MECANISMO DE AÇÃO VASORRELAXANTE DA 6 [(E) ESTIRIL] PIRONA EXTRAÍDA DA Aniba panurensis (Meisn)Mez(Lauraceae) EM RATOS

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA THAIS JOSY CASTRO FREIRE DE ASSIS MECANISMO DE AÇÃO VASORRELAXANTE DA 6 [(E) ESTIRIL] PIRONA EXTRAÍDA DA Aniba panurensis (Meisn)Mez(Lauraceae) EM RATOS JOÃO PESSOA - PB 2012

2 2 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS MECANISMO DE AÇÃO VASORRELAXANTE DA 6 [(E) ESTIRIL] PIRONA EXTRAÍDA DA Aniba panurensis (Meisn)Mez(Lauraceae) EM RATOS THAIS JOSY CASTRO FREIRE DE ASSIS Tese apresentada ao Programa de Pós graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para a obtenção do título de DOUTORA EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de concentração: FARMACOLOGIA Orientador: Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros JOÃO PESSOA 2012

3 3 THAIS JOSY CASTRO FREIRE DE ASSIS MECANISMO DE AÇÃO VASORRELAXANTE DA 6 [(E) ESTIRIL] PIRONA EXTRAÍDA DA Aniba panurensis (Meisn)Mez(Lauraceae) EM RATOS Tese apresentada ao Programa de Pós graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para a obtenção do título de DOUTORA EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de concentração: FARMACOLOGIA Avaliada em: 14 de agosto de 2012 Profº. Dr. Márcio Roberto V. Santos (UFS) Profº. Dr. Fábio Sampaio (UFPB) Profª. Dra. Sandra R. Mascarenhas (UFPB) Profº. Dr. Luis Fernando M. Santos (UFPB) Profº. Dr. Reinaldo Almeida de Nóbrega (Suplente UFPB) Profª. Dr. Isac A. Medeiros (Orientador - UFPB)

4 Dedicatória 4

5 5 A Maria Eduarda, A flôr do meu dia, que por tantas vezes a privei da minha presença, em busca da realização desse objetivo. Ela que tantas vezes interrompi o sono, por tantas outras não a coloquei para dormir. Quantos momentos eu perdi com a esperança de que um dia ela possa entender. Sigo, minha filha, com a promessa que nunca mais interromperei o seu sono, não mais me permitirei não velá-lo. Por muitas vezes foi com lágrimas nos olhos que realizei o que aqui está escrito, por tantas outras com um sentimento enorme de culpa, mas em todos os momentos com a certeza de que o que fiz e farei é para você. A Maria Fernanda, Ainda no meu ventre, acompanhou os últimos passos desse trabalho, sendo a minha companheira de noites de estudos, e suportando os meus dias interminaveis de experimentos. Minhas desculpas filha. Agora em meus braços, você torna a caminhada final mais leve. A vocês dedico não só esse trabalho, mas a minha vida.

6 Agradecimentos 6

7 7 AGRADECIMENTOS Agradecer é muito mais do que dizer obrigada, ser grato é reconhecer que sozinha não seria capaz de alcançar os maiores objetivos. Agradecer é ter a humildade de reconhecer o quanto você precisa do outro e quanto o outro faz parte de você. Uma jornada dessa grandeza não poderia ser possível se eu não estivesse acompanhada, abençoada e protegida por Deus. O meu centro, o meu prumo, o meu porto seguro, a quem nunca peço tarefas do tamanho das minhas forças, mas sim forças do tamanho das minhas tarefas. Para quem de forma mais completa exponho a minha alma e recebo dele sempre a certeza de que tudo acontece no momento certo, na hora certa, nada é por acaso. E umas das formas que Deus tem de me fazer entender a vida é através da minha mãe, Fátima, a quem aqui faço a minha maior declaração de amor. Ainda bem que eu a tenho, pois pelas suas palvras e gestos sinto que Deus fala por ela. Ela é Deus em pessoa, o amor na forma humana, o mais belo e perfeito exemplo do que um ser humano. Como sempre digo a ela: você não é desse mundo. A meu pai, Assis, que sempre trabalhou e torceu por nós, que sempre teve orgulho, mesmo sem muito falar, das nossas conquistas, pois a cada vitória nossa, a vitória também era dele. Essa é mais uma que a ele dedico. Agradecimento as minhas irmãs, Bel e Pri, companheiras em todos os momentos, são minhas amigas e parceiras, vibram com as minhas conquistas, elas estão em tudo que faço e sou. A vida me presentiou com as mais diversas formas de amor. A vida me possibilitou encontrar o amor em Samyr, meu esposo, e que a tantos anos juntos tenho a cada dia que passa a certeza de que tenho ao meu lado o amor da minha vida, o meu melhor amigo, o meu companheiro de todas as horas, e que comigo está em todas as circunstâncias. A toda a minha família, que soube entender a minha ausência e que sempre partilhou comigo todas as minhas conquistas. Além da familia, um trabalho assim para existir conta com a colaboração e apoio de várias pessoas. Agradeço inicialmente ao Professor Isac Almeida de

8 8 Medeiros pela oportunidade. Ao Professor José Maria Barbosa Filho pela disponibilização da substância. Aos professores do programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos por todos os ensinamentos compartilhados. Em especial a professora Bagnólia Araújo da Silva pela força, pela ajuda imensurável e por ter sido sempre muito amiga, minha gratidão e carinho. Aos Professores Reinaldo Nóbrega e Sandra Mascarenhas, membros da qualificação, que aceitaram contribuir com esse trabalho, com sugestões e conselhos no intuito de engrandecer o trabalho. Aos professores da banca que aceitaram de forma muito solicita o meu pedido para contribuir com esse trabalho. A Professora Aldeidia Oliveira, pela amizade, pelas contribuições e orientações, por sempre muito solicita e por contribuir com a realização deste trabalho. Nessa caminhada também encontramos pessoas que de forma tão intensa nos faz acreditar que a vida nada mais é do que um reencontro. Nessa caminhada encontrei Abrahão Filho, um irmão. Aquele com quem dividi todas as minhas alegrias e angústias, aquele que compartilhei as minhas dúvidas e certezas, aquele que estarei sempre ligada pelos laços de gratidão. A Camila Pinheiro, pela grande amizade e inestimável ajuda na realização deste trabalho. A Kivia Sales e Lais Maria, alunas de iniciação cientifica, que tomaram esse trabalho também como seus, aprenderam e cresceram juntas comigo nesta caminhada, a elas o meu muito obrigada. Aos amigos, Carminha, Thyago e Fabíola, por sempre estarem disponiveis a ajudar, por todas as contibuições essencias para a realização deste trabalho. Ao aluno José Couras, pela contribuição com os experimentos in vivo, por demosntrar que ainda existem pessoas dispostas a ajudar. A minha amiga Raline dos Anjos, por ser sempre presente e companheira. À equipe do Laboratório de Farmacologia Cardiovascular: Aurylenne Carlos, Bruna Priscilla, José George, Jacimara, Juliane, Leônidas, Matheus, Maria Angélica, Mardem, Maria do Socorro, Melissa Luciano, Milena, Mônica Almeida, Natália Tabosa, Priscilla Crispiniano, Priscilla Maciel, Rafael, Robson Veras, Valéria, Valma, William, por toda a ajuda.

9 9 Ao amigo José Crispim Duarte pela grande amizade e dedicação, por estar sempre disposto a ajudar e ensinar. A Tânia, secretária da Pós-graduação, por sempre ter tido comigo uma atenção e carinho sempre que precisei. A Carol, secretária da Pós-graduação, uma flôr no deserto. A Hélia, secretária da Pró-Reitoria de Pós graduação, pela eterna gentileza e doçura, que sempre tentou tornar tudo mais leve. A todos aqueles que entenderam a minha ausência, que se fez necessária para que hoje eu pudesse escrever essas linhas.

10 Resumo 10

11 11 Mecanismo de ação vasorrelaxante da 6 [(E) estiril] pirona extraída da Aniba panurensis (Meisn)Mez(Lauraceae) em ratos ASSIS, T.J.C.F. Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Tese de Doutorado, CCS/UFPB (2012) RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o mecanismo vasorrelaxante da 6 [(E) estiril] pirona (pirona-198), uma estirilpirona natural isolada a partir dos frutos de Aniba panurensis (Meisn.) Mez (Lauraceae), com protocolos in vivo em ratos normotensos e in vitro sobre anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos. Em ratos normotensos não anestesiados, pirona-198 (10, 20, 30 e 40 mg/kg, i.v.) induziu hipotensão e bradicardia. Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, pirona-198 (1 nm - 1 µm) induziu relaxamento das contrações induzidas por fenilefrina (FEN, 10 µm) de maneira dependente de concentração e esse efeito foi significativamente atenuado após a remoção do endotélio vascular. Efeito semelhante ocorreu em anéis pré-contraidos com 1 µm de FEN 7, efeito significativamente atenuado após a remoção do endotélio. Na presença de 100 µm de L- NAME, 10 M de ODQ, 300 µm de PTIO, o relaxamento foi atenuado. O efeito do bloqueio com L-NAME foi completamente revertido em preparações com 1 mm de L-arginina. Na presença de atropina (1 nm) e indometacina (10 M), a resposta induzida pela pirona-198 não foi alterada. A pirona-198 inibiu contrações induzidas por concentrações crescentes de FEN (1 nm 1 mm), como também induziu relaxamento nas contrações induzidas por U46619 (10 M). Em anéis pré-contraídos com S(-) Bay K8644 (200 nm), a pirona promoveu relaxamento tal como, em anéis pré-contraidos com FEN (1 e 10 µm) na presença de nifedipino. A pirona-198 também interferiu na liberação do Ca +2 dos estoques intracelulares mediado por FEN (1 e 10 M). Em preparações incubadas com TEA 3 mm e pré-contraídas com 1 M FEN, o relaxamento da pirona-198 não foi atenuado, diferentemente dos anéis incubados com TEA 3 mm e pré-contraídos com FEN 10 M. Em preparações sem endotélio pré-incubadas com 1 mm de TEA, o relaxamento para pirona-198 foi significantemente atenuado, entretanto, nos anéis sem endotélio a pré-incubação com BaCl 2 (30 M), 4-AP (1 mm) ou GLIB (10 M) não modificou o relaxamento induzido pela pirona-198. Os resultados sugerem a ação da pirona-198 sobre os parâmetros hemodinâmicos, alémde apresentar um potente efeito vasorrelaxante, efeito este mediado parcialmente por mecanismos dependentes do endotélio, envolvendo a via enos/cgs. Como também por mecanismos independentes do endotélio vascular e essa capacidade de promover relaxamento no músculo liso vascular parece atuar interferindo em mecanismos contratéis posteriores à entrada de cálcio, prinicpalmente pela inibição da liberação de Ca +2 dos estoques intracelulares sensíveis ao IP 3, e envolvimento dos canais de potássio sensíveis ao cálcio, efeitos estes com apresentação diferente mediante as concentrações submáxima e máxima de fenilefrina. Palavras-chaves: Aniba panurensis, pirona, hipotensão, anéis mesentéricos, vasorrelaxamento, enos/cgs, cálcio, fenilefrina

