2. MATERIAIS E MÉTODOS

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1 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Reagentes o-nitrofenol-β-ᴅ-galactosideo (o-npg) Fluka Biochemika Alginato de sódio de algas castanhas Fluka Biochemika Carbonato de sódio (Na 2 CO 3 ) Merck Cloreto de cálcio (CaCl 2 ) dihidratado Merck Di-hidrogeno fosfato de potássio (KH 2 PO 4 ) Merck Hidrogeno fosfato de potássio (K 2 HPO 4 ) Merck Ácido clorídrico (HCl), 37 % Merck Tris(hidroximetil)aminometano ((HOCH 2 ) 3 CNH 2 ) Merck o-nitrofenol (o-np) Fluka Biochemika Ácido súlfúrico (H 2 SO 4 ) 95-97% Merck Reagente de Bradford Coomassie G-250 BIO-RAD Protein Assay Ácido dinitrosalicilico (Reagente DNS) Merck Glucose monoidratada Merck Reagente glucose oxidase/peroxidase Sigma-Aldrich Reagente o-dianisidina Sigma-Aldrich Solução padrão de glucose Sigma-Aldrich Leite UHT Gordo MIMOSA adquirido no Hipermercado Continente do Seixal Leite UHT Meio Gordo MIMOSA adquirido no Hipermercado Continente do Seixal Leite UHT Magro MIMOSA adquirido no Hipermercado Continente do Seixal 2.2. Enzimas Lactozym 2600 L Sigma-Aldrich 23

2 imibond galactosidase SPRIN 2.3. Equipamento Espectrofotómetro HITACHI U2000 UV-VIS de feixe duplo e com uma gama de comprimento de onda que se situa entre os 220 e os 850 nm. Fotómetro Eppendorf, BioPhotometer Bomba-seringa automática da New Era Pump Systems, Inc. Banho de água termostatizado com agitação Julabo SW 21 Agitador orbital termostatizado Aralab Agitorb 160E Potenciómetro Metrohm 744 Placa de aquecimento com agitação Arex Balança analítica Mettler AE 200 Microcentrifuga Heraeus Biofuge Pico Vortex Retsch Mixer Seringa de 10 ml PIC Indolor Agulha Terumo Neolus de 0,6 mm Microfiltros para agulhas Micropipeta P1000, P200 e P100 Macropipeta Transferpettor de 10 ml Pipeta de vidro de 20 ml Pipeta de vidro de 1 ml Eppendorfs de 1 ml e de 1,5 ml Microplaca Nuclon TM Delta Surface Cuvete de plástico Eppendorf Cuvete de plástico Cuvete de vidro Falcon de 10 ml 24

3 Frascos de 7 ml Frascos de 50 ml Tubos de ensaio de vidro Eppendorfs de 1,5 ml 2.4. Preparação de soluções Preparação de Solução Tampão de Fosfato de Potássio 0,1 M, ph 6,8: Preparar 25 ml de solução aquosa de K 2 HPO 4 a (1 M) e 25 ml de solução aquosa de KH 2 PO 4 (1 M); numa placa com agitação, colocar um copo de vidro de 500 ml com uma barra magnética no interior e misturar, no copo de vidro, 24,85 ml da solução aquosa de K 2 HPO 4 (1 M) com 25 ml da solução aquosa de KH 2 PO 4 (1 M); acrescentar 400 ml de água destilada, sempre com agitação, e confirmar o ph da solução com o potenciómetro devidamente calibrado. Passar a solução para um balão de 500 ml e perfazer o volume com água destilada. A solução deverá ser guardada em refrigeração (2 a 5 C). Preparação de Solução Tampão de Fosfato de Potássio 20 mm, ph 6,8: Retirar 20 ml da solução tampão de fosfato de potássio 0,1 M, ph 6,8 para um balão de 100 ml e perfazer o volume com água destilada. A solução deverá ser guardada em refrigeração (2 a 5 C). Preparação de Solução Tampão de Tris-HCl 0,1 M, ph 7,0: Preparar 100 ml de solução aquosa de (HOCH 2 ) 3 CNH 2 (0,1 M) e 100 ml de solução aquosa de HCl (0,1 M). Numa placa com agitação, colocar um copo de vidro de 200 ml com um barra magnética no interior e misturar 100 ml da solução aquosa de (HOCH 2 ) 3 CNH 2 (0,1 M) com 93,2 ml da solução aquosa de HCl (0,1 M), sempre com agitação; confirmar o ph da solução com o potenciómetro 25

