: eletroforese em SDS no sentido perpendicular à primeira separação - separação baseada nas diferenças de peso molecular.

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