12 12 Abstract

13 13 Mechanism of action vasorrelaxante of 6 - [(E) - styryl] pyrone extracted from Aniba panurensis (Meisn) Mez (Lauraceae) in rats ASSIS, T.J.C.F. Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Tese de Doutorado, CCS/UFPB (2012) ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the mechanism of vasorrelaxante 6 - [(E) - styryl] pyrone (pyrone-198), a natural estirilpirona isolated from the fruit of Aniba panurensis (Meisn.) Mez (Lauraceae), with protocols in normotensive rats in vivo and in vitro on the superior mesenteric artery rings isolated from rats. In non-anesthetized normotensive rats, 198-pyrone (10, 20, 30 and 40 mg / kg; iv) induced bradycardia and hypotension. In the superior mesenteric artery rings isolated from rats pyrone- 198 (1 nm - 1 mm) induced relaxation of contractions induced by phenylephrine (Phe, 10 mm) concentration dependent manner and this effect was significantly attenuated after removal of the vascular endothelium. A similar effect occurred in rings precontracted with 1 mm of Phe, an effect significantly attenuated after removal of the endothelium. In the presence of 100 mm of L-NAME, 10 M ODQ, 300 mm of PTIO, the relaxation was attenuated. The effect of blocking with L-NAME was completely reversed in preparations with 1 mm L-arginine. In the presence of atropine (1 nm) and indomethacin (10 M), the response induced by pyrone-198 was not changed. The pyrone-198 inhibited contractions induced by increasing concentrations of Phe (1 nm - 1 mm) as well as the relaxation induced contractions induced by U46619 (10 M). In rings pre-contracted with S (-) Bay K8644 (200 nm) caused a relaxation pyrone the like, in rings pre-contracted with Phe (1 and 10 mm) in the presence of nifedipine. The pyrone-198 also interfered in the release of Ca +2 from intracellular stores mediated by Phe (1 and 10 M). In preparations incubated with 3 mm TEA and pre-contracted with 1 M Phe, relaxation of pyrone-198 was not attenuated, unlike the rings incubated with 3 mm TEA and pre-contracted with FEN 10 M. In preparations without endothelium preincubated with 1 mm TEA, relaxation to pyrone- 198 was significantly attenuated, however, in the ring without endothelium preincubation with BaCl 2 (30 M), 4-AP (1 mm) or GLIB (10 M) did not alter the relaxation induced by pyrone-198. The results suggest the action of pyrone-198 on hemodynamic parameters, alémde vasorrelaxante present a potent effect, an effect mediated in part by endothelium-dependent mechanisms involving via enos / CGs. But also by mechanisms independent of the vascular endothelium and the ability to promote relaxation in vascular smooth muscle seems to act interfering with contractile mechanisms subsequent to the entry of calcium, prinicpalmente by inhibiting the release of Ca +2 from intracellular stores sensitive to IP 3, and engagement channels sensitive potassium calcium, these effects with different presentation by submaximal and maximal concentrations of phenylephrine. Keywords: Aniba panurensis, Pyrone, hypotension, mesenteric rings, vasorelaxation, enos / CGs, Ca 2 +, phenylephrine

14 14 Listas

15 15 Lista de figuras

16 16 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Reação de formação do NO Figura 2- Ilustração da produção, liberação e ação do NO e o papel da enos na sua produção Figura 3 - Folhas e frutos da Aniba panurensis Figura 4 - Estrutura química da 6 [ (E) estiril ] pirona (pirona-198) Figura 5 - Registros originais das respostas de pirona-198 (0,1 nm 1 mm) em anéis pré-contraídos com FEN (10 µm) com o endotélio intacto (a) ou após sua remoção (b) Figura 6 - Registros originais das respostas de pirona-198 (0,1 nm 1 mm) em anéis pré-contraídos com FEN (1 µm) com o endotélio intacto (a) ou após sua remoção (b) Figura 7- Mecanismo de ação dol-name Figura 8 - Mecanismo de ação do PTIO Figura 9 - Fecanismo de ação do ODQ Figura 10 - Mecanismo de ação da atropina Figura 11 - Mecanismo de ação da indometacina Figura 12 - Ilustração dos bloqueadores de canais para potássio Figura 13 - Representação hipotética do mecanismo de ação da pirona

17 17 Lista de esquemas

18 18 LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1 Representação esquemática para verificação da viabilidade do tecido vascular e avaliação da integridade do endotélio vascular. (A) anéis com endotélio funcional e (B) anéis sem endotélio funcional. L = lavagem Esquema 2 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis pré-contraídos com FEN (1 e 10 μm) na presença e na ausência do endotélio funcional. L= lavagem Esquema 3 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis com endotélio funcional e pré contraídos com FEN (1 μm), na presença de inibidores incubados individualmente Esquema 4 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis com endotélio funcional e pré contraídos com FEN (1 μm), na presença de ODQ (10 μm) Esquema 5 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis com endotélio funcional e pré contraídos com FEN (1 μm), na presença de atropina (1 μm) Esquema 6 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis com endotélio funcional e pré contraídos com FEN (1 μm), na presença de indometacina (10 μm) Esquema 7 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante induzido por concentrações isoladas de pirona-198 (10 µm, 100 µm e 1 mm) em anéis sem endotélio funcional frente a concentrações crescentes de FEN (1 nm 10 µm). L= lavagem Esquema 8 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis sem endotélio funcional contraídos com U46619 (10 µm).l = lavagem Esquema 9 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis sem endotélio funcional contraídos com S(-) BayK 8644 (A) e incubados com nifedipino (B). L = lavagem Esquema 10 - Representação esquemática do protocolo experimental para estudo da avaliação dos efeitos de concentrações isoladas de pirona-198 sobre as contrações transientes induzidas por FEN (1 e 10 µm). (L= lavagem; Ty = tyrode).. 77

19 19 Esquema 11 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis com e sem endotélio funcional pré contraídos com FEN 1 μm e 10 μm, respectivamente, na presença de TEA (3 mm) Esquema 12 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis sem endotélio funcional incubados individualmente com bloqueadores de canais para potássio e pré contraídos com FEN (10 μm)... 81

20 Lista de gráficos 20

21 21 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1- Efeitos da pirona-198 (10,20,30 e 40 mg/kg) sobre: PAM e FC em ratos normotensos não anestesiados valores são média ± sem, n=5. 10 versus 20,30,40 mg/kg (*p<0,05, ** p<0,01); 20 versus 30,40 mg/kg ( # p<0.05; ## p<0,001) Gráfico 2 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 10 μm (a) e FEN 1 μm (b) na presença e na ausência do endotélio funcional. Os valores foram expressos como média e.p.m. ** p<0,01; *** p<0,001 versus endotélio intacto Gráfico 3 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 1 μm na presença de L-NAME (100 µm) e L-NAME + l-arginina (1 mm). Os valores foram expressos como média e.p.m. ***p<0,001 versus endotélio intacto Gráfico 4 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 1 μm na presença de PTIO (300 µm). Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05, *** p<0,001 versus endotélio intacto Gráfico 5 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 1 μm na presença e na ausência de ODQ (10 µm). os valores foram expressos como média e.p.m. *** p<0,001 versus endotélio intacto Gráfico 6 Curvas concentração-resposta do efeito vasorelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 1 μm na ausência e presença de atropina (1 nm). Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio intacto gráfico 7 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 1 μm na ausência e presença de indometacina (10 µm). Os valores foram expressos como média e.p.m.*p<0,05 versus endotélio intacto Gráfico 8 Efeito inibitório de pirona-198 sobre a vasoconstricção induzida por FEN (1 nm 1 mm) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato sem o endotélio funcional na presença da FEN (controle) ou na presença da pirona-198. Os valores foram expressos como média e.p.m. ***p<0,001 versus controle Gráfico 9 Curva concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com U46619.Os valores foram expressos como média e.p.m. ***p<0,001 versus endotélio removido Cráfico 10 curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato contraídos com S(-)

22 22 BayK8644. Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido Gráfico 11 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato na presença de nifedipino pré-contraidos com FEN 1 µm (a) e FEN 10 µm (b). Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido Gráfico 12 Barras representativas das contrações transientes induzidas por FEN na ausência e na presença de pirona-198. Contrações transientes induzidas com FEN na concentração de 10 µm (a) e 1 µm (b). Os valores foram normalizados tomando as contrações de FEN na ausência da pirona-198 como sendo 100%. os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05; ***p<0,001 versus controle Gráfico 13 Curva concentração-resposta do efeito vasorelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato sem endotélio funcional pré contraídos com FEN 10 μm na presença e na ausência de TEA (3 mm). Os valores foram expressos como média e.p.m. ***p<0,001 versus endotélio removido gráfico 14 curva concentração-resposta do efeito vasorelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato sem endotélio funcional pré contraídos com fen 1 μm na presença de tea (3 mm). os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido Gráfico 15 Curva concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 10 μm na presença detea 1 mm. os valores foram expressos como média e.p.m. ***p<0,001 versus endotélio removido Gráfico 16 - Curva concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 10 μm na presença de 4-AP. Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido Gráfico 17- Curva concentração-resposta do efeito vasorelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 10 μm na presença debacl 2. os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido Gráfico 18 - Curva concentração-resposta do efeito vasorelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 10 μm na presença glibenclamida. Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido

23 23 Lista de tabelas

24 24 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Valores de pd 2 e E máx para pirona-198 em diferentes condições experimentais em anéis de artéria mesentérica Tabela 2 - Valores de E máx para pirona-198 frente às contrações transientes induzidas pela FEN 10 µm e 1 µm Tabela 3 - Valores de pd 2 e E máx para pirona-198 sob diferentes condições experimentais em anéis de artéria mesentérica na ausência do endotélio funcional

