Influênci d benzilminopurin e d cinetin n micropropgção de plnts jovens de Lvndul luisieri (Rozeir) Rivs-Mrtínez J.C. Gonçlves 1,2, M. Mrchuet 1, G. Diogo 1 1 Lb. Biologi Vegetl, Escol Superior Agrári, 6001-909 Cstelo Brnco, Portugl 2 CERNAS, Centro de Estudos de Recursos Nturis, Ambiente e Sociedde Plvrs chve: citocinins, Lvndul luisieri, micropropgção. Resumo Com o objectivo de desenvolver metodologis de micropropgção de Lvndul luisieri, form relizdos um conjunto de ensios tendo como mteril vegetl explntes provenientes de germinção de sementes in vitro. Os ensios de multiplicção estbelecidos com explntes secundários provenientes ds plnts in vitro d populção stock mostrrm que 6- benzilminopurin se mostrou mis eficz, comprtivmente com cinetin, n promoção e desenvolvimento dos rebentos tendo n concentrção de 0.44 µm sido obtidos um médi de 2.2 rebentos com tx de multiplicção de 3 e comprimentos de 20.9 mm. Contudo utilizção de concentrções mis elevds de 6-benzilminopurin são susceptíveis de promoverem elevds tx de vitrificção (35%) com consequente perd ds culturs. Durnte est fse de multiplicção registou-se formção de rízes nos rebentos tendo s percentgens de enrizmento sido miores nos meios com cinetin, 57.5% com 0.46 µm, e no controlo. A climtizção dests plnts foi feit com 100% de sobrevivênci o que indici o bom estdo fisiológico ds plnts regenerds in vitro. Resumen Con el fin de desrrollr metodologís pr l micropropgción de Lvndul luisieri se h relizdo un serie de pruebs con el mteril vegetl prtir de los explntes de l germinción in vitro de l semill. L prueb de l multiplicción con explntes secundrios de plnts in vitro de l poblción mostró que 6-benzilminopurin fue más eficz comprtivmente com l cinetin, en l l promoción y el desrrollo de brotes, tiendo l concentrción de 0.44 µm tenido un promedio de 2.2 brotes con ts de multiplicción de 3 y l longitud de 20.9 mm. Sin embrgo, el uso de myores concentrciones de 6-benzilminopurin son susceptibles de promover l vitrificción de lto nivel (35%) con l consiguiente pérdid de cosechs. Durnte est fse de multiplicción h sido registd l formción de ríces siendo el porcentje de enrizmiento myor en los medios con cinetin, el 57.5%, con 0.46 µm, y en el control. L climtción de ests plnts se hizo con el 100% de supervivenci que sugiere el buen estdo fisiológico de ls plnts regenerds in vitro. INTRODUÇÃO O género Lvndul pertence à fmíli ds Lmicee (Lbite) com designção vulgr de Lbids. Recebem este nome porque possuem flores tubulres cuj boc termin em dois lábios, superior e inferior, ou, mis rrmente, num só (Frnco, 1984). Este género é ntivo ds Ilhs Cnáris, Áfric, sul d Europ e Mediterrâneo, Arábi e Índi. Dentro d secção Stoechs, que se distingue pels três longs bráctes violets ou brncs no topo d espig, L. peduncult sepr-se d L. luisieri pelo longo pedúnculo d inflorescênci e L. viridis distingue-se pel tonlidde verde-mreldo ou brnco d espig e pel intens concentrção de pêlos glndulres. As espécies L. luisieri e L. peduncult bundm no nordeste, centro e sul de Portugl, enqunto que L. viridis, bstnte menos fácil de encontrr, ocorre pens e espordicmente no sudoeste e sudeste lentejnos e no brlvento lgrvio. A importânci e utilidde ds plnts romátics e medicinis tem, desde há lguns nos est prte, vindo gnhr consistênci num ltur em que tem sido importnte vlorizção 1