4 devidamente calibrado. Colocar a solução num balão de 200 ml, perfazer o volume do balão com água destilada e armazenar em refrigeração (2 a 5 C). Preparação de Solução de Carbonato de Sódio 1 M: Pesar 10,6 g de carbonato de sódio para um de 100 ml. Adicionar um pouco de água destilada até a dissolução do composto e depois perfazer o volume com água destilada. Armazenar a solução em refrigeração (2 a 5 C). Preparação de Solução Cloreto de Cálcio a 1%: Pesar 1 g de cloreto de cálcio para um balão de 100 ml. Adicionar um pouco de água destilada até a dissolução do composto e perfazer o volume com água destilada. Armazenar a solução em refrigeração (2 a 5 C). Preparação de Solução de Alginato de Sódio a 2%: Pesar 0,2 g de alginato de sódio directamente para o copo de vidro e adicionar 10 ml de água destilada. Colocar a solução a aquecer em banho-maria e com agitação, até à completa dissolução do composto verificar a temperatura do banho-maria com termómetro de modo a que não ultrapasse os 70 C. Após dissolução do composto, desligar o aquecimento mas manter a agitação até que a solução seja utilizada. Preparação da enzima imibond galactosidase SPRIN para utilização em ensaios: Colocar a quantidade de enzima a utilizar dentro de um copo de vidro, retirar com a ajuda de uma seringa com filtro a solução de glicerol onde a enzima se encontra armazenada. Proceder a três lavagens com o volume de solução tampão de fosfato de potássio a 20 mm, 6,8 necessário, sendo que 1g de preparação enzimática necessita 4 ml de solução tampão em cada lavagem. Retirar a solução tampão no final de cada lavagem com a seringa com filtro. A enzima está pronta para ser utilizada nos diferentes ensaios. 26

5 Preparação das soluções de o-npg: Pesar 0,0075; 0,0151; 0,0226; 0,0301; 0,0376; 0,0452 g de o-npg para balões de vidro de 10 ml e dissolver em solução tampão de fosfato de postássio 0,1M, ph 6,8 ou em Tris-HCL 0,1 M, ph 7,0. Perfazer o volume com solução tampão de modo a que se obtenham soluções de concentração 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15 mm. Preparação das soluções padrão de o-np: Pesar 0,0139 g de o-npg para um copo de vidro e dissolver em solução tampão de fosfato de postássio 0,1M, ph 6,8 ou em Tris-HCL 0,1 M, ph 7.0. Transferir a solução para um balão de 100 ml e perfazer o volume com solução tampão correspondente. Retirar os seguintes volumes de solução para balões de 10 ml: 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,35; 0,40; 0,45; 0,50.Perfazer com solução tampão o volume dos balões e homogeneizar de modo a obter-se padrões de concentração: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 µm. Preparação das soluções padrão de glucose : Pesar 0,45 g de glucose para um copo de vidro e dissolver em solução tampão de fosfato de postássio 0,1M, ph 6,8 e transferir para um balão de 50 ml, prefazendo o volume com a mesma solução tampão de modo a que se obtenha uma solução de glucose de concentração 50 mm. Retirar os seguintes volumes da solução anteriormente para balões de 10 ml: 0,05; 0,10; 0,15; 0,18; 0,2; 0,25; 0,30; 0,35; 0,38; 0,40. Perfazer com solução tampão o volume dos balões e homogeneizar de modo a obter-se padrões de concentração:0,25; 0,5; 0,75; 0,9; 1; 1,25;1,5;1,75;1,9 e 2 mm. Preparação das soluções padrão de Lactozym 2600 L para o ensaio de Bradford: Pipetar 0,1 ml de preparação enzimática Lactozym 2600 L para um eppendorf de 1 ml e e adicionar 0,9 ml de solução tampão de fosfato de postássio 0,1M, ph 6,8. Retirar os volumes da solução mãe de 2, 5, 10, 15, 20, 27