25 25 Lista de quadros

26 26 LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Composição da solução de Tyrode para artéria mesentérica Quadro 2 - Composição da solução de Tyrode livre de cálcio Quadro 3 - Composição da solução despolarizante de Tyrode com KCl a 20 mm Quadro 4 - Composição da solução despolarizante de Tyrode com KCl a 60 mm... 63

27 27 Lista de abreviaturas, siglas e simbolos

28 28 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SIMBOLOS 4-AP AC ACh AMPc Ang II APG ATP BK Ca cadpr CaM Ca V CEPA cgmp CGs CICR COX DC DAG DCV DMSO EGTA E máx enos e.p.m. ET-1 FC FCDE FHDE FRDE 4-aminopiridina Ciclase de adenilil Acetilcolina Monofosfato cíclico de adenosina Angiotensina II Angiosperm Philogeny Group Trifosfato de adenosina Canais para K + sensíveis ao Ca 2+ de alta condutância ADP-ribose cíclica Calmodulina Canais de Ca 2+ dependentes de voltagem Comitê de Ética em Pesquisa Animal 3,5-monofosfato cíclico de guanosina Ciclase de guanilil solúvel Liberação de cálcio induzida por cálcio Ciclooxigenase Débito cardíaco 1,2-diacilglicerol Doenças cardiovasculares Dimetilsulfóxido Ácido tetraacético (N, N, N,N ) bis beta amino étil estér etilenoglicol Efeito máximo Sintase do óxidro nítrico endotelial Erro padrão da média Endotelina-1 Frequência cardíaca Fatores contracturantes derivados do endotélio Fator hiperpolarizante derivado do endotélio Fator relaxante derivado do endotélio

29 29 FEN Fenilefrina GLIB Glibenclamida GMPc Monofosfato cíclico de guanosina GPCR Receptores acoplados a proteína G GTP HAS Trifosfato de guanosina Hipertensão arterial sistêmica inos Sintase do óxido nítrico induzível IP 3 1,4,5-trisfosfato de inositol K ATP Canais para K + sensíveis ao ATP K Ca Canais para K + sensíveis ao Ca 2+ K IR KCl 20 mm KCl 60 mm KCl 80 mm K V L L-NMMA L-NNA L-NAME MLC MLCK MLCP MP MS n OMS NADPH NHA NIF nnos NO Canais para K + retificadores de entrada Solução de Tyrode com [KCl] a 20 mm Solução de Tyrode com [KCl] a 60 mm Solução de Tyrode com [KCl] a 80 mm Canais para K + sensíveis à voltagem Lavagem N g -monometil- L arginina N g nitro L arginina N G -nitro-l-arginina-metil-éster Cadeia leve da miosina Cinase da cadeia leve da miosina Fosfatase da cadeia leve da miosina Membrana plasmática Ministério da Saúde Número de experimentos realizados Organização Mundial de Saúde Nicotinamida-adenina-dinucleotideo-fosfato-hidrogênio N G -hidroxi-l-arginina Nifedipino Sintase do óxidro nítrico neuronal Óxido nítrico NO 2 dióxido de nitrogênio (NO 2 ) NOS Sintase do óxidro nítrico ODQ 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona

30 30 Pressão arterial Logaritmo negativo da concentração responsável por 50% do E máx PA pd 2 PGI 2 PIP 2 PKA PKB PKC PKG PIRONA- 198 PLC PTI PTIO RPT RS RyR S(-) BayK 8644 SERCA SOCCs SRA TEA Prostaciclina fosfatidilinositol 4,5 bifosfato Proteína cinase dependente de AMPc Proteína cinase B Proteína cinase dependente de cálcio Proteína cinase dependente de GMPc 6 [(E) estiril] 2 pirona Fosfolipase C 2-fenill-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil 2-fenil-4,4,5,5-tetrametil-imidazolina-1-oxil-3-oxido Resistência periférica total Retículo sarcoplasmático Receptores de rianodina Ácido3-piridinacarboxilico-1,4-diidro-2,6-dimetil-5-nitro-4-[2- (trifluorometil)fenil]-metil Ester Ca 2+ - ATPase do retículo sarcoplasmático Canais de cálcio sensíveis a estoque Sistema renina angiotensina Tetraetilamônio TXA 2 Tromboxano A 2 Ty Tyrode U ,11-dideoxi-11α, 9α epoximetano prostaglandina F 2 α Observação: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho e que não constam nesta relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas internacionalmente.

31 31 Sumário

32 32 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REFERENCIAL TEÓRICO OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAL ANIMAIS DROGAS SOLUÇÕES NUTRITIVAS MÉTODOS ENSAIOS FARMACOLÓGICOS in vivo Registro da PA e FC em ratos normotensos não anestesiados ENSAIOS FARMACOLÓGICOS in vitro Preparação dos anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS Avaliação da atividade da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica contraídos com FEN (1 μm e 10 μm) Protocolos experimentais realizados em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato na presença do endotélio funcional Verificação da participação da via do NO na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Verificação da participação da via NO / GMPc na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.. 69

33 Verificação da participação dos receptores muscarínicos na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Verificação da participação de metabólitos da via do ácido araquidônico, na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Protocolos experimentais realizados em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato na ausência do endotélio funcional Avaliação da atividade da pirona-198 sobre a indução da contração de FEN em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Avaliação da atividade da pirona-198 frente ao U Investigação do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis pré-contraídos com S(-) Bay K8644 ou na presença de um bloqueador de Ca v tipo L Avaliação do efeito vasorrelaxante da pirona-198 sobre as contrações transientes induzidas por concentrações de FEN (1 e 10 µm) Avaliação da participação dos canais para potássio na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Verificação da participação dos canais para potássio sensíveis à voltagem (K v ) na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Verificação da participação dos canais para potássio retificadores de entrada (K IR ) na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Verificação da participação dos canais para potássio sensível a ATP (K ATP ) na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS RESULTADOS in vivo Efeito da pirona-198 sobre a PAM e FC em ratos Wistar nãoanestesiados ESTUDOS FARMACOLÓGICOS DA PIRONA-198 in vitro... 85

34 Vasorrelaxamento induzido pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos pré-contraídos com fenilefrina (1 µm e 10 µm) na presença e ausência do endotélio funcional EFEITOS DA PIRONA-198 EM ANÉIS DE ARTÉRIA MESENTÉRICA SUPERIOR ISOLADA DE RATO NA PRESENÇA DO ENDOTÉLIO FUNCIONAL Envolvimento da enzina sintase de NO na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Envolvimento do NO na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Envolvimento da via NO / GMPc na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Envolvimento dos receptores muscarínicos na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Envolvimento de metabólitos do ácido araquidônico na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato EFEITOS DA PIRONA-198 EM ANÉIS DE ARTÉRIA MESENTÉRICA SUPERIOR ISOLADA DE RATO NA AUSÊNCIA DO ENDOTÉLIO FUNCIONAL Atividade da pirona-198 sobre a contração induzida por FEN em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Efeito da pirona-198 frente a U Atividade vasorrelaxante da pirona-198 em anéis contraídos com S(-) BayK 8644 e na presença de um bloqueador de Ca v tipo L Envolvimento da pirona-198 sobre as contrações transientes induzidas por FEN (1 e 10 µm)

35 Envolvimento dos canais para potássio no efeito vasorrelaxante da pirona Participação dos canais para potássio sensível ao cálcio (K Ca ) na resposta relaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Participação dos canais para potássio sensíveis à voltagem (K v ) na resposta relaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de rato Participação dos canais para potássio retificadores de entrada - K IR na resposta relaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Participação dos canais para potássio sensível ao ATP na resposta relaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos DISCUSSÃO CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS ANEXOS.. 149

36 36 Introdução

37 37 1 INTRODUÇÃO As últimas décadas têm representado um período de mudanças importantes nas condições de vida e de saúde da população brasileira. Essas transformações interrelacionadas têm produzido um padrão de saúde-doença desafiador para os gestores da saúde pública (MONEGO; JARDIM, 2006). Estudos epidemiológicos têm demonstrado que há uma relação entre o aumento da pressão arterial e doenças cardiovasculares (BALTI et al., 2012). As doenças cardiovasculares (DCV) compreendem um grupo que envolve as doenças do coração (cardiomiopatia, disfunção isquêmica do coração, insuficiência cardíaca congestiva) e dos vasos sanguíneos (doença arterial coronariana, hipertensão e ateroesclerose) (KUMAR et al., 2007). Diversas doenças, como as dislipidemias, a aterosclerose e a hipertensão arterial, apresentam em sua gênese e/ou em seus mecanismos, alterações na função endotelial. Assim, a disfunção endotelial, caracterizada por menor produção e/ou biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), é um dos fatores que contribuem para o aparecimento das doenças cardiovasculares (ZAGO; ZANESCO, 2006). Mecanismos e vias de sinalização envolvidas nas mudanças estruturais patológicas e funcionais das paredes dos vasos são objetos de intensiva pesquisa, pois podem permitir a identificação de potenciais alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novas estratégias farmacológicas (LOIRAND et al., 2006). Como a regulação da pressão arterial envolve a participação da resistência periférica e embora todos os vasos promovam resistência ao fluxo sangüíneo, são as pequenas artérias e arteríolas terminais que são designadas as artérias de resistência, controlando o fluxo e a pressão (SIEGEL, 1996) durante alterações de demanda (CHRISTENSEN; MULVANY, 2001). A utilização da artéria mesentérica é uma ótima estratégia para o estudo de drogas vasodilatadoras, já que ela é um modelo de musculatura lisa vascular. Assim, a busca por substâncias que possam ser potencialmente utilizadas na terapêutica e/ou como ferramentas farmacológicas é o objetivo do estudo com plantas medicinais, que visa avaliar a atividade biológica de plantas e seus constituintes químicos em sistemas, órgãos e tecidos. Após séculos de exploração desordenada da região Amazônica, as espécies da família Lauraceae produtoras de óleos essenciais continuam tendo interesse

38 38 comercial, mas com poucos estudos químicos e farmacológicos. Na biodiversidade Amazônica ainda há espécies da família Lauraceae que nunca foram analisadas, entre as 400 espécies observadas no Brasil (distribuídas em 25 gêneros) (ALCÂNTARA; YAMAGUCHI; VEIGA JÚNIOR, 2010). Entre as espécies que já foram estudadas quimicamente durante as extensas pesquisas realizadas na década de 1970, poucas tiveram seus extratos testados em ensaios farmacológicos, em especial para doenças que mais atingem o homem moderno. Dentre os gêneros da família Lauraceae, está o gênero Aniba, no qual se encontra a espécie Aniba panurensis, cujos efeitos biológicos sobre o sistema cardiovascular não foram até o momento descritos, tal como são escassos os efeitos da 6 [(E) estiril] 2 pirona (a partir deste momento referida como pirona-198), proveniente dos frutos da A. panurensis sobre esse sistema. Assis (2007) em estudos realizados com anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato observou que esta pirona foi capaz de promover um efeito vasorrelaxante envolvendo a ação sobre os mecanismos de sinalização envolvidos quando há ativação de receptores α 1 adrenérgicos tal como atenuação do influxo e da mobilização dos íons cálcio nas células musculares lisas. Justifica-se então a necessidade da realização dos estudos funcionais com esta substância, com o intuito de buscar outros mecanismos de ação que promovam o efeito vasorrelaxante, mediante o fato da escassez de informações na literatura a respeito dos efeitos biológicos da Aniba panurensis tal como da pirona-198 no sistema cardiovascular.