dests espécies em regiões onde desertificção começ ser mrcnte (Regto et l., 1996) e onde Lvndul luisieri pode vir ter ppel de destque (Delgdo et l., 2007). Grnde prte ds plnts medicinis e romátics propg-se exclusiv ou predominntemente por vi seminl. Contudo, lgums dests plnts, possuem bixs fculddes germintivs e longos períodos de germinção, (Rodrigues e Almeid, 1996), pelo que s técnics de micropropgção são um lterntiv ter em considerção qundo pretendemos plnts em lrg escl. Vários têm sido os trblhos de micropropgção no género Lvndul (Jordn et l., 1998, Clvo e Segur, 1989, Pnizz e Tognoni, 1992, Nobre, 1996, Andrde et l., 1999, Echeverrigry et l., 2005, Dis et l., 2002 e Dronne et l., 1999), sendo contudo inexistentes os estudos de micropropgção em L. luisieri. Assim, o objectivo deste trblho, foi o de inicir procedimentos de estbelecimento e de micropropgção nest espécie no sentido de promover su vlorizção económic e mbientl. MATERIAL E MÉTODOS Mteril vegetl No presente trblho form utilizds plnts obtids por germinção de sementes in vitro. As sementes utilizds form recolhids em Julho de 2005 n região d Mt, Cstelo Brnco, região centro interior de Portugl. A germinção ds sementes foi feit em meio de cultur de Murshige e Skoog (1962) (MS), suplementdo com 6-benzilminopurin (BAP) n concentrção de 0.89 µm e 30 gl -1 de scrose. O ph foi justdo entre 5.7 e 5.8 com HCl 1N ou NOH 1N. Por último, dicionou-se o gr, num concentrção de 7 gl -1. Estbelecimento in vitro As plnts germinds in vitro, form sendo trnsferids individulmente pr tubos de ensio, cd um com 15 ml de meio de cultur de MS (1962) com redução de nitrtos metde (MS1/2NO 3 ) e com concentrções de BAP entre 0.44 e 4.44 µm. As repicgens seguintes, pr obtenção de populção stock, efectuds cd qutro semns, form feits em frscos (85xø65 mm) com 50 ml de meio de cultur MS1/2NO 3 e suplementdos com BAP n concentrção de 0.44 µm contendo sete explntes por frsco. O explnte secundário utilizdo tinh entre 8 e 10 mm de comprimento. Fses de multiplicção, enrizmento e climtizção O ensio de multiplicção foi estbelecido com explntes com dimensões entre os 8 e 10 mm e que não presentssem vitrificção, com diferentes concentrções de BAP (0.22, 0.44, 0.89 e 2.22 µm) e de cinetin (Ki) (0.23, 0.46, 0.93 e 2.32 µm). O meio de cultur utilizdo foi o meio MS1/2NO 3, suplementdo com scrose 30 gl -1, gr, 7 gl -1 e o ph justdo entre 5.7 e 5.8 com HCl 1N ou NOH 1N ntes de dicionr o gr. Form utilizdos tubos de ensio (150xø25 mm) com um explnte por tubo. Tods s culturs form mntids n sl de cultur, com fotoperíodo de 16h e um tempertur 25/23ºC, di/noite. A iluminção foi feit por lâmpds fluorescentes, tipo cool white com intensidde luminos de 45±5 µmol m -2 s -1. As plnts que desenvolverm rízes durnte o processo de multiplicção, form colocds em substrto de turf:perlite (1:2, v:v) humedecido com solução nutritiv de 1/2MS1/4NO3, em cix de esferovite (80 x 40 x 17 cm) com tmp crílic pr serem climtizds. As plnts form colocds n sl de cultur ns condições de cultur já descrits, durnte um semn, pós o que form trnsferids pr o estufim de climtizção onde permnecerm durnte 4 semns sob intensidde luminos de 250±10 µmol m -2 s -1 e fotoperíodo de 16 hors com redução grdul d humidde reltiv de 95% té 50%. Delinemento e trtmento esttístico No ensio de multiplicção form utilizds 40 replicções e os registos feitos 5 semns pós o seu início. Os prâmetros quntificdos form o número de rebentos diferencidos por 2