6 25, 30, 40, 50 e 60 µl eppendorfs de 1 ml e adicionar volumes de solução tampão de 998, 995, 990, 985, 980, 975, 970, 960, 950, 940 µl, respectivamente, a cada eppendorf, de modo a obter soluções padrão de concentração 0,230; 0,575; 1,150; 1,725; 2,300; 2,875, 3,450; 4,600; 5,750; 6,900 µg/ml. Homogeneizar no vortex. Preparação das diluições de Lactozym 2600 L utilizadas paras os ensaios com enzima livre: Retirar os seguintes volumes da preparação enzimática: 0,02; 0,01; 0,008; 0,005; 0,004; para balões de vidro de 10 ml e perfazer o volume com solução tampão fosfato de postássio 0,1M, ph 6,8. e homogeneizar de modo a se obter soluções de concentração 2,300; 1,150; 0,920; 0,575; 0,460 mg/ml. Preparação de Solução de Ácido Sulfúrico 12N: Pipetar 16 ml de solução de ácido sulfúrico % para um balão de vidro com água desionizada. Esta operação tem que ser realizada na hote. Adicionar água desionizada, lentamente através de uma pipeta de plástico até perfazer o volume do balão, e homogeneizar. Preparação do reagente de ensaio para a quantificação da glucose: Transferir o conteúdo da cápsula contendo o reagente glucose oxidase/peroxidase fornecido no Kit de Ensaio Glucose Oxidase Sigma-Aldrich para um frasco âmbar e adicionar 39,2 ml de água desionizada, homogeneizando. Reconstituir os 5 mg de reagente o-dianisidina, fornecidos no Kit de Ensaio Glucose Oxidase Sigma-Aldrich, com 1 ml de água desionizada, invertendo várias vezes até total dissolução do seu conteúdo. Adicionar 0,8 ml de reagente o-dianisidina reconstituído anteriormente ao frasco âmbar onde se encontra o reagente glucose oxidase/peroxidase, homogeneizando. A solução é estável por um mês e deverá ser armazenada entre 2 e 8 C. 28

7 2.5. Métodos analíticos Ensaio para a quantificação de açúcares redutores: Método DNS Um dos métodos empregados na quantificação de açúcares redutores é o método do DNS. É um método rápido e prático na determinação de açúcares redutores, e tem grande aplicabilidade industrial. Como exemplo de aplicação temos: controle de qualidade na caracterização das matériasprimas para fins de processamento, e verificação se determinado produto está dentro dos parâmetros e padrões exigidos pela legislação; indústria açucareira, no acompanhamento do processo de fermentação, que permite verificar as taxas de consumo de açúcar pelo microorganismo. A determinação de açúcares redutores pelo método do DNS baseia-se na redução, em meio alcalino, do 3,5-dinitrosalicilico (de coloração amarela). O produto formado, 3-amino 5-nitrosalicilato, é estável e apresenta coloração laranja-avermelhado (3-amino-5-nitro-salicilato) e máxima absorção da luz visível no comprimento de onda de 535 nm (34). Figura 5 Redução do reagente 3,5-dinitrosalicilico (35) Técnica Em cada poço da microplaca Nuclon TM Delta Surface colocar 250 µl de amostra ou de solução padrão de glucose e adicionar 250 µl de ácido dinitrosalícilico. Tapar a microplaca e colocar em banho de água a 100 C 29

8 durante cinco minutos. A absorvância das amostras foi medida a 563 nm, numa cuvete Eppendorf num fotómetro Eppendorf, BioPhotometer. Curva de calibração Para a realização da curva de calibração foram utilizadas soluções padrão de glucose com concentrações entre 0,25 e 2 mm. 0,6 Absorvância 563 nm 0,5 0,4 0,3 0,2 0, ,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 2,25 Concentração de glucose (mm) y = 0,2605x - 0,0438 R² = 0,9969 Gráfico 1. Curva de calibração da glucose (Método DNS) Método de Bradford para determinação da proteína O ensaio de Bradford engloba várias preparações do corante Coomassie azul brilhante usado com o objectivo de quantificar proteínas, e foi descrito pela primeira vez por Bradford (1976). No método de Bradford, o analito é colocado em contacto com uma solução do corante Coomassie G-250 azul brilhante e é permitida a sua incubação por um curto período de tempo. O corante ir-se-á ligar aos aminoácidos básicos ou aromáticos. Em consequência da ligação à proteína uma alteração metacromática, para uma cor avermelhada, de 465 para 595 nm é observada devido à estabilização da forma aniónica do corante. A maioria do sinal 30

9 observado deve-se à interacção com os resíduos de arginina. A absorvância é lida espectrofotometricamente e, através da aplicação de uma curva de calibração e da Lei de Lambert-Beer, a concentração de proteína pode ser calculada a partir da absorvância (35). As vantagens do ensaio de Bradford incluem a fácil execução, a elevada sensibilidade e o baixo custo dos reagentes (36). O ensaio de Bradford é sensível a interferências de vários reagentes, onde estão incluídas a maioria dos detergentes iónicos e não-iónicos, hidratos de carbono, sais e proteínas glicosiladas (35) Técnica Em cada poço da microplaca Nuclon TM Delta Surface colocar 100 µl de amostra ou de solução padrão e adicionar 25 µl de reagente Bradford. A absorvância das amostras foi medida a 595 nm, numa cuvete Eppendorf num fotómetro Eppendorf, BioPhotometer entre 2 a 5 minutos após o início da reacção. Curva de calibração Para a realização da curva de calibração foram utilizadas soluções padrão de enzima (Lactozym 2600 L) com concentrações entre 0,2 e 6,9 µg/ml. 31

