Revista de Odontologia da Universidade de São Paulo ISSN versão impressa. Doença periodontal: estudo da resposta imune humoral*

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1 Revista de Odontologia da Universidade de São Paulo ISSN versão impressa Rev Odontol Univ São Paulo v.12 n.3 São Paulo Jul./Set doi: /S Doença periodontal: estudo da resposta imune humoral* Periodontal disease: study of humoral immune response Mirian Marubayashi HIDALGO** Eiko Nakagawa ITANO*** Roberto Issamu NAKAGAWA**** Wilson TREVISAN JUNIOR*** Mario Julio AVILA-CAMPOS***** HIDALGO, M.M.; ITANO, E.N.; NAKAGAWA, R. I.; TREVISAN JUNIOR, W.; AVILA-CAMPOS, M.J. Doença periodontal: estudo da resposta imune humoral. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 12, n. 3, p , jul./set Foram comparados os níveis de imunoglobulina IgG e IgA séricas e IgG e IgA secretora (IgA-S) salivares reativas com Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), e dosadas IgM, IgG e IgA séricas totais em pacientes com Periodontite de Incidência Precoce (PIP), Periodontite de Adulto (PA) e controles saudáveis sem doença periodontal. Os níveis de anticorpos para Aa foram determinados por ELISA e a dosagem de Igs séricas totais realizada por imunodifusão radial simples, utilizando como antígeno extrato sonicado de uma mistura de cinco isolados de Aa provenientes de pacientes com PIP e extrato sonicado de Aa de referência FDC Y4. Não foi observada diferença significativa entre os níveis séricos de anticorpos IgG e IgA e os níveis salivares de anticorpos IgG e IgA-S para Aa entre os grupos PIP (n=9), PA (n=20) e indivíduos sadios (n=20). Estes resultados sugerem a inexistência de alterações significativas na resposta imune humoral anti-aa em pacientes com periodontite. A dosagem de Igs séricas totais

2 também não revelou diferença estatisticamente significante entre pacientes com PIP (n=9), PA (n=9) ou controles saudáveis (n=9). UNITERMOS: Formação de anticorpos; ELISA; Periodontite. INTRODUÇÃO Sob a denominação doença periodontal humana incluem-se numerosas entidades, sendo amplamente aceito na literatura o importante papel desempenhado pelas bactérias da placa dental supra e subgengival 14, 19. Algumas manifestações da doença periodontal podem ser associadas a bactérias específicas e talvez a mais clara associação já descrita seja aquela entre a Periodontite de Incidência Precoce (PIP) e o Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) 1. Além da PIP, o Aa também pode participar da Periodontite de Adulto (PA) associado a outros microrganismos 19 ou pertencer à microbiota bucal normal, já que foi encontrado em 36% da população com periodonto saudável 1. O Aa produz diversas substâncias biologicamente ativas, que individual ou coletivamente podem estar envolvidas na patogenia da PIP e da PA 2, 22. No hospedeiro, a introdução de moléculas ou microrganismos estranhos resulta numa série de eventos de seu sistema de defesa, no sentido de eliminar ou neutralizar o agente agressor 9. Assim, na resposta imune humoral de pacientes com PIP e PA, diferentes autores têm encontrado níveis elevados de imunoglobulina IgG e IgA séricas reativas com Aa 3, 6, 10, 13. Por outro lado, GENCO et al. 5 (1985), SAITO et al. 16 (1993)e TAKAHASHI et al. 20 (1995)não encontraram diferenças nos níveis de anticorpos para Aa entre os pacientes e controles. Localmente, uma forma de evidenciar o estado imunológico dos pacientes com periodontite é analisar os níveis de anticorpos salivares anti-aa. Nesse sentido, SANDHOLM; GRONBLAD 17 (1984) e TAUBMAN et al. 21 (1982) relataram um aumento no nível de Ig específica para Aa em pacientes com PIP, enquanto ENGSTRON et al. 4 (1993) associaram níveis elevados de anticorpos com portadores de Aa, independentemente de serem pacientes com PIP ou PA. No Brasil, SINGI et al. 18 (1982) determinaram a concentração de IgA em salivas totais ou de parótida em indivíduos normais e portadores de periodontites, MONCADA et al. 12 (1986) quantificaram as concentrações de IgG em homogeneizados de tecido gengival de pacientes portadores de gengivite e periodontite, e RUBIRA et al. 15 (1993) compararam as freqüências de detecção e títulos séricos de IgG específicos para Aa em indivíduos com diferentes condições periodontais, não sendo encontradas em nenhum desses estudos diferenças estatisticamente significantes entre os grupos. Considerando os dados contraditórios da literatura e o pequeno número de relatos existentes no Brasil sobre a resposta imune humoral dos pacientes com PIP e PA, este trabalho propôs-se a avaliar os níveis e a freqüência de IgG e IgA séricas e IgG e IgA