explnte (Nreb), o número de segmentos (Nseg) que se trduz no número de explntes secundários possíveis de utilizr no subcultivo seguinte, o comprimento do mior rebento (Cmior), o comprimento do menor rebento (Cmenor). Registou-se ind o número de rebentos que sofrerm vitrificção (em percentgem) o número de explntes enrizdos (em percentgem), o número de rízes formds por explnte enrizdo (Nrízes). Pr os prâmetros de multiplicção e número de rízes os resultdos form submetidos um ANOVA unifctoril e pr vlores de F significtivos (P 0,05) foi plicdo o teste de comprção de médis de Duncn. O trtmento foi feito com o progrm SPSS V.16 pr Windows. Pr os prâmetros vitrificção e percentgem de explntes enrizdos foi utilizdo o progrm esttístico Minitb 15, versão pr Windows, por comprção de dus proporções trvés do cálculo do p-vlue 95% do intervlo de confinç (CI) pr diferenç desss proporções. RESULTADOS E DISCUSSÃO Fse de multiplicção N Tbel 1 estão representdos os resultdos obtidos pr os diferentes prâmetros de regenerção. Qunto o prâmetro de número de rebentos por explnte, verificou-se que o trtmento com 0.89 µm de BAP permitiu obtenção do mior número de rebentos, com 2.2 rebentos não diferindo significtivmente do número de rebentos obtidos com concentrção de 0.44 µm de BAP (1.7 rebentos) (Fig. 3). As restntes combinções de Ki e de BAP derm vlores inferiores e não diferentes significtivmente entre si. Este efeito positivo d BAP n multiplicção de rebentos em Lvndul foi referido por vários utores tis como Jordn et l. (1998), Clvo e Segur (1989), Pnizz e Tognoni (1992), Nobre (1996) e Andrde et l. (1999). Contudo, o vlor do número médio de rebentos obtido, 2.2 rebentos, é frncmente inferior o registdo por outros utores, noutrs espécies do género Lvndul, como por exemplo em L. dentt, onde o mior número de rebentos por explnte é de 12.8, pr um concentrção de 2.2 µm de BAP (Echeverrigry et l., 2005), em L. viridis, Dis et l. (2002), referem um número médio de rebentos de 11.6 utilizndo meio de MS com mcronutrientes metde e suplementdo com 0.67 µm de BAP, com utilizção d formulção de MS suplementd com 0.88 µm de BAP o número de rebentos obtidos foi de 6.7. Tbel 1. Efeito de diferentes concentrções de BAP e de Ki n regenerção in vitro de rebentos de L. luisieri, pós 4 semns de cultur. Trtmentos Prâmetros RCV µm Nreb Cmior Cmenor Nseg BAP 0.22 1.4 bc 20.1 c 10.7 bc 2.3 bc 0.44 1.7 b 15.1 de 10.2 c 2.0 bc 0.89 2.2 20.9 bc 10.1 c 3.0 2.22 1.5 bc 13.8 e 9.9 c 1.6 c Ki 0.23 1.2 c 21.9 bc 13.3 b 2.1 bc 0.46 1.1 c 25.0 b 12.2 bc 2.2 bc 0.98 1.2 c 18.5 cd 10.4 c 1.7 c 2.46 1.1 c 18.7 cd 10.0 c 1.7 c Controlo 0 1.3 bc 25.5 13.8 2.5 b (Médis n colun seguids d mesm letr não são significtivmente diferentes pelo teste de Duncn (P 0,05). Dronne et l. (1999), num estudo n espécie lvndin (Lvndul x intermedi Emeric ex Loiseleur), onde form usds folhs como explnte, o melhor resultdo foi obtido num ds cinco cultivres, presentndo um número médio de 7 rebentos por explnte. Ests diferençs de vlores podem ter lgum explicção no fcto do ensio ter sido estbelecido com explntes que estvm pens no seu terceiro subcultivo pós o início d fse de multiplicção, hvendo utores que confirmrm o umento do número de rebentos pós 3