10 2,50 y = 0,3109x + 0,1761 R² = 0,9943 Absorvância 595 nm 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 Concentração de Lactozym (ug/ml) Gráfico 2. Curva de calibração de proteína (Método Bradford) Doseamento da hidrólise enzimática de o-npg: método colorimétrico Medidas de absorção da radiação ultravioleta e visível têm uma vasta aplicação na determinação quantitativa numa grande variedade de espécies orgânicas e inorgânicas. Esta técnica baseia-se na medida da transmitância T ou absorvância A de soluções contidas em células transparentes, tendo um caminho óptico de b em centímetros. Deste modo a concentração c de um analito absorvente está relacionada linearmente à absorvância, conforme Equação 1. Lei de Lambert-Beer MATERIAIS E MÉTODOS representado pela equação e explicado pela lei de Lambert-Beer. 32

11 Apesar da lei de Lambert-Beer possuir algumas limitações, existem poucas excepções para a generalização de que a absorvância está relacionada linearmente com o caminho óptico. No entanto, desvios de proporcionalidade entre a absorvância medida e a concentração quando b é constante, são encontrados frequentemente. Outros desvios ocorrem em consequência do modo como as medidas de absorvância são feitas ou em resultado de mudanças químicas associadas com variações de concentração. Estas duas últimas são conhecidas, respectivamente, como desvios instrumentais e desvios químicos. A lei de Lambert-Beer é bem sucedida ao descrever o comportamento da absorção de meios contendo concentrações de analito relativamente baixas. Em altas concentrações (> 0.01M) a distância média entre as moléculas responsáveis pela absorção diminui a ponto de cada molécula afectar a distribuição de carga das moléculas vizinhas. Esta interacção poderá alterar a capacidade das moléculas de absorver um determinado comprimento de onda da radiação. Como extensão da interacção depende da concentração, a ocorrência deste fenómeno causa um desvio da relação linear entre a absorvância e a concentração. Desvios da lei de Lambert-Beer também aparecem porque (coeficiente molar de extinção) depende do índice de refracção do meio. Ou seja, se as variações de concentração causam alterações significativas no índice de refracção n de uma solução, desvios da lei de Beer são observados (36). Neste estudo, a actividade enzimática foi medida usando o-nitrofenol-β- ᴅ-galactosideo (o-npg) como substrato. Os produtos da hidrólise deste substrato são a galactose e o-nitrofenol e o mecanismo enzimático é semelhante ao da hidrólise da lactose (24,27). A reacção foi parada pela adição de carbonato de sódio que para além de alterar o ph do meio para 11, desnaturando a enzima, também faz exacerbar a cor amarela do o-nitrofenol (13,7). Esta cor é medida por espectrofotometria de absorção molecular no comprimento de onda de

12 nm contra um branco. Para isso, foi utilizado um espectrofotómetro HITACHI U2000 UV-VIS. Figura 6. Reacção de hidrólise do o-npg pela β-galactosidase (37) O espectrofotómetro utilizado tem feixe duplo e uma gama de comprimento de onda que se situa entre os 220 e os 850 nm e opera com uma lâmpada de deutério Curva de calibração de o-np Para a realização da curva de calibração foram retirados 500 µl de soluções padrão de o-np com concentrações entre 5 e 50 µm para eppendorfs contendo 500 µl de carbonato de sódio. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. Absorvância 410 nm 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0, y = 0,0017x + 0,0671 Concentração de o-np (um) R² = 0,9831 Gráfico 3. Curva de Calibração de o-np 34