3 secretoras (IgA-S) salivares anti-aa. Também foram determinados os níveis séricos totais de IgM, IgG e IgA nos pacientes com periodontite e controles saudáveis. MATERIAL E MÉTODOS Pacientes e indivíduos saudáveis. Com base nos dados obtidos após anamnese, exame clínico e radiográfico, os pacientes da Clínica de Periodontia, do Departamento de Medicina Oral e Odontologia Infantil da UEL foram selecionados por um especialista e agrupados como: pacientes portadores de PIP (n=9, idades entre 7 e 30 anos, sendo a média de 19,7), aqueles que apresentavam evidências clínicas e radiográficas de perda óssea alveolar localizada nos primeiros molares e incisivos decíduos ou permanentes com envolvimento de, no máximo, 14 dentes; e pacientes portadores de PA (n=20, idades entre 35 e 56 anos sendo a média de 41,2), aqueles com mais de 35 anos de idade, exibindo periodontite crônica e sem história prévia de doença periodontal na juventude. Segundo a idade e sexo semelhante à população estudada, foram escolhidos como controles 20 indivíduos sadios sem evidência clínica ou radiográfica de doença periodontal. Ninguém havia estado em tratamento com antibióticos durante os 3 meses anteriores à coleta de material. Obtenção de extrato de A. actinomycetemcomitans. Foi realizada de acordo com o proposto por HIDALGO et al. 7 (1998). As amostras foram obtidas através da introdução de dois finos cones de papel absorvente esterilizados na bolsa periodontal do dente mais afetado dos pacientes com PIP. Em seguida, foram homogeneizadas em salina tampão fosfato (PBS, 0,15 M e ph 7,2) e plaqueadas (diluição seriada até 10-3 ) em meio seletivo ágar de soja tripticaseína-soro de cavalo-bacitracina-vancomicina (TSBV, Difco Laboratories, USA). Após incubação em condição de anaerobiose (jarra Difco Laboratories, USA com catalisador e gerador de CO 2 Gas-Pak, BBL, USA) a 37 C durante 72 horas, foi realizada a identificação presuntiva baseada nas características coloniais, celulares e bioquímicas típicas da espécie. Para obtenção de extrato celular sonicado, as amostras de Aa isoladas e Aa FDC Y4 (sorotipo b) foram cultivadas em ágar sangue e caldo infuso cérebro-coração (BHI, Difco Laboratories, USA), ambos suplementados com 0,5% de extrato de levedura, em condições de microaerofilia (método da vela), lavadas com PBS, sonicadas (15 ciclos/50 volts/minuto, com intervalo de 2 minutos) em aparelho fabricado na UEL (Brasil) e realizada a dosagem de proteínas (Labtest, Brasil) a partir do sobrenadante obtido por centrifugação a g (Sorvall Instruments, USA) durante 20 minutos a 4º C. Foi formado um "pool" de extrato sonicado de Aa, a partir da mistura de iguais volumes de todos os isolados bacterianos obtidos (n=5) dos pacientes com PIP. Uma nova dosagem de proteínas totais foi realizada para confirmação, seguida de esterilização por filtração em membrana Millipore de 0,2 μm e estocagem a -20º C, até seu uso posterior. Obtenção de amostras de saliva e soro. No momento da coleta do sangue, foi realizada, paralelamente, a coleta de saliva sob estímulo com parafina, cuja amostra foi centrifugada durante um minuto a g (Brinkman, USA), aliquotada e armazenada a -20º C. Para obtenção de amostras do soro, o sangue venoso coletado foi incubado a 37º C por 30 minutos e, posteriormente, a 4º C, durante uma hora. O soro obtido após centrifugação (Fanem, Brasil) a 600 g durante 10 minutos, foi aliquotado e armazenado