subcultivos sucessivos de multiplicção in vitro (Lll et l., 2006), pr lém ds diferençs n formulção nutritiv utilizd. Qunto o Nseg (Tb. 1), registou-se o vlor mis elevdo n modlidde 0.89 µm de BAP, com 3 segmentos, não diferindo significtivmente do número de segmentos obtidos com modlidde de controlo (2.5). As restntes sete modliddes presentrm vlores mis bixos e não diferentes significtivmente entre si, com vlores entre 2.3 e 1.6 segmentos. Qunto o Cmior rebento (Tb. 1), verific-se que o vlor mis elevdo se obteve no controlo, com 25.5 mm (Fig. 4), não diferindo significtivmente dos comprimentos obtidos ns modliddes 0.23 e 0.46 µm Ki, que presentm vlores de 21.9 e 25.0 mm, respectivmente. Estes vlores obtidos são semelhntes o d espécie L. dentt, onde os rebentos de mior comprimento registrm um vlor de 24.5 mm, pr um concentrção de 2.2 µm de BAP (Echeverrigry et l., 2005). Tmbém Dis et l. (2002), referem um comprimento médio dos rebentos de L. viridis de 23.2 mm qundo utilizd concentrção de 0,46 µm de Ki e vlores ligeirmente superiores (44,4 mm) com 0,67 µm de BAP. Qunto o Cmenor rebento (Tb. 1), modlidde que presentou o comprimento mior do menor rebento é o controlo, com 13.8 mm, não diferindo significtivmente dos vlores obtidos ns modliddes 0.23 e 0.46 µm Ki, com vlores de 13.3 e 12.2 mm, respectivmente. A presenç ou usênci de vitrificção foi outro dos prâmetros nlisdos (Fig. 1). A vitrificção é um fenómeno que present sérios problems n formção de rebentos, umentndo frgilidde do mteril em cus (Fig. 5). Verificmos que concentrção de 2.32 µm de BAP é que present mior percentgem de vitrificção com um vlor igul 35%, não diferindo significtivmente ds modliddes 0.44 e 0.89 µm de BAP, com vlores de 30 e 20%, respectivmente. As restntes modliddes derm percentgens inferiores e não diferentes significtivmente entre si, sendo menor percentgem (5%) obtid ns modliddes controlo e 0.46 µm de Ki. Tmbém Andrde et l. (1999), registrm o fenómeno de hiperhidricidde n espécie L. ver sob lts concentrções de TDZ (4,54 µm) e BAP (4,44 e 8,88 µm). 50 % 40 30 20 10 0 b bc c c c c c 0 0.23Ki 0.46Ki 0.93Ki 2,32Ki 0.22BAP 0.44BAP 0.88BAP 2.22BAP Fig. 1. Percentgens de vitrificção registds n fse de multiplicção em cd um ds modliddes testds. (Percentgens n colun com mesm letr não são significtivmente diferentes pelo cálculo do p-vlue 95% do intervlo de confinç (CI)). Os sintoms de vitrificção ou hiperhidricidde, são provocdos por desordens fisiológics, que ocorrem, frequentemente ns culturs in vitro de muits espécies e são tribuíds, principlmente, à idde do mteril utilizdo como explntes (Ziv, 1991), o que, neste cso, não se plic, pois trt-se de mteril jovem e com pouco tempo de permnênci in vitro. Contudo vitrificção pode ser origind por outros motivos, ou porque concentrção de gr no meio de cultur é bix, ou porque o tipo de gr não é o mis dequdo, ou porque concentrção de scrose no meio é bix ou ind porque o hidrto de crbono utilizdo não é o mis correcto (Rumry e Thorpe, 1984). Fses de enrizmento e climtizção A fse de enrizmento registd foi simultâne com multiplicção do mteril vegetl. 4