13 Kit Glucose-Oxidase Sigma-Aldrich para determinação da glucose Este ensaio tem como objectivo a quantificação da glucose através de métodos enzimáticos em alimentos e outros materiais. Devido à alta especificidade e sensibilidade das enzimas, ensaios quantitativos podem ser realizados em materiais em bruto com pouca ou mesmo nenhuma preparação. No entanto, as amostras poderão ter que ser diluídas em água desionizada e filtradas ou desproteinizadas se for necessário para clarificar a solução. Amostras carbonatadas ou fermentadas necessitam ser desgaseificadas. Neste ensaio, a glucose existente na amostra é oxidada a ácido glucónico e a peróxido de hidrogénio pela enzima glucose oxidase. O peróxido de hidrogénio reage com a o-dianisidina na presença da enzima peroxidase e forma um produto de cor castanha. A o-dianisidina oxidada reage depois com o ácido sulfúrico e forma um produto mais estável e de cor rosa. A intensidade da cor do produto final é depois medida a 540 nm e é proporcional à concentração de glucose existente na amostra. Glucose Oxidase ᴅ-Glucose + H 2 O + O 2 Ácido ᴅ-Gluconico + H 2 O 2 Reduzido Peroxidase Oxidado H 2 O 2 + o-dianisidina o-dianisidina (sem cor) (castanho) o-dianisidina Oxidado (castanho) H 2 SO 4 o-dianisidina Oxidado (cor-de-rosa) Figura 7. Esquema da reacção de determinação da glucose pelo teste da glucose/oxidase (38) 35

14 Técnica Foram colocados volumes de leite UHT magro, meio gordo e gordo MIMOSA e das preparações enzimáticas, nas proporções indicadas na tabela 4., em tubos falcon de 50 ml, a 20 C e 37 C e a 200 rpm no agitador orbital Aralab Agitorb 160E. Foram retiradas alíquotas de 500 µl de todas as amostras para eppendorfs de 1 ml aos 0, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos, e colocados em gelo. No final do ensaio, as amostras e a solução padrão de glucose fornecida com o kit de ensaio foram transferidas para tubos de ensaio de vidro e colocadas em banho de água a 99 C durante 5 minutos. As amostras foram arrefecidas à temperatura ambiente e foi adicionado, a cada tubo e com um intervalo de 30 segundos entre tubos, 1 ml de reagente de ensaio. As amostras foram colocadas em banho de água a 37 C durante 30 minutos. Após decorrido este período de tempo, os tubos de ensaio contendo as amostras foram retirados do banho e foi colocado 1 ml de ácido súlfúrico 12 N em cada tubo, com um intervalo de 30 segundos entre tubos, para parar a reacção. Foi colocado 1,5 ml de cada amostra em eppendorfs de 1,5 ml e centrifugadas a rpm durante 5 minutos numa microcentrifuga Heraeus Biofuge Pico Foram lidas as absorvâncias a 540 nm, num espectrofotómetro Hitachi U2000 UV-VIS em cuvetes de vidro. Tabela 4. Quantidades de leite e de preparações enzimáticas utilizadas nos ensaios. Preparação enzimática Volume de leite (ml) Quantidade de preparação enzimática SPRIN 5 50 mg Esferas de Alginato 5 2,5 ml Lactozym 2600 L 9,5 0,5 ml A quantificação da glucose na amostra é depois realizada através da aplicação da equação seguinte: 36

15 Equação 2. Quantificação da glucose de acordo com o teste glucose/oxidase 2.6. Métodos experimentais Imobilização Apesar da muitas indústrias ainda utilizarem a enzima livre para a hidrólise da lactose, a imobilização da β-galactosidase é uma área que tem vindo a ganhar importância devido aos seus potenciais benefícios. A utilização de tecnologia de imobilização é de importância significativa do ponto de vista económico pois torna possível a reutilização enzimática e o uso das enzimas em processos contínuos. Pode, também, ajudar a melhorar a estabilidade enzimática. A utilização de β-galactosidase imobilizadas tem sido, intensivamente, empregue na hidrólise de leite e de soro de queijo. Como foi referido anteriormente, existem várias técnicas de imobilização e vários suportes onde a imobilização pode ser realizada. A escolha da técnica de imobilização e do suporte depende da enzima e do objectivo do estudo. Neste estudo, a técnica de imobilização utilizada foi a de encapsulamento, e O alginato é, de longe, o polímero mais utilizado para técnicas de imobilização e microencapsulação. O alginato é um extracto de uma alga marinha composta por cadeias de ácido α-l-glucorónico e de ácido β-ᴅmanurónico, alternados. O seu uso em alimentos é considerado seguro (39). Os MATERIAIS E MÉTODOS o suporte escolhido foi o alginato de cálcio. 37