4 a -20º C. Para dosagem de IgM, foram utilizadas alíquotas de soros diluídos em glicerol p.a. volume a volume 8. Determinação dos títulos de IgG e IgA séricas reativas a Aa pelo método ELISA. Uma alíquota de 0,1 ml de extrato sonicado de Aa (FDC Y4 e "pool") na concentração de 10 mg/ml em PBS, acrescidos de 0,25% de gelatina, foi distribuída em cada orifício da placa de fundo plano (Corning Lab. Sci. Co., USA) e incubada durante 2 horas a 37º C e 18 horas a 4º C. Após descarte da solução de antígeno, foi realizado o bloqueio com 0,1 ml de leite em pó desnatado 5% em solução salina-fosfato tamponada Tween 20 (PBST) a 37º C durante 2 horas. Subseqüente a lavagens com PBST, foi adicionado 0,1 ml de cada soro em diluição seriada fator 3 em PBST, em duplicata, seguida de incubação a 37º C durante 2 horas. Após lavagens, foi depositado 0,1 ml de Ig de camundongo conjugada a peroxidase anti-igg humana (A-6787, Sigma Chemical Co., USA) diluída 7.000X ou 0,1 ml de Ig de camundongo anticadeia pesada da IgA humana (I0636, Sigma Chemical Co., USA) diluída 4.000X e incubada a 37º C durante 1 hora em câmara úmida. Para o ensaio de IgA, necessitou-se de mais uma incubação de 1 hora a 37º C com Ig de coelho conjugada a peroxidase anti-ig de camundongo diluída 1.000X (A9917, Sigma Chemical Co., USA). Após lavagens sucessivas, foi adicionado 0,1 ml de cromógeno o-fenilenediamino diidrocloreto (OPD, 0,5 mg/ml) dissolvido em tampão ácido cítrico-fosfato 0,05 M e ph 5 acrescido com 25% H 2 O 2 e deixado à temperatura ambiente por 10 minutos. A leitura foi realizada em aparelho Multiskan a 492 nm, após a paralisação da reação com 50 µl de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 4N). Dosagem de IgM, IgG e IgA séricas totais pelo método de imunodifusão radial simples. As quantificações de IgM, IgG e IgA séricas totais foram realizadas em imunoplacas T-MAX-IDR (Trilab Diagnóstica Ltda., Brasil), segundo a técnica de imunodifusão radial simples de MANCINI et al. 11 (1965). Soro fornecido pelo Setor de Imunologia do Laboratório Clínico do Hospital Universitário de Londrina, de doador saudável e com concentrações conhecidas das Igs, foi utilizado como soro padrão. Foram pipetados 5 ml de cada amostra a ser estudada ou soro padrão sem diluir e, para dosagem de IgM, utilizou-se soro diluído em glicerol p. a. volume a volume. Fechou-se firmemente a placa e incubou-se em posição invertida em câmara úmida durante 48 horas à temperatura ambiente. Foram medidos os halos obtidos das amostras e soro padrão a fresco, calculados os diâmetros ao quadrado e interpolados os resultados através de regra de três simples (para IgM multiplicamos o resultado por dois). Determinação dos títulos de IgG e IgA-S salivares reativas a Aa. Foi empregada a mesma metodologia já descrita para determinação de Igs séricas, exceto que nas amostras de saliva foram realizadas diluições seriadas fator 2 e utilizada Ig de camundongo antipeça secretora de IgA humana (I6635, Sigma Chemical Co., USA) diluída 5.000X. Análise estatística. Todos os dados experimentais de dosagem de Igs séricas totais foram analisados tanto pela análise de variância como pelo teste t-student. As freqüências de positividade das diferentes Igs foram analisadas pelo contraste bilateral entre porcentagens. RESULTADOS

5 Titulação e freqüência de positividade de IgG e IgA séricas reativas com Aa. A titulação de IgG sérica reativa com os extratos sonicados de Aa (FDC Y4 e "pool") foi de 1/2187, com exceção do grupo controle contra o "pool", que foi de 1/729, como se mostra na Tabela 1. As freqüências de positividade nas últimas três diluições foi muito maior contra a cepa Y4 (máximo de 75%) do que contra o "pool" (máximo de 44%). A análise estatística não demonstrou diferença significativa entre os grupos PIP, PA e controle. Na Tabela 1 apresenta-se, ainda, a titulação de IgA sérica para extratos sonicados de Aa FDC Y4 e "pool" que foi de 1/81, com exceção do grupo PA contra o "pool" que foi de 1/27. As freqüências de positividade nas últimas três diluições do grupo PIP, foi maior contra o "pool" (máximo de 44%) do que contra a cepa Y4 (máximo de 33%). Já o grupo PA e controle tiveram praticamente a mesma freqüência de positividade contra a cepa Y4, mas, contra o "pool", verificou-se uma diminuição dessa freqüência nos pacientes com PA, embora sem diferença estatisticamente significante. Dosagem de IgM, IgG e IgA séricas totais. Como se observa na Tabela 2, foi encontrada uma média de dosagem de IgM, IgG e IgA ligeiramente aumentada nos pacientes com PIP em relação aos demais grupos estudados, porém sem diferença estatisticamente significante.