39 39 Referencial teórico

40 40 2 REFERENCIAL TEÓRICO O sistema cardiovascular é o principal sistema responsável pela regulação e manutenção da pressão arterial (PA) (CAMPAGNOLE-SANTOS; HAIBARA, 2001). A homeostase do sistema cardiovascular depende da manutenção do fluxo sanguíneo, da pressão arterial, do débito cardíaco (DC), da resistência vascular periférica (RVP) e de todas as outras variáveis envolvidas em condições normais. A pressão arterial (PA) é resultado do débito cardíaco e da resistência vascular periférica, dada pela seguinte equação: PA = DÉBITO CARDÍACO (DC) X RESISTÊNCIA VASCULAR PERIFÉRICA (RVP) O DC é definido como a quantidade de sangue bombeado pelo coração por unidade de tempo e é determinado pelo volume de ejeção sistólica (VES) e frequência cardíaca (FC) (OATES; apud HARDMAN et al., 1996), expressa pela equação: 1 DC = VOLUME DE EJEÇÃO SISTÓLICO (VES) X FREQUÊNCIA CARDÍACA (FC) A resistência periférica é a oposição imposta ao fluxo de sangue pelos vasos, e é determinada basicamente pelo atrito interno das camadas dos vasos (shear stress) e por fatores dimensionais destes (BELLONI, 1999). O diâmetro individual dos vasos é o fator dimensional mais importante, portanto a regulação do fluxo sangüíneo é alcançada muito mais efetivamente por mudanças no raio do vaso do que alterações na pressão (BELLONI, 1999). A RVP compreende um somatório da reatividade vascular a agonistas contratéis e ao tono basal (resistência espontânea do músculo liso), que está aumentada em pacientes com hipertensão essencial ou secundária (KIM et al., 2005). Manter os níveis pressóricos dentro de uma normalidade depende tanto das variações que ocorrem no débito cardíaco ou na resistência periférica, como nos dois parâmetros. Diferentes mecanismos de controle estão envolvidos não só na manutenção como na variação momento a momento da pressão arterial, regulando

41 41 o calibre e a reatividade vascular, a distribuição de fluido dentro e fora dos vasos e o débito cardíaco (IRIGOYEN; CONSOLIN-COLOMBO; KRIEGER, 2001). A regulação da PA é uma das mais complexas funções fisiológicas, pois é resultante da ação integrada dos sistemas cardiovascular, renal, neural e endócrino, que trabalhando em conjunto são responsáveis pela redistribuição dos vários fluxos regionais através de alterações na resistência total e no débito cardíaco (CAMPAGNOLE-SANTOS; HAIBARA, 2001). A descoberta de novos sistemas e mecanismos que influenciam o débito cardíaco e a resistência vascular periférica e, por conseguinte a PA, contribuiu para a construção de uma complexa rede de interrelações na fisiopatologia de algumas doenças cardiovasculares (DCV), como a hipertensão arterial sistêmica (HAS). Alterações nos mecanismos de retenção renal de sódio, no sistema nervoso simpático, no sistema renina-angiotensina (SRA), na membrana celular, a hiperinsulinemia, entre outros, são parte dessa rede fisiopatológica complexa (LIMA; HATAGINA; SILVA, 2007). As doenças cardiovasculares (DCV) compreendem um grupo que envolve as doenças do coração (cardiomiopatia, disfunção isquêmica do coração, insuficiência cardíaca congestiva) e dos vasos sanguíneos (doença arterial coronariana, hipertensão e ateroesclerose) (KUMAR et al., 2007). As maiores doenças arteriais como ateroesclerose e hipertensão são caracterizadas pela hipertrofia e hiperplasia das células musculares lisas, associadas com acúmulo de matriz extracelular na camada média do vaso, levando ao aumento da espessura da parede do vaso, de tal forma que a perda da capacidade de regular o tônus e o crescimento das células musculares lisas são fatores comuns nessas doenças (LOIRAND et al., 2006). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS, 2012), as doenças cardiovasculares são a causa número um de morte no mundo: mais pessoas morrem anualmente dessas doenças do que de qualquer outra causa. Estima-se que 17,1 milhões de pessoas morrem de doenças cardiovasculares a cada ano, representando 30% de todas as mortes globais. Dessas mortes, uma estimativa é que 7,3 milhões foram devido a doenças coronárias e 6,2 milhões foram por acidente vascular cerebral, doenças essas que aumentam o seu risco de 2 a 3 vezes se o paciente for fumante. Países de baixa e média renda são desproporcionalmente afetados: mais de 80% das mortes por DCV ocorrem em países de baixa e média renda e ocorrem quase igualmente em homens e mulheres. Com base na projeção

42 42 da OMS (2012), em 2030, serão quase 23,6 milhões de óbitos em decorrência de doenças cardiovasculares, principalmente por doença cardíaca e derrame. As doenças cardiovasculares têm sido e continuam a ser, apesar de seu declínio, a causa principal de morte no Brasil (SCHMIDT et al., 2011). Concentram 29,4% do total de óbitos declarados, com 308 mil registros em A taxa de mortalidade decorrente dessa enfermidade caiu 26% em 11 anos, com redução média de 2,2% ao ano, passando de 284 por 100 mil habitantes, em 1996, para 206 por 100 mil habitantes, em 2007 (BRASIL, 2011). O declínio da doença cardiovascular é maior para as doenças cerebrovasculares (34%) e outras formas de doenças do coração (44%). Mortalidade a partir de doença isquêmica cardíaca diminuiu 26%. Mortalidade por doença hipertensiva do coração, pelo contrário, aumentou 11%, crescendo para 13% do total de mortes atribuíveis para doença cardiovascular em 2007, em comparação com 30% para doença isquêmica cardíaca e 32% para doença cerebrovascular. As doenças cardiovasculares geram o maior custo de internação hospitalar no âmbito do sistema nacional de saúde (SCHMIDT et al., 2011). Uma das explicações para o resultado de declínio das doenças cardivasculares é o maior nível de instrução da população e as políticas de prevenção à saúde, como a redução do tabagismo, a promoção de alimentação saudável e o estímulo à atividade física. Várias destas doenças ou condições clínicas apresentam em comum a presença da disfunção endotelial, gerando vasoconstricção, acúmulo de lipídeos, aumento da adesão leucocitária, proliferação de células do músculo liso vascular, agregação plaquetária, trombose entre outros (GIRARDI; GIRARDI; PETERS, 2006). O termo disfunção endotelial é empregado para definir as situações em que o endotélio perdeu sua propriedade vasoprotetora, representando a etapa inicial de vários processos de lesão vascular, como a injúria mecânica, hipercolesterolemia, ateroesclerose, hipertensão arterial sistêmica, entre outros (ITURRY-YAMAMOTO; ALVES; PICON, 1997). O endotélio vascular é uma fina camada de células que recobre a superfície luminal dos vasos sanguíneos, e têm uma larga área para troca de materiais entre o sangue os tecidos (JIN et al., 2010a). Em várias condições clinicas ou doenças podem acarretar disfunção endotelial, gerando vasoconstricção, acúmulo de lipídeos, aumento da adesão leucocitária, proliferação de células do músculo liso

43 43 vascular, agregação plaquetária, trombose entre outros (GIRARDI; GIRARDI; PETERS, 2006). Está estrategicamente situado na parede vascular para: a) atuar como um sensor de alterações hemodinâmicas; b) produzir mediadores que interferem com o crescimento, atividade, migração e morte de células; c) manter as alterações adaptativas de forma que elas se adequem às exigências circulatórias (CARVALHO et al., 2001). As células endoteliais liberam fatores derivados do endotélio como fatores relaxantes (FRDE) e fatores contracturantes (FCDE). Dentre os fatores relaxantes estão o óxido nítrico (NO), prostaglandina I 2 (PGI 2 ) e fatores hiperpolarizantes derivados do endotélio (FHDE) e incluindo os fatores contracturantes estão endotelina (ET-1), prostaglandinas F 2α e tromboxano A 2 (TXA 2 ) (JIN et al., 2008b). O mecanismo básico mediado pelo FHDE pode ser separado em dois estágios: na primeira etapa um aumento na concentração de cálcio intracelular ([Ca 2+ ] i ), que leva a ativação dos canais de potássio sensíveis ao cálcio seguido de efluxo de potássio levando a uma hiperpolarização da membrana plasmática (MP). A etapa seguinte reflete o mecanismo pelo qual a hiperpolarização endotelial é transferida para as células musculares lisas. Nessas células o FHDE ativa canais de potássio sensíveis à voltagem acompanhado do fechamento dos canais de cálcio sensíveis à voltagem (Ca v ), o que resulta em relaxamento (LUKSHA; AGEWALL; KUBLICKIENE, 2009). A regulação do tônus vascular envolve a produção e liberação de metabólitos da via da enzima ciclooxigenase (COX). A ciclooxigenase é uma enzima que catalisa a reação de metabolismo do ácido araquidônico em metabólitos, dentre eles a prostaciclina que é um potente vasodilatador derivado do endotélio vascular importante para a regulação do tônus vascular (FETALVERO; MARTIN; HWA, 2007). A prostaciclina formada no endotélio vascular se difunde até o as células musculares onde promove a ativação de receptores IP que estão acoplados a proteína G s, este acoplamento induz a ativação da enzima adenilil ciclase (AC) levando a um aumento dos níveis de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) no citosol (GALIÉ; MANES; BRANZI, 2001). O aumento do AMPc gera a ativação de uma proteína cinase dependente de AMPc (PKA). Esta proteína quando ativada promove fosforilações na Ca 2+ - ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA), aumentado a recaptação de cálcio do citosol