16 suportes em alginato são, geralmente, conseguidos, através do cross-linking do grupo carboxil do α-l-glucorónico com a solução contendo um catião tal como o cloreto de cálcio, cloreto de bário ou poli(l-lisina). Matrizes de alginato em cross link com Ca 2+ são, contudo, instáveis em ambientes fisiológicos ou em soluções tampão comuns com grandes concentrações de iões fosfato ou citrato pois podem extrair o Ca 2+ do alginato e liquefazer o sistema (31) Técnica Adicionou-se a 10 ml de solução aquosa de alginato de sódio (2%) Lactozym 2600L Sigma-Aldrich de 150, 250, 350 e 500 µl e deixou-se 10 minutos numa placa de agitação. Após decorrido este período de tempo, colocou-se a solução mistura de polímero e enzima numa seringa de 5 ml com uma agulha de 0,6 mm seringa da bomba-seringa automática da New Era Pump Systems, Inc. e gotejou-se com um caudal 900 µl por minuto para a solução de extrusão de cloreto de cálcio a 1%, que se encontrava numa tina com gelo, na placa com agitação. No final da extrusão, as esferas foram deixadas 5 minutos na solução de Cloreto de Cálcio ainda em gelo, com agitação, para consolidação das mesmas. Decorrido este período de tempo, as esferas foram retiradas da solução de extrusão e lavadas duas vezes com 20 ml de solução tampão. As esferas ficaram armazenadas no frigorífico (2 a 5 C) em solução tampão de Tris- HCl, durante 24 horas antes de serem utilizadas em ensaio. Cada esfera possuía um volume 10 µl e um diâmetro de 2 mm. 38

17 Figura 8. Esferas de alginato de cálcio (2%) Avaliação da Influência da Concentração de Enzima Para avaliar a influência da concentração de enzima foram realizados ensaios a 37 C, utilizando-se uma solução de substrato de concentração 15 mm de o-npg em solução tampão de fosfato de potássio, ph 6,8 a 0,1 M para os ensaios com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich e para os ensaios com imibond galactosidase SPRIN e uma solução de o-npg da mesma concentração mas realizada em solução tampão de Tris-HCl, ph 7,0 a 0,1M para os ensaios com a enzima imobilizada em alginato de cálcio Técnica Com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich: Colocou-se 9,5 ml de solução de substrato em tubos falcon de 10 ml com 0,5 ml de enzima com concentrações de 2,300; 1,150; 0,920; 0,575; 0,460 mg/ml, em banho de água Julabo SW 21 termostatizado e com agitação de 80 rpm. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. 39

18 Com SPRIN imibond galactosidase: Colocou-se 5 ml de solução de substrato em frascos de 7 ml com 20, 30, 40, 50 e 60 mg de enzima, no agitador orbital Aralab Agitorb 160E com agitação de 200 rpm. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. Com esferas de alginato de cálcio (2%) contendo Lactozym 2600L imobilizada: Colocou-se 5 ml de solução de substrato em frascos de 50 ml com 2,5 ml de esferas de alginato com concentrações de enzima de 17,25; 28,75; 40,25; 57,5 µg/ml no agitador orbital Aralab Agitorb 160E com agitação de 200 rpm. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm Avaliação da Influência da Concentração de Substrato Para avaliar a influência da concentração de substrato foram realizados ensaios a 37 C, utilizando-se concentrações das preparações enzimáticas fixas. Foram utilizadas soluções de substrato de concentrações 2,5; 5; 7,5; 10 e 15 mm em solução tampão de fosfato de potássio, ph 6,8 a 0,1 M para os ensaios com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich e para os ensaios com imibond galactosidase SPRIN e soluções de o-npg das mesmas concentrações mas realizada em solução tampão de Tris-HCl, ph 7,0 a 0,1M para os ensaios com a enzima imobilizada em alginato de cálcio. 40

19 Técnica Com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich: Colocaram-se 9,5 ml de cada solução de substrato em tubos falcon de 10 ml com 0,5 ml de enzima com concentração de 0,920 mg/ml, em banho de água Julabo SW 21 termostatizado e com agitação de 80 rpm. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1 M aos 0, 5, 10, 15,20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. Com imibond galactosidase SPRIN : Colocaram-se 5 ml de cada solução de substrato em frascos de 7 ml com 50 mg de enzima, no agitador orbital Aralab Agitorb 160E com agitação de 200 rpm. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1M aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. Com esferas de alginato de cálcio (2%) contendo Lactozym 2600L imobilizada: Colocaram-se 5 ml de cada solução de substrato em frascos de 50 ml com 2,5 ml de esferas de alginato com uma concentração de enzima de 40,25 µg/ml no agitador orbital Aralab Agitorb 160E com agitação de 200 RPM. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. 41