6 Titulação de IgG e IgA-S salivares reativas com Aa. Em amostras de saliva, a titulação de IgG para extratos de Aa (Y4 e "pool") foi bem mais baixa do que nos soros, sendo de 1/64 nos pacientes portadores de PIP (Tabela 3). A freqüência de positividade foi maior contra a cepa Y4 (máximo de 22%), porém na diluição 1/64, o grupo controle já não apresentava positividade. Por outro lado, a freqüência de positividade foi menor contra o "pool" (máximo de 11%), mas a partir da diluição 1/32, tanto o grupo de pacientes com PA como o controle não apresentaram positividade. A análise estatística não revelou diferença significativa entre os grupos PIP, PA e controle. A titulação de IgA-S salivar para Aa FDC Y4 e "pool" é mostrada na mesma Tabela e pode-se constatar que é baixa (1/16). Observa-se, na freqüência de positividade, que o grupo com PA apresentava maiores valores que PIP e controle, porém, sem diferença estatisticamente significante. Já os valores obtidos contra cepa Y4 e "pool" foram relativamente próximos.

7 DISCUSSÃO Neste trabalho, foram estudados os níveis e a freqüência de positividade de IgG e IgA séricas reativas com Aa FDC Y4, representativo do sorotipo mais freqüentemente associado à PIP, e com um "pool" de isolados de Aa, representativo de Aa regional, obtidos de cinco pacientes com PIP. No entanto, não foi observada diferença estatisticamente significante em relação aos antígenos utilizados. Comparando os níveis séricos de IgG e IgA anti-aa nos diferentes grupos, também não foi encontrada qualquer diferença. Esses resultados são concordantes com GENCO et al. 5 (1985), RUBIRA et al. 15 (1993), SAITO et al. 16 (1993) e TAKAHASHI et al. 20 (1995), que não observaram diferenças na produção de Igs nos pacientes com periodontite e controles saudáveis, apesar de terem ressaltado as diferenças individuais existentes. Já outros autores 3, 10, 13 encontraram níveis séricos mais elevados de IgA e IgG anti-aa em pacientes com periodontite. HAMMOND et al. 6 (1982) relataram que a maior freqüência de positividade e título para IgG encontrava-se na faixa etária de anos, coincidindo com a maior quantidade de Aa nesta idade 14 (1994). A maioria dos pacientes com PIP encontrava-se justamente fora desta faixa etária. A observação de que os níveis de Igs anti-aa não são diferentes entre os grupos PIP, PA e controle, corrobora os dados obtidos na resposta imune celular, onde se encontrou um perfil semelhante de resposta linfoproliferativa entre os grupos e uma resposta mais intensa com o extrato de Aa aquecido 7. Isto porque, pelos conhecimentos atuais de imunologia, para ocorrer a resposta imune humoral a antígenos T dependentes, é necessário que também ocorra a indução da resposta imune celular 9, o que não foi detectado em nossos experimentos anteriores. No caso de antígenos T independentes,