No que diz respeito à formção de rízes (Fig. 6), registrm-se diferençs significtivs entre s modliddes onde se utilizou BAP ou Ki. As modliddes onde houve mior percentgem de enrizmento form no controlo e em 0.46 µm Ki (57,5%), não diferindo significtivmente d modlidde 0.23 µm Ki (52,5%). Pr s concentrções de 0.22, 0.44 e 0.88 µm de BAP percentgem de enrizmento foi de 10%, não diferindo significtivmente d utilizção d modlidde 2.22 µm Ki (22,5%). Com modlidde 2.22 µm BAP percentgem de enrizmento foi nul. % 70 60 50 40 30 20 10 0 b bc c c c d 0 0.23Ki 0.46Ki 0.93Ki 2,32Ki 0.22BAP 0.44BAP 0.88BAP 2.22BAP Fig. 2. Percentgens de enrizmento registds durnte fse de multiplicção em cd um ds modliddes testds. (Percentgens n colun com mesm letr não são significtivmente diferentes pelo cálculo do p-vlue 95% do intervlo de confinç (CI)). Est formção de rízes durnte fse de multiplicção, onde se plicm citocinins, não é vulgr, sendo bem conhecido o seu efeito inibidor no processo de rizogénese, sendo s uxins s hormons promotors d indução rizogénic (Pierik, 1987). Aliás verificou-se que presenç de BAP invibilizou quse por completo formção de rízes, sendo o vlor mis elevdo obtido n usênci de qulquer hormon (controlo) e ns concentrções mis bixs de Ki. Nos trblhos de Echeverrigry et l. (2005), n espécie L. dentt, estes utores referem um percentgem de enrizmento de 100% qundo os rebentos form colocdos em meio de MS durnte 15 dis sem suplemento hormonl, tl como referem Jordn et l. (1998) pr L. dentt e outrs espécies. Dis et l. (2002), pr L. viridis, referem percentgens de enrizmento entre 26.7% e 86.8% tendo o melhor vlor sido obtido com 10.74 µm de ANA. Qunto o número de rízes por rebento enrizdo (Tb. 2), o mior número de rízes foi obtido n modlidde 0.23 µm Ki, com 3.6 rízes por explnte enrizdo, não diferindo significtivmente ds restntes modliddes, com excepção d modlidde 0.22 µm BAP. Tbel 2. Efeito de diferentes concentrções de BAP e de Ki no número de rízes de rebentos de L. luisieri, pós 4 semns de cultur. Trtmentos RCV µm N Rízes BAP 0.22 1.3 b 0.44 2.0 b 0.89 1.8 b 2.22 -- Ki 0.23 3.6 0.46 3.1 b 0.98 2.2 b 2.46 1.8 b Controlo 0 3.3 (Médis n colun seguids d mesm letr não são significtivmente diferentes pelo teste de Duncn (P 0,05). 5
Qundo plicdo trtmento hormonl específico pr enrizmento, segundo Echeverrigry et l. (2005), n espécie L. dentt o mior número de rízes (25.4) foi obtido n modlidde 2.5 µm ANA. Qunto à fse de climtizção, o mteril vegetl presentou 100% de sobrevivênci (Fig. 7), um elevdo crescimento, sendo notável o longmento dos rebentos, o que será devido o bom estdo fisiológico do mteril regenerdo in vitro, à funcionlidde do sistem rdiculr, o tipo de substrto utilizdo e às condições mbientis, em prticulr d tempertur e humidde. Contudo, devemos ter lgums reservs neste vlor um vez que o mesmo resultou pens de um trtmento com 56 plnts sem qulquer repetição. Estes resultdos são ligeirmente superiores os referidos por Echeverrigry et l. (2005), em L. dentt, com 87% de sobrevivênci e os 80% de sobrevivênci referidos por Dis et l. (2002). Fig. 3. Efeito d concentrção de BAP n multiplicção de L. luisieri. (A) Aspecto dos rebentos n concentrção de 0,2 mgl -1. (B) Aspecto dos rebentos n concentrção de 0,5 mgl -1. Fig. 4. Rebentos de L. luisieri n fse de multiplicção sem suplemento hormonl (controlo). Fig. 5. Rebentos de L. luisieri n fse de multiplicção d populção stock evidencindo fortes sintoms de vitrificção. Fig. 6. Rebentos de L. luisieri enrizdos durnte fse de multiplicção. A brr represent 1 cm. Fig. 7. Rebentos de L. luisieri no finl d fse de climtizção. A brr represent 7 cm. 6
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