20 Estudo do Efeito da Temperatura Para estudar o efeito da temperatura sobre a reacção de hidrólise enzimática do o-npg foram realizados ensaios a várias temperaturas mantendo com uma concentração fixa de cada enzima e uma concentração fixa de substrato, o-npg, de 15 mm em solução tampão de fosfato de potassio, ph 6,8 a 0,1 M para os ensaios com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich e para os ensaios com imibond galactosidase SPRIN e solução de o-npg da mesma concentração mas realizada em solução tampão de Tris-HCl, ph 7,0 a 0,1 M para os ensaios com a enzima imobilizada em alginato de cálcio Técnica Com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich: Colocou-se 9,5 ml de solução de substrato em tubos falcon de 10 ml com 0,5 ml de enzima com concentração de 0,920 mg/ml, em banho de água Julabo SW 21 termostatizado a 15, 20, 30, 37, 50, 60. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 5, 10, 15,20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. Com imibond galactosidase SPRIN : Colocou-se 5 ml de solução de substrato em frascos de 7 ml com 50 mg de enzima, no agitador orbital Aralab Agitorb 160E com agitação de 200 rpm, a temperaturas de 20, 30, 37, 50, 60 C. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. 42

21 Com esferas de alginato de cálcio (2%) contendo Lactozym 2600L imobilizada: Colocaram-se 5 ml de cada solução de substrato em frascos de 50 ml com 2,5 ml de esferas de alginato com concentração de enzima de 40,25 µg/ml no agitador orbital ABALAB Agitorb 160E com agitação de 200 rpm, a temperaturas de 20, 30, 37 e 50 C. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm Ensaios de Reutilização Com as preparações de enzima imobilizadas, imibond galactosidase SPRIN e esferas de alginato contendo Lactozym 2600L imobilizada foram realizados ensaios de reutilização com o objectivo de avaliar a hidrólise enzimática do o- npg em contínuo. Nestes ensaios, foi utilizada uma solução de o-npg de 15 mm em solução tampão de fosfato de potássio, ph 6,8 a 0,1 M para os ensaios com imibond galactosidase SPRIN e solução de o-npg da mesma concentração mas realizada em solução tampão de Tris-HCl, ph 7,0 a 0,1 M para os ensaios com a enzima imobilizada em alginato de cálcio Técnica Com imibond galactosidase SPRIN : Colocou-se 5 ml de solução de substrato em frascos de 7 ml com 50 mg de enzima no agitador orbital a 37 C, com agitação de 200 rpm. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1M ao final de 0, 30 e 60 minutos de ensaio. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. Aos 43

22 60 minutos a solução de substrato era substituída por uma nova solução de igual concentração. Com esferas de alginato de cálcio (2%) contendo Lactozym 2600L imobilizada: Colocou-se 5 ml de soluções de substrato frascos de 50 ml com 2,5 ml de esferas de Alginato com a concentração de enzima de 40,25 µg/ml, no agitador orbital a temperaturas de 37 C, com agitação de 200 RPM. Foram retiradas alíquotas de 500 µl para eppendorfs de 1 ml contendo 500 µl de solução de carbonato de sódio a 1M ao final de 0, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos de ensaio. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. A cada 180 minutos de ensaio a solução de substrato era substituída por outra de igual concentração Ensaios de bioconversão da lactose em leite Técnica Foram colocados 5 ml de leite UHT meio-gordo MIMOSA em frascos de 7 ml com as concentrações de enzima imibond galactosidase SPRIN indicadas na tabela 5, às temperaturas indicadas na tabela 5 a 200 rpm no agitador orbital. Foram retiradas alíquotas de 500 µl de todas as amostras para eppendorfs de 1 ml aos nos tempos indicados na tabela 5, e colocados em gelo. No final do ensaio, as amostras e a solução padrão de glucose fornecida com o kit de ensaio foram transferidas para tubos de ensaio de vidro e colocadas em banho de água a 99 C durante 5 minutos. As amostras foram arrefecidas à temperatura ambiente e foi adicionado, a cada tubo e com um intervalo de 30 segundos entre tubos, 1 ml de reagente de ensaio. As amostras foram colocadas em banho de água a 37 C durante 30 minutos. Após decorrido este 44