8 eles não ativariam a resposta imune celular e atuariam como ativadores policlonais induzindo uma resposta imune humoral inespecífica, se presentes em altas concentrações, ou estimulariam apenas a IgM, se presentes em baixas concentrações. No entanto, não foi observado aumento no nível sérico total de IgM, IgG e IgA, sugerindo a não ativação policlonal e concordando com os dados dos níveis de anticorpos IgG e IgA reativos com Aa. Verificada a inexistência de alterações séricas na resposta imune humoral em pacientes com periodontite, procurou-se avaliar a resposta local através da análise de amostras de saliva. Lembrando que a IgA-S é produzida somente no local, enquanto a IgG de síntese local está somada àquela de origem sérica. Para titulação de Igs na saliva, optou-se pela coleta de saliva total, que é um método mais rápido e fácil, se comparado aos demais, apesar da inconveniência de perda variável de Igs na centrifugação necessária para a limpeza da amostra 17. A análise demonstrou maior freqüência de positividade de IgG contra os antígenos "pool" e Y4 nos pacientes com PIP, apesar de não apresentar diferença estatisticamente significante quando comparada aos pacientes com PA e controles. Em relação à IgA-S salivar, os resultados não demonstraram diferenças estatisticamente significantes na titulação e freqüência de positividade das amostras de salivas nos diferentes grupos estudados que apresentaram valores semelhantes tanto contra Y4 como "pool" de Aa. Na literatura, os relatos têm sido variados devido às diferenças na coleta da amostra da saliva. TAUBMAN et al. 21 (1982), reiterados por SANDHOLM; GRONBLAD 17 (1984), encontraram uma concentração aumentada em pacientes com PIP, enquanto outros trabalhos 12, 15, 18 não mostraram diferenças. Alguns autores 17,20 descreveram a dificuldade encontrada para análise e interpretação dos resultados obtidos dados os diferentes parâmetros usados no critério diagnóstico clínico ou a existência de subgrupos de indivíduos dentro de um mesmo grupo da doença. Aliado a isto, a grande quantidade de placa dental na PA ou a grande quantidade de Aa na PIP poderia estimular o sistema imune secretor pela ingestão dos correspondentes microrganismos ou ainda levar ao estado de tolerância imunológica, devido principalmente à carga antigênica. Além disso, como o Aa também pertence à microbiota bucal normal, mesmo em pequenas proporções, poderia induzir resposta em indivíduos periodontalmente saudáveis, causando reações cruzadas, o que poderia ser evitado pela utilização de fração antigênica específica de Aa virulento. Todas essas variáveis, somadas aos fatores de virulência como presença de leucotoxina e de fatores supressores 2,22, podem explicar a não detecção de diferença significante nos níveis de Igs anti-aa entre os grupos estudados. Considerando-se as grandes variações individuais encontradas, torna-se necessário estudar maior número de amostras, já que neste trabalho analisamos apenas nove pacientes com PIP. Este estudo inicial deverá ser estendido e ampliado, e a identificação e isolamento de frações antigênicas de Aa permitirão diferenciar o estado comensal do patogênico, o que seria de importância fundamental para evitar reações cruzadas e melhor entender a patogênese das doenças periodontais. CONCLUSÕES

9 1. Não foi observada diferença estatisticamente significante nos níveis séricos de anticorpos IgG e IgA anti-aa ou nos níveis de IgM, IgG e IgA totais de pacientes com PIP ou PA; 2. Não foi observada diferença estatisticamente significante nos níveis salivares de anticorpos IgG e IgA-S anti-aa. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à técnica Mári Sumigawa Kaminami, pela excelente colaboração durante todo o desenvolvimento do trabalho, e à professora Marta Mutsumi Zaha Inoue, pela cessão do soro padrão com concentração de Igs conhecida. Apoio financeiro: CPG/UEL /94 e PROUNI/CCS/UEL. HIDALGO, M.M.; ITANO, E.N.; NAKAGAWA, R.I.; TREVISAN JUNIOR, W.; AVILA-CAMPOS, M.J. Periodontal disease: study of humoral immune response. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 12, n. 3, p , jul./set We compared levels of sera immunoglobulin IgG and IgA, and salivary IgG and secretory IgA (IgA-S) reactive to Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa). Doses of total sera IgM, IgG, and IgA of patients with early-onset (EOP) and adult (AP) periodontitis, and healthy controls without periodontal disease were assessed. Igs to Aa were determined by ELISA. Total sera Igs were quantified by simple radial immunodiffusion, using a mixture of sonicated extracts of five isolates obtained from EOP patients confirmed as Aa, and sonicated extract of Aa reference strain FDC Y4 as antigens. No significant differences were found between sera IgG and IgA and salivary IgG and IgA-S levels among groups EOP (n=9), AP (n=20), and control (n=20). These results suggest that there was no significant alteration of the Aa humoral immune response level in patients with periodontitis. By quantification of total sera Igs, we found no statistically significant differences between EOP (n=9) and AP (n=9) patients or healthy controls (n=9). UNITERMS: Antibody formation; Enzyme-linked immunosorbent assay; Periodontitis. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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12 * Parte da dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Microbiologia da UEL. ** Profa. do Departamento de Odontologia da UEM-Maringá. *** Profs. dos Departamentos de Ciências Patológicas e de Medicina Oral e Odontologia Infantil da UEL-Londrina. **** Aluno do Curso de Odontologia da UEL-Londrina. ***** Prof. do Departamento de Microbiologia da USP-São Paulo Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo Avenida Lineu Prestes, Caixa Postal 8216 Cidade Universitária Armando de Salles Oliveira São Paulo SP - Brazil Tel.: (55 11) Fax: (55 11)