44 44 para os estoques, promovendo a abertura de canais para potássio, o fechamento de canais para cálcio na membrana e a inibição da cinase da cadeia leve de miosina (MLCK), acarretando em uma diminuição do tônus (YANG; LIN, 2005). A produção endógena de NO tem um papel importante no controle do tônus vascular e pressão sanguínea (IRVINE; FAVALORO; KEMP-HARPER, 2003). Por sua vez, a diminuição dessa produção está relacionada à redução da vasodilatação endotélio-dependente em pacientes com hipertensão, hipercolesterolemia, diabetes ou ateroesclerose (SOUZA et al., 2007). O óxido nítrico é um radical livre, gasoso, lipofílico, mensageiro celular gerado por três isoformas distintas de sintases do NO (NOS): neuronal (nnos), induzível (inos) e endotelial (enos) (NASEEM, 2005). A enos é uma enzima constitutiva ativada por um aumento na concentração intracelular de íons cálcio (Ca 2+ ), induzido por agonistas como a acetilcolina, catecolaminas, trisfosfato de adenosina (ATP), substância P, angiotensina II (Ang II), ou por estímulos físicos, como a força de cisalhamento (shear stress). A ativação da enos também pode acontecer independentemente de um aumento na concentração de Ca 2+, via mecanismos dependentes de tirosina cinase (CARVALHO et al., 2001). Essa via independente para ativação da enos envolve a fosforilação desta via Akt, fazendo-se esta necessária para uma produção eficiente de NO a uma variedade de estímulos (TAGUCHI et al., 2011). Akt é uma cinase serina / treonina, também conhecida como proteína cinase B (PKB) (BALAKUMAR; KAUR; SINGH, 2007), cuja indução da sua atividade está principalmente sob o controle dos produtos da fosfatidilinositol - 3- OH cinase (PI3 cinase). Embora a atividade seja predominantemente dependente da PI3 cinase, existem mecanismos independentes de ativação da Akt, como pela proteína cinase A (PKA), agonistas β-adrenérgicos e stress celular. Essa forma de stress celular inclui isquemia, hipóxia, estresse oxidativo e hipoglicemia (WEST; CASTILLO; DENNIS, 2002). A reação química de síntese do NO envolve duas etapas: na primeira, ocorre a hidroxilação de um dos nitrogênios guanidinos da L-arginina para gerar N G -hidroxi- L-arginina (NHA). Esta reação utiliza nicotinamida-adenina-dinucleotideo-fosfatohidrogênio (NADPH) e oxigênio (O 2 ) e, provavelmente, envolve o complexo heme da NOS. Na segunda etapa, ocorre a conversão da NHA em NO e citrulina (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003). Reação esta ilustrada na figura 1.

45 45 Figura 1 Reação de formação do NO O NO atravessa o espaço do endotélio para o músculo liso vascular e se liga a molécula heme da guanilato ciclase solúvel (GCs) com conseqüente formação do segundo mensageiro 3,5 -monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) intracelular (CERQUEIRA; YOSHIDA, 2002), levando ao relaxamento vascular (KIM et al., 2011). Assim, a regulação da bioatividade do óxido nítrico não é apenas atingida pela modulação da NOS, mas também por afetar CGs, o efetor downstrean intracelular do NO (YETIK-ANACAK; CATRAVAS, 2006). É reconhecido que a ativação da ciclase de guanili solúvel é o principal evento celular que inicia o relaxamento e os eventos que ocorrem após a produção de GMPc são amplamente estudados. As vias de regulação envolvendo a via NO/GMPc/PKG para a promoção do relaxamento envolve a redução das concentrações do cálcio intracelular através do seqüestro e remoção do cálcio pela bomba de cálcio, inibição de canais de cálcio voltagem dependentes e inibição dos receptores acoplados a proteína G no músculo liso (LINCOLN; DEY; SELLAK, 2001) (Figura 2).

46 46 Shear stress ou agonistas GTP Célula muscular L-arg enos NO NO CGs GMPc Ca 2+ Célula endotelial VASODILATAÇÃO Figura 2- Ilustração da produção, liberação e ação do NO e o papel da enos na sua produção A ativação da PKG também promove relaxamento por levar a desfosforilação da cadeia leve de miosina (MLC) por ação direta ou indireta, por induzir mudanças morfológicas consistentes na inibição da via da RhoA. A fosforilação da RhoA contribui para a ação vasodilatadora da via NO/GMPc através da inibição da sensibilização ao cálcio mediada pela Rho-cinase. A regulação da RhoA dependente do NO pode assim ser um componente crucial para determinar a ação do endotélio na parede arterial normal e em condições patológicas, associadas com disfunção endotelial e diminuição da biodisponibilidade do NO (LOIRAND et al., 2006). A PKG regula a fosforilação dos canais de potássio sensíveis ao cálcio (BKCa). O aumento da atividade desses canais hiperpolariza a membrana e reduz o influxo de cálcio intracelular através dos canais de cálcio dependentes de voltagem. O aumento da atividade desses canais resulta na diminuição do cálcio intracelular, levando a desfosforilação da MLC e relaxamento (LINCOLN; DEY; SELLAK, 2001). A regulação da atividade contrátil das células musculares lisas na circulação sistêmica é dependente de uma complexa interação de substâncias vasodilatadoras e vasoconstrictoras, estímulos de hormônios circulantes, neurotransmissores e de fatores derivados do endotélio que regulam a pressão arterial (JACKSON, 2000a). O tônus muscular liso é determinado pelo estado contrátil das células do músculo liso vascular, regulado pela [Ca 2+ ] i, sendo o aumento desta o evento chave no processo de ativação do aparato contrátil das células musculares lisas (KATOUE et al., 2006). O processo de contração neste tecido pode ser evocado por dois diferentes mecanismos: acoplamento farmacomecânico, que se caracteriza pela entrada de cálcio, que causa contração do músculo liso, sem que haja uma mudança

47 47 significativa no potencial de membrana; e pelo acoplamento eletromecânico que envolve a entrada de cálcio através dos canais de cálcio dependentes de voltagem (FILIPEANU et al., 1995). Independente do estímulo, as células musculares lisas usam o ciclo de pontes cruzadas entre a actina e a miosina para desenvolver força e os íons cálcio atuam iniciando a contração muscular (WEBB, 2003). Assim, existe uma estreita relação entre potencial de membrana, influxo de cálcio, concentração de cálcio intracelular e manutenção da força do músculo liso (COX, 1996a), de forma que fatores que regulam o potencial de membrana têm efeito direto na contração e na resistência vascular (COX, 2002b). A contração muscular estimulada por agonistas ocorre por ligação deste com receptores de sete alças transmembranares acoplados a uma proteína G heterotrimérica, estimulando assim a atividade da fosfolipase C (PLC). Esta enzima é específica para o lipídio de membrana fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP 2 ) para que cataliza a formação de dois potentes segundos mensageiros: 1,4,5 trisfosfato de inositol (IP 3 ) e 1,2 diacilglicerol (DAG) (HALL et al., 2006). O DAG, juntamente com o cálcio, ativa a proteína cinase C (PKC), que fosforila proteínas alvo específicas. Em muitos casos, a PKC tem efeitos que promovem contração como fosforilação de canais de cálcio do tipo L ou outras proteínas que regulam o ciclo de pontes cruzadas (WEBB, 2003). O mecanismo contrátil utilizando a via de receptores acoplados à proteína G promove aumento nas concentrações de cálcio intracelular. A contração muscular é controlada pelas concentrações citoplasmáticas de Ca 2+, visto que, o cálcio aciona o aparato contrátil. Os canais Ca V são uma superfamília de canal formado por pelo menos 10 membros, divididos em alta e baixa voltagem, com uma seqüência de aminoácidos homóloga e sensibilidade à ativação pela despolarização da membrana (PEREZ - REYES, 2003). As células musculares lisas vasculares expressam dois tipos de canais Ca V, os Ca V 1 (tipo L) e os Ca V 3 (tipo T) (CATERRAL et al., 1996). O grupo ativado pela alta voltagem consiste em canais sensíveis a dihidropiridina Ca V 1 (tipo- L, Ca V ) e insensível Ca V 2 (P, Q, R, N tipo-t, Ca V ). Os Ca V 1 e Ca V 2 são canais que exigem uma maior despolarização de membrana para que ocorra a ativação em relação aos canais tipo-t, que necessitam de uma baixa despolarização, que incluem Ca V (PEREZ REYES, 2003).

48 48 O influxo transmembranar de cálcio do meio extracelular através da membrana plasmática ocorre através de canais de cálcio dependentes de voltagem, operados por receptor e operados por estoque. Posteriormente, ocorre a ativação da via intracelular de cálcio, onde o músculo liso exibe dois sistemas de liberação de cálcio localizados na membrana do retículo sarcoplasmático (RS) (HALL, 2006). Um dos sistemas de liberação de cálcio ocorre através dos receptores sensíveis ao IP 3 em resposta a interação deste com o IP 3 (GAGLIANO et al., 2004), e o outro sistema de liberação se faz através dos receptores de rianodina (RyR). Por ser hidrossolúvel, o IP 3 difunde-se pelo citoplasma carregando o sinal da superfície celular para a superfície do RS. No RS o IP 3 liga-se a uma proteína canal de cálcio sensível ao inositol, de forma que esta ligação induz a sua abertura permitindo a saída de cálcio para o citosol. Em geral, o aumento de cálcio intracelular elucidado por IP 3 pode ser responsável pelo componente fásico da resposta contrátil a agonistas (MISTRY; GARLAND, 1999). O outro sistema de liberação de cálcio ocorre através dos receptores de rianodina (RyR), que liberam cálcio através da sua abertura induzida por cálcio, responsável pelo mecanismo conhecido como liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR) (MEISSNER, 2004). São conhecidos por serem ativados por segundos mensageiros, como o cálcio, ADP-ribose cíclico (cadpr) ou cafeína, aplicada exogenamente (HISHINUMA; SAITO, 2006). O efetivo acoplamento entre o influxo de Ca 2+ extracelular e a liberação de Ca 2+ intracelular é mediado por uma íntima interação entre componentes da MP e do RS (MA; PAN, 2003). A contração do músculo liso vascular é largamente direcionada pelo influxo de cálcio dependente de voltagem (ZHANG et al., 2005), de forma que o cálcio que entra na célula serve como um segundo mensageiro da sinalização elétrica, iniciando a multiplicidade das funções celulares (GAZULLA; TINTORÉ, 2006). Esse aumento na concentração intracelular de cálcio faz com que esse íon se ligue a uma pequena proteína citosólica denominada calmodulina (CaM), que interage com o cálcio. O complexo cálcio-calmodulina ativa a MLCK. Esta cinase ativada fosforila as cadeias protéicas regulatórias leves da miosina, possibilitando a interação molecular da miosina com a actina e assim iniciando o ciclo de pontes cruzadas (CHITALEY et al., 2001). A fosforilação / desfosforilação da cadeia regulatória leve de miosina, respectivamente catalizada pela MLCK e pela miosina