23 período de tempo, os tubos de ensaio contendo as amostras foram retirados do banho e foi colocado 1 ml de ácido súlfúrico 12 N em cada tubo, com um intervalo de 30 segundos entre tubos, para parar a reacção. Foi colocado 1,5 ml de cada amostra em eppendorfs de 1,5 ml e centrifugadas a rpm durante 5 minutos numa microcentrifuga Heraeus Biofuge Pico Foram lidas as absorvâncias a 540 nm, num espectrofotómetro Hitachi U2000 UV-VIS em cuvetes de vidro Delineamento experimental para modelação da bioconversão da lactose A influência da concentração da enzima imibond galactosidase SPRIN, da temperatura e do tempo de reacção na bioconversão da lactose em leite meio-gordo foi avaliada utilizando um delineamento experimental baseado no método das superfícies de resposta, designado por RSM (Response Surface Methodology). Esta modelação permite testar várias variáveis em simultâneo, com um número reduzido de ensaios, e diminuir o tempo e os custos da experimentação. A metodologia das superfícies de resposta (RSM) consiste num conjunto de métodos matemáticos e estatísticos que utilizam os dados quantitativos, obtidos a partir de condições experimentais apropriadas, na determinação e resolução de equações multivariadas, na modelação do fenómeno em causa e no estabelecimento de combinações entre vários factores experimentais (variáveis) que na globalidade vão originar a resposta óptima. As equações podem ser representadas graficamente de forma a originar a superfície de resposta de três formas diferentes: (i) descrever como as variáveis afectam a resposta; (ii) determinar como as variáveis se interrelacionam e (iii) descrever o efeito combinado de todas as variáveis na resposta (40). As principais etapas a considerar na aplicação da Metodologia das Superfícies de Resposta, incluem (40): (i) escolha das variáveis mais 45

24 importantes, (e.g. concentração de enzima, concentração substrato, tempo, temperatura); (ii) definição da respectiva gama de trabalho (com base nas informações obtidas em ensaios preliminares); (iii) determinação dos ensaios a realizar através de um delineamento experimental adequado; (iv) análise e interpretação dos resultados. Um dos métodos mais utilizados na metodologia das superfícies de resposta com a finalidade de se ajustar a uma resposta de superfície de segunda ordem é o delineamento central compósito rotativo (CCRD - Central Composite Rotatable Desgn ). Este, tem como base p variáveis e baseia-se na escolha de 3 conjuntos de pontos experimentais. O primeiro conjunto com 2 p pontos representa os vértices de um cubo centrado na origem do sistema codificado de referência apresentando esses pontos um número de código de + 1 ou 1. O segundo conjunto toma a forma de uma estrela de 2p pontos nos eixos do sistema de referência a uma distância de 2 p/4 da origem. O terceiro conjunto é constituído pelos pontos da origem (pontos centrais) (41). A análise dos resultados experimentais permite o desenvolvimento de curvas de regressão que descrevem matematicamente o sistema e permitem retirar conclusões relativamente ao seu comportamento. As equações polinomiais podem gerar as chamadas respostas de superfície que permitem visualizar o grau de dependência, a interacção entre as variáveis e nalguns casos identificar as condições reaccionais óptimas (41). Para a modelação da bioconversão da lactose no leite pela enzima imibond galactosidase SPRIN, pela metodologia das superfícies de resposta foi utilizado o delineamento central compósito rotativo, testando em simultâneo as variáveis: concentração de biocatalisador, tempo e temperatura. O delineamento experimental foi efectuado com recurso ao software Statistica TM (versão 9 da Statsoft, USA) que seleccionou os valores das três variáveis em estudo (concentração biocatalisador, temperatura e tempo), a 46

25 utilizar nos ensaios em leite, com base nos resultados obtidos em soluções modelo (Tabela 5.) Tabela 5. Valores experimentais das duas variáveis testadas em simultâneo e respectivos níveis codificados por aplicação do CCRD. Níveis codificados imibond galactosidase Tempo (min) Temperatura (ºC) SPRIN (mg/ml) (-1,-1, -1) 4,00 15,00 23,00 (-1,-1, 1) 4,00 15,00 37,00 (-1, 1, -1) 4,00 45,00 23,00 (-1, 1, 1) 4,00 45,00 37,00 (1,-1, -1) 12,00 15,00 23,00 (1,-1, 1) 12,00 15,00 37,00 (1, 1, -1) 12,00 45,00 23,00 (1, 1, 1) 12,00 45,00 37,00 (-1,68, 0, 0) 1,27 30,00 30,00 (1,68, 0, 0) 14,73 30,00 30,00 (0, -1,68, 0) 8,00 4,77 30,00 (0, 1,68, 0) 8,00 55,23 30,00 (0, 0, -1,68) 8,00 30,00 18,23 (0, 0, 1,68) 8,00 30,00 41,77 (0, 0, 0) 8,00 30,00 30,00 (0, 0, 0) 8,00 30,00 30,00 47