49 49 fosfatase, é o evento chave na regulação da contração do músculo liso (PFITZER, 2001). É cada vez mais sugerido que alterações na regulação do cálcio em células musculares cardíacas possam estar criticamente envolvidas em processos patológicos, como exemplo, disfunções e arritmias, além de ser um importante fator no aumento da reatividade vascular associada com a hipertensão (BERS, 2000). Porém, a contratilidade do músculo liso vascular não é dependente apenas da concentração de cálcio intracelular ([Ca 2+ ] i ), que resultará em um aumento na fosforilação da cadeia leve de miosina (KHALIL, 2001), mas também depende da sensibilidade do aparato contrátil ao cálcio (NOBE; PAUL, 2001). Outras vias têm sido descritas por atuarem como reguladoras da contratilidade do músculo liso por controlar a fosforilação da cadeia leve de miosina independente do aumento do cálcio intracelular (JEON et al., 2006). Agonistas que se ligam a receptores acoplados à proteína G (GPCRs) produzem contração por aumentarem a concentração de cálcio citosólica tal como por aumentar a sensibilidade ao cálcio pelo aparato contrátil. O mecanismo de sensibilização ao cálcio mediado por GPCRs ocorre através da inibição da miosina fosfatase, sendo este o mecanismo primário na sensibilização da maquinaria contrátil (SOMLYO; SOMLYO, 2000), onde a Rho - GTPase, e seu alvo, Rho cinase, estão envolvidas neste mecanismo (UEHATA et al., 1997). A RhoA ativada vai interagir com vários efetores, dentre eles a Rho cinase, esta fosforila a miosina fosfatase e assim inativando-a (WIRTH, 2010). Sendo esta cinase considerada a molécula chave na sensibilização mediada por receptores acoplados a proteína G no músculo liso vascular (SEASHOLTZ; BROWN, 2004). Esta inibição é o fator responsável pelo qual a RhoA promove sensibilização ao cálcio pelo aparato contrátil em contrações induzidas por agonistas, sendo responsável pelo aumento sustentado da tensão induzido por vasoconstrictores (SAUZEAU et al., 2000).O uso do ortovanadato de sódio, conhecido por ser inibidor da miosina fosfatase, é um excelente ferramenta de verificação no mecanismo de sensibilidade do aparato contrátil.ele tem como mecanismo de ação a estimulação da via da RhoA / Rho cinase, atuando na translocação da RhoA citosólica, aumentando a sua fração acoplada a membrana e então estimulando a sua ativação (MORI; TSUSHIMA, 2004).

50 50 O relaxamento da musculatura lisa, processo inverso, é iniciado por diminuição na [Ca 2+ ] i que ocorre através do bombeamento de cálcio de volta para o RS por ação da bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA), além da extrusão de cálcio da célula via Ca 2+ - ATPase e trocador Na + /Ca 2+ da MP. A diminuição na [Ca 2+ ] citosólico causa dissociação do complexo cálcio-calmodulina e a miosina de cadeia leve será desfosforilada por ação da miosina fosfatase (SALAMANCA; KHALIL, 2005). A diminuição da sensibilidade da maquinaria contrátil ao cálcio pode ocorrer através das ações do AMPc e do GMPc. A ativação da PKA representa um dos mecanismos pelo qual o relaxamento é induzido no músculo liso, em adição, um importante papel também têm sido atribuído a proteína cinase dependente de GMPc, ambas reduzindo os níveis de cálcio intracelular (RASCADO; BENDHACKT, 2005). Nas células musculares lisas, a abertura de canais para K + hiperpolarizam o potencial de membrana, resultando em relaxamento (JIANG; WU; WANG, 2007). O potencial de membrana por sua vez, regula a atividade de tensão - fechando canais para Ca 2+, controlando o influxo e efluxo de Ca 2+. Em células musculares lisas, em virtude do gradiente do K +, a abertura de canais para K + leva a um efluxo deste íon na célula e uma hiperpolarização de membrana. Este processo diminui a tensão fechando canais para Ca 2+, reduzindo os níveis de cálcio intracelular e levando a uma vasodilatação. Inversamente, o fechamento de canais para K + causa despolarização de membrana, abrindo canais para Ca 2+ levando a uma vasoconstrição (JACKSON, 2005c). Classes diferentes de canais para K + são expressos nas células arteriolares do músculo liso. Estas incluem: canais para potássio retificadores de entrada (K IR ), canais para potássio sensível ao ATP (K ATP ), canais para potássio ativados pelo cálcio (K Ca ) e canais para potássio ativado por voltagem (K V ) (JACKSON, 2005c). Os canais de potássio ativados por voltagem são membros da superfamília de canias iônicos S4, cada subunidade é caracterizada por 6 hélices transmembranas (S1-S6), com o sensor de voltagem entre as hélices S1 e S4 e uma região de poro entre S5 e S6. São conservados de bactérias a humanos e tem múltiplos papéis fisiológicos (YU; CATERRAL, 2004). Nos canais K IR as subunidades tem apenas duas hélices transmembranares acompanhando a região do poro, correspondendo aos segmentos S5 e S6 nos Kv. Também possuem um domínio citosólico composto pelas porções N- e C-terminal que ajudam a regular a comporta do canal (HIBINO et

51 51 al., 2010). Os canais K Ca são membros da superfamília de canais iônicos S4; os canais de potássio de larga condutância (BK, MaxiK, K Ca 1) são ativados por voltagem e por cálcio. A ativação por Ca 2+ ocorre via ligação do íon a múltiplos sítios na região citosólica deste canal. Os canais de potássio ativados por cálcio de pequena condutância (SK, K Ca 2 e 3) não são dependentes de voltagem, e são ativados quando se liga a calmodulina, que está contitutivamente ligada a porção citosólica do canal (BAO et al., 2002). O canal K ATP é um complexo octamérico formado por dois tipos distintos de subunidades proteicas. O poro é formado por quatro subunidades K IR 6.2, cada um dos quais está associado com um receptor de sulfunoréia (SUR). K IR 6.2 tem dois domínios transmembrânicos ligados por uma alça de poro, e pertence a família dos canais K IR. SUR é membro da família ABC e tem múltiplos domínios transmembranares arranjados em 3 grupos (2 grupos com seis e 1 grupo com 5 dominios transmembranares); ainda possui duas alças intracelulares que contêm sequências de domínios de ligação e hidrólise de nucleotídeos (ASHCROFT; GRIBBLE, 2000). Os canais para potássio são os canais iônicos dominantes na membrana plasmática das células musculares lisas, e a corrente através destes canais contribui substancialmente para o potencial de membrana destas (JACKSON, 2005c), sendo de grande importância na regulação do tônus da musculatura lisa (JACKSON, 2000a; JACKSON, 2001b). O tônus das pequenas artérias e arteríolas é o maior determinante da resistência periférica, afetando o controle homeostático da pressão sanguínea. Assim, os mecanismos e vias de sinalizações envolvidas nas mudanças estruturais, patológicas e funcionais das paredes dos vasos são objetos de intensiva pesquisa, pois podem permitir a identificação de potenciais alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novas estratégias farmacológicas (LOIRAND et al., 2006). 2.1 PRODUTOS NATURAIS E A FAMILIA LAURACEAE Vários medicamentos à base de ervas medicinais têm sido popularmente usados para o tratamento de patologias e produzindo efeitos satisfatórios sobre doenças do sistema cardiovascular como a hipertensão (VORA; MANSSOR, 2005). Dessa forma, aliar o conhecimento cientifico ao popular em busca de novos medicamentos fitoterápicos é um dos principais caminhos para o sucesso de

52 52 pesquisas na área de plantas medicinais (DI STASI; HIRUMA-LIMA, 2002), que tem por objetivo avaliar a atividade biológica de plantas e seus constituintes químicos em sistemas, órgãos e tecidos com o intuito de descobrir substâncias que possam ser potencialmente utilizadas na terapêutica e/ou como ferramentas farmacológicas. O Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua vocação para os produtos naturais (PINTO et al., 2002). Nosso país possui a maior biodiversidade do mundo, estimada em cerca de 20% do número total de espécies do planeta. Esse imenso patrimônio genético, que nos países desenvolvidos encontra-se escasso, tem na atualidade valor econômico estratégico inestimável em várias atividades, mas é no campo de novos medicamentos que onde reside sua maior potencialidade (CALIXTO, 2003). Uma família amplamente estudada na área de pesquisas com plantas medicinais é a família Lauraceae, que segundo a Angiosperm Philogeny Group APG (Grupo de Filogenia Angiospermática) é representada por mais de 2000 espécies em 40 gêneros. No Brasil, há aproximadamente 25 gêneros e 400 espécies, inúmeras dessas espécies são encontradas principalmente na Amazônia. Possui distribuição pantropical, sendo bem representada na América, Ásia tropical, Austrália e Madagascar, com pouca expressão no sul da África (ROHWER, 1993 apud QUINET, 2005). Habitam, em sua maior parte, as florestas pluviais, bem como as restingas e os cerrados, estando ainda presente em outros ecossistemas. São árvores ou arbustos geralmente aromáticos, monóicos, dióicos ou gimnodióicos, e apenas o gênero Cassita se apresenta como gênero produtor de espécies trepadeiras (BARROSO, 2002). O nome da família Lauraceae deriva de lauer = "verde", e laus = "louvor", que significa coroar ou cingir de louros. Dentre os vários gêneros que constituem essa família podemos citar Ocotea, Aniba e Nectandra que possuem grande valor medicinal, além de Cinnamomum, Cryptocarya, Laurus e Sassafrás importantes fontes de compostos aromáticos (DI STASI; HIRUMA-LIMA, 2002). A culinária também utiliza várias espécies da família Lauraceae, tal como o fruto de Persea americana (abacate), o Laurus nobilis (louro) utilizado como condimento, e outras especiarias tais como as canelas Cinnamonum zeylanicum Breyne e C. Cassia (Nees) (MARQUES, 2001). Em virtude da boa qualidade da madeira e dos óleos essenciais das plantas deste gênero, eles alcançam um alto valor no comércio, o que justifica sua intensa

53 53 exploração ao longo dos anos, colocando em risco a preservação de suas espécies (QUINET, 2005). A madeira das espécies dessa famíia são bastante utilizadas na marcenaria, construção civil e fabricação de papel. A produção de óleos essenciais provêm das espécies aromáticas pertencentes aos gêneros Aniba, Nectandra, Ocotea, Licaria e Dicypellium (ZOGHBI). As Lauráceas destacam-se entre as demais famílias também pela sua importância medicinal. Segundo DI STASI e HIRUMA-LIMA (2002), na medicina popular o louro (Laurus nobilis) é utilizado para combater problemas hepáticos e intestinais, sendo considerado digestivo. As folhas do abacateiro (Persea americana) são utilizadas por possuírem funções diuréticas, analgésicas, especialmente contra diarréia e cálculo renal, ao passo que a infusão das folhas, além de atuar como diurético e analgésico, é também usada contra febres. Outra espécie utilizada na medicina popular é o Cinnamomum zeylanicum Blume, conhecido como canela, com ações antiespasmódica e ação antifúngica (LIMA, 2006). Vários efeitos biológicos das espécies dessa familia são relatados na literatura científica, efeitos tais como atividade anticonvulsivante do óleo essencial de Laurus nobilis (SAYYAH et al., 2002), efeitos depressivos centrais de Ocotea duckei (MORAIS, 1998). No extrato aquoso de Persea americana Mill ação analgésica e anti-inflamatória (ADEYEMI et al., 2002), efeito hipoglicemiante (KIM et al., 2006) e inibição da xantina oxidase pela Cinnamonun cassia (KONG et al., 2000), ação antinociceptiva e remoção de radicais livres por alcalóides de Lindera angustifolia Chen (ZHAO, 2006), entre outros. Alguns gêneros da familia Lauraceae tem as suas ações sobre o sistema cardiovascular referidas na literatura. O extrato aquoso das folhas de Persea americana em aorta de ratos, produziu uma resposta vasorrelaxante dependente de concentração, na presença do endotélio funcional, com efeito relaxante atenuado após a remoção do entoléio, mostrando o efeito dependente deste (OWOLABI et al., 2005). Com envolvimento da síntese e liberação dos fatores relaxantes derivados do endotélio, e inibição da mobilização de cálcio através dos canais de Ca V e, um menor efeito sobre os canais operados por receptores (OWOLABI et al., 2005). Outros estudos mostraram a capacidade deste extrato em causar hipotensão em ratos anestesiados, normotensos e hipertensos. E vasorrelaxamento em anéis da veia porta e de aorta de ratos normotensos, sendo o responsável por esse efeito a

54 54 produção de NO e liberação de GMPc, sem envolvimento dos receptores muscarinicos (OJEWOLE et al., 2007). Dias e colaboradores (2004) verificaram que (S)-reticulina, causa hipotensão e bradicardia em ratos normotensos não anestesiados, além de inibir as contrações induzidas por fenilefrina e KCl em anéis de aorta de rato, dependente da presença do endotélio. Os possiveis mecanismos de relaxamento produzidos pela (S)- reticulina, isolada da planta Ocotea duckei Vattimo, foram estudados utilizando técnicas de patch clamp e cultura de células.. Alguns fatores suportam a hipótese de que a (S)-reticulina inibe a corrente de cálcio (I Ca,L ) provavelmente por uma interação com os canais de cálcio tipo L, além de uma pequena participação dos mecanismos dependentes de AMPc (MEDEIROS et al., 2009). Ocotea quixos, outra espécie do gênero Ocotea, no estudo de Ballabeni e colaboradores (2007) mostrou que o seu óleo essencial é um fitocomplexo antitrombótico livre do efeito colateral pro hemorrágico, na condição de administração subaguda (BALLABENI et al., 2007). Vários compostos da espécie Cassyta filiformis Linn tiveram os seus efeitos testados em anéis de artéria aorta, de forma que alguns apresentaram um potencial vasorrelaxante. Mediante os compostos testados, os alcaloides tem um papel significante no efeito vasorrelaxante da C. filliformis (LIAO, 1996). Estudos de Choi e colaboradores (2009) mostraram que Cinnamomum cassia e seu composto ativo, ácido cinâmico, promovem a formação de novos vasos, e também o aumento da proliferação celular tanto das células endoteliais da veia umbilical humana como das células endoteliais de aorta de boi. Ambos também induzem motilidade quimiotática e formação de uma rede nas células endoteliais. Dentre os vários gêneros que constitui a família Lauraceae, estar o gênero Aniba, reconhecido como um dos principais gêneros da familia Lauraceae, constituido de 41 espécies de arbustos e árvores, e que se apresenta na diversidade na Amazônia Central e Guiana. É um gênero que se estende nos Andes, nas montanhas do norte da Venezuela, nas pequenas Antilhas e no leste e sul do Brasil (MELO et al., 2005). Há várias décadas, estudiosos se dedicam ao estudo do gênero Aniba, que possui entre seus constituintes neolignanas, flavonóides e pironas (ROSSI, 1997). A existência de pironas é marcante no gênero Aniba, aonde estudos do químico Otto Gottlieb nos anos 70 já afirmavam que todas as espécies até aquele momento estudadas possuíam pironas como elementos constituintes (GOTTLIEB, 1972a). De

55 55 fato tem sido relatado na literatura a presença destas substâncias nas espécies de A. gigantifolia e A. guianensis (SUARÉZ, 1973), A. henrigeri, A. coto, A. pseudocoto, A. duckei, A.roseadora, A. firmula, A. parviflora, A. fragrans (VON BÜLLON, 1968) Aniba panurensis (MOTIDOME et al., 1982), A. kappleri (SANTOS, 1981). Estudos científicos comprovam atividades biológicas referentes às espécies do gênero Aniba, tais como o efeito ansiolítico (MELO et al., 2005) e efeitos antidepressivos (SOUSA et al., 2004) de Aniba riparia, atividade antibiótica da Aniba riparia contra Candida albicans, Klebsiela pneumoniae e Staphylococcus aureus, Bacillus cereus (MARQUES, 2001). Poucas dados da literatura fazem referências aos efeitos de algumas espécies do gênero Aniba sobre o sistema cardiovascular. O óleo essencial de A. canelilla apresentou efeitos cardiovasculares tanto em ratos normotensos e espontaneamente hipertensos, efeitos esses reproduzidos pelos seus principais constituintes isoladamente. Em ratos normotensos não anestesiados, o óleo essencial de A. canelilla promoveu uma diminuição dose-dependente da pressão arterial média e da frequência cardíaca desses animais. Esse efeito não sofreu alterações após o bloqueio ganglionar com hexametônio, enquanto que foi parcialmente reduzido quando utilizado L-NAME (inibidor da sintase do óxido nítrico) e um bloqueador de receptor muscarinico (LAHLOU et al., 2005b). Essa hipotensão produzida envolve um relaxamento vascular, com dependência do endotélio funcional envolvendo a via NO/L-arginina, tal como a inibição da corrente de cálcio através dos canais de cálcio voltagem-dependentes (LAHLOU et al., 2005b). A verificação isolada de um dos principais componentes do óleo essencial de A. canelilla, o 1-nitro-2-feniletano, foi feita em animais normotensos e espontaneamente hipertensos. Nestes dois tipos de animais, o principal composto do óleo essencial de A. canelilla foi capaz de induzir uma resposta cardiovascular caracterizada por uma bradicardia vago-vagal e reflexor depressor, que aparentemente resulta da estimulação vagal pulmonar do que pelas fibras C aferentes cardíacas. A segunda resposta hipotensora do 1-nitro-2-feniletano ocorre em parte por um efeito direto sobre o músculo liso vascular (INTERAMINENSE et al., 2011; SIQUEIRA et al., 2010). O outro constituinte do óleo essencial de A. canelilla e de várias outras plantas, o metileugenol, em estudos com ratos normotensos não anestesiados, foi

56 56 capaz de promover uma queda na pressão sanguínea, provavelmente através de um vasorrelaxamento vascular, acreditando-se envolver a via L-arginina/ oxido nítrico (LAHLOU et al., 2004a). Dentro do gênero Aniba existe a espécie Aniba panurensis (Meisn.) Mez (Lauraceae), objeto de nosso estudo, que tem por sinônimos A. gonggrijpii, Aniba mas, Aydendron panurense. É conhecida popularmente por louro amarelo (VIEIRA, 2006), visualizada na figura 3. Figura 3 - Folhas e frutos da Aniba panurensis Fonte: Royal Botanic Gardens Na caracterização fitoquimica do óleo essencial da A. panurensis foram identificados hidrocarbonetos sesquiterpênicos, cujas ações são antiinflamatória, antialérgica, anestésica local e antifúngica (ALCÂNTARA; YAMAGUCHI; VEIGA JÚNIOR, 2010). Nos testes de atividade antioxidante e agregação plaquetária foram necessárias grandes quantidades do óleo essencial para promover o efeito (ALCÂNTARA; YAMAGUCHI; VEIGA JÚNIOR, 2010). Apresentou também atividade antimicrobiana por um alcalóide indolizinico isolado da A. panurensis com ação sobre Candida albicans (KLAUSMEYER et al., 2004).

57 57 Dos frutos de A. panurensis foi identificada uma pirona natural, a 6 [(E) estiril] 2 pirona (Figura 3), possuindo o peso molecular de 198, cujo o procedimento foi descrito por BARBOSA-FILHO, Já tendo sido esta estrutura também identificada em A. parviflora (REZENDE et al., 1971) e A. permollis (MOTIDOME et al., 1982). Estrutura esta apresentada a seguir (figura 4). Figura 4 - Estrutura química da 6 [ (E) estiril ] pirona (pirona-198) Estudos de Chaves e colaboradores (2010) mostraram que a 6-Esteril-2- pirona proveniente da Aniba panurensis foi capaz de aumentar os aminoácidos peptidérgicos, com ação inibitória, como taurina, GABA e glicina no hipocampo de camundongos. Os efeitos biológicos desta espécie sobre o sistema cardiovascular são pouco relatados na literatura. Estudos anteriores realizados com a 6 [(E) estiril] pirona proveniente dos frutos da A. panurensis, mostraram que em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato esta pirona foi capaz de promover um efeito vasorrelaxante dependente de concentração, e esse efeito foi mais potente quando os anéis foarm contraídos com um agonista α 1 adrenérgico (fenilefrina) comparado com os anéis contraídos com uma solução despolarizante (KCl 80mM). O efeito vasorrelaxante da pirona-198 também envolveu a liberação de cálcio dos estoques intracelulares através dos receptores sensíveis a IP 3 como os receptores de rianodina, além de apresentar uma atenuação do influxo transmembranar de cálcio através de canais de cálcio dependentes de voltagem. Na presença do ortovanadato de sódio, um inibidor da miosina fosfatase, observou-se possivelmente uma interação desta pirona com o mecanismo de sensibilização da maquinaria contrátil (ASSIS, 2007).

58 58 Objetivos

59 59 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Estudar o efeito cardiovascular da Aniba panurensis através do mecanismo de ação da estirilpirona: 6 [(E) estiril] 2 pirona, obtida da espécie em estudo, através de abordagens in vivo e in vitro OBJETIVOS ESPECÍFICOS Testes in vivo Caracterizar o efeito da pirona-198 sobre a pressão arterial (PA) e frenquência cardíaca (FC) em ratos normotensos não anestesiados. Testes in vitro Avaliar o efeito da pirona-198 frente diferentes concentrações do agonista α 1 adrenérgico (fenilefrina) Elucidar a influência dos fatores relaxantes derivados do endotélio funcional na resposta induzida pela pirona-198 Avaliar a influência dos íons Ca +2 e de sua liberação intracelular; e a relação com as diferentes concentrações do agonista α 1 adrenérgico ; Avaliar o papel de canais de K + neste efeito.

60 60 Material e métodos

61 61 4 MATERIAL 4.1 ANIMAIS Foram utilizados em todos os experimentos ratos albinos Wistar (Rattus norvegicus), pesando entre 250 e 350 g, provenientes do Biotério Prof. Thomas George do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal da Paraíba. Estes animais foram mantidos sob condições controle de temperatura (21 1 o C) com ciclo claro-escuro de 12 horas e com livre acesso à alimentação (ração Purina para roedores) e água. Todos os procedimentos desenvolvidos nesse estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) do centro de Biotecnologia (UFPB), certidão nº 0109/10 (Anexo A). 4.2 DROGAS As ferramentas farmacológicas utilizadas foram: tiopental sódico (Cristália), heparina, 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona (ODQ), 2-fenil-4,4,5,5- tetrametil-imidazolina-1-oxil-3-oxido (PTIO), 4-aminopiridina (4-AP), sulfato de atropina, indometacina, cloreto de bário di-hidratado (BaCl 2 ), cloridrato de acetilcolina (ACh), cloridrato de L-(-)-fenilefrina (FEN), cloridrato de N G -nitro-larginina-metil éster (L-NAME), glibenclamida (GLIB), cloridrato de L-arginina, Nifedipino, cloreto de tetraetilamônio (TEA), ácido 3-piridinacarboxilico-1,4-diidro-2,6- dimetil-5-nitro-4-[2-(trifluorometil)fenil]-metil Ester (S(-) Bay K8644), 9,11-dideoxi- 11α, 9α epoximetano prostaglandina F 2 α (U46619), ácido tetraacético (N, N, N,N ) bis beta amino étil estér etilenoglicol (EGTA). Estas ferramentas foram obtidas da Sigma-Aldrich. Todas as substâncias foram dissolvidas em água destilada, exceto a GLIB e ODQ que foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO), além de nifedipino e S(-)- Bay K8644 que foram dissolvidos em etanol absoluto e diluídos em água destilada, de modo a serem obtidas as concentrações desejadas. Todas as soluções foram mantidas a 0º C. Quando necessário, as drogas foram diluídas em água destilada (para experimentos in vitro) ou em solução salina (para experimentos in vivo). A 6 [(E) estiril] pirona foi isolada e cedida pelo Prof. Dr. José Maria Barbosa-Filho do Centro de Biotecnologia / UFPB, com o procedimento descrito

62 62 previamente (BARBOSA-FILHO, 1986). Pirona-198 foi dissolvida em cremofor:água (1:1) para obter uma solução mãe de 10-1 M. 4.3 SOLUÇÕES NUTRITIVAS Para as preparações das soluções estoques, os sais eram dissolvidos em água destilada, exceto o EGTA, dissolvida em bicarbonato de sódio (NaHCO 3 ) a 5%. Todas as soluções eram mantidas a Oº C e utilizadas apenas no momento dos experimentos. Para a preparação das soluções nutritivas eram utilizadas as seguintes substâncias: cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), cloreto de cálcio dihidratado (CaCl 2.2H 2 O), cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl 2.6H 2 O), glicose (C 6 H 12 O 6 ), bicarbonato de sódio (NaHCO 3 ) e fosfato de sódio mono-hidratado (NaH 2 PO 4.H 2 O). Todos estes sais foram obtidos da VETEC. Abaixo seguem os quadros com as descrições das referidas soluções. Sais NaCl KCl CaCl 2.2H 2 O MgCl 2.6H 2 0 NaHCO 3 NaH 2 PO 4.H 2 O C 6 H 12 O 6 Concentração (mm) 158,3 4,0 2,0 1,05 10,0 0,42 5,6 Quadro 1 - Composição da Solução de Tyrode para artéria mesentérica Fonte: adaptada de Tanaka et al., 1999

63 63 Sais NaCl KCl MgCl 2.6H 2 0 NaHCO 3 NaH 2 PO 4.H 2 O C 6 H 12 O 6 EGTA Concentração (mm) 158,3 4,0 1,05 10,0 0,42 5,6 1,0 Quadro 2 - Composição da Solução de Tyrode livre de cálcio Fonte: adaptada de Tanaka et al., 1999 Nas soluções de Tyrode com 20 e 60 mm de KCl, houve uma substituição equimolar do Na + pelo K +, ajustando isosmoticamente as soluções, conforme as tabelas abaixo: Sais NaCl KCl CaCl 2.2H 2 O MgCl 2.6H 2 0 NaHCO 3 NaH 2 PO 4.H 2 O C 6 H 12 O 6 Concentração (mm) 142,3 20,0 2,0 1,05 10,0 0,42 5,6 Quadro 3 - Composição da solução despolarizante de Tyrode com KCl a 20 mm Fonte: adaptada de Tanaka et al., 1999 Sais NaCl KCl CaCl 2.2H 2 O MgCl 2.6H 2 0 NaHCO 3 NaH 2 PO 4.H 2 O C 6 H 12 O 6 Concentração (mm) 102,3 60,0 2,0 1,05 10,0 0,42 5,6 Quadro 4 - Composição da solução despolarizante de Tyrode com KCl a 60 mm Fonte: adaptada de Tanaka et al., 1999

64 64 5 MÉTODOS 5.1 ENSAIOS FARMACOLÓGICOS in vivo Registro da PA e FC em ratos normotensos não anestesiados Os animais foram anestesiados com tiopental sódico (45 mg/kg, i.p.) e cateteres de polietileno (PE), um segmento de PE-10 (diâmetro interno e externo de 0,28 e 0,61mm, respectivamente), soldado a um segmento de PE-50 (diâmetro interno e externo de 0,58 e 0,96 mm, respectivamente), foram implantados na aorta abdominal e veia cava inferior, via artéria e veia femoral esquerdas, respectivamente. Após a inserção e fixação, os cateteres foram tunelizados subcutaneamente e exteriorizados através de uma incisão na região cervical posterior do animal. Os valores de PA e FC foram registrados 24h após o procedimento cirúrgico pela conexão do cateter arterial a um transdutor de pressão pré-calibrado (Statham P23 ID; Gound, Cleveland, OH, USA) e conectado a um micro-computador equipado com placa conversora analógico-digital (CIO-DAS16/JR, Computers Boards, Inc., Mansfield, MA, EUA) e com o programa CVMS (WPI. Sarasota, FL, EUA). A frequência escolhida para amostragem dos dados foi de 500 Hz. Para cada ciclo cardíaco, o computador calculava pressão arterial sistólica, diastólica e média, e o intervalo de pulso. O cateter venoso foi implantado para a administração das drogas. Nitroprussiato de sódio (NPS, 10 µg/kg; i.v.) foi injetado para checar a eficácia da inserção do catete venoso. Após os parâmetros cardiovasculares terem sido estabilizados, os valores da PAM e a FC foram identificados antes e após a administração de doses de pirona-198 (10, 20, 30 and 40 mg/kg; i.v.). Para a construção da curva dose-resposta, a diferença entre a linha de base e os valores após a administração de cada dose foi expressa como porcentagem do valor basal.

65 ENSAIOS FARMACOLÓGICOS in vitro Preparação dos anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos Os animais foram eutanasiados e, por meio de uma incisão na região ventral do animal, a artéria mesentérica superior era identificada, removida e imediatamente posta em solução de Tyrode para artéria mesentérica (Quadro 1), para dissecação e secção dos vasos em anéis (1-2 mm de comprimento). Cada anel foi imerso em cubas (10 ml) e suspenso verticalmente por linhas de algodão, fixadas a um transdutor de força (MLT020, AD Instruments, Austrália), que estava acoplado a um sistema de aquisição (ML870/P com LabChart versão 7.0, ADInstruments, Austrália) para o registro das tensões isométricas. Os tecidos foram mantidos em solução de Tyrode, a 37 ºC, aeradas com uma mistura de 95% de O 2 e 5% de CO 2 (carbogênio). Todos os anéis foram submetidos a uma tensão basal de aproximadamente 0,75 g, por um período de estabilização de 60 minutos (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980), trocando a solução do banho a cada 15 minutos, para a retirada da influência dos metabólitos, e ajustando a linha de base, quando necessário, antes do início do experimento (ALTURA; ALTURA, 1970). 5.3 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS Em todos os protocolos experimentais, após o período de estabilização, foi obtida uma contração com fenilefrina (FEN, 10 M), um agonista dos receptores α 1 -adrenérgicos, com a finalidade de verificar a viabilidade do tecido (BYLUND, 1992; BÜSCHER et al., 1999). Após a contração induzida por FEN era adicionada às cubas acetilcolina (ACh, 10 µm), um agonista dos receptores muscarínicos M 3, com o intuito de avaliar a presença do endotélio funcional nestas células. Os anéis com relaxamento superior a 90% foram considerados com endotélio funcional (Esquema 1A), os com relaxamento inferior a 10% foram considerados sem endotélio (Esquema 1B) (BROCHET; LANGTON, 2006). Quando necessário, o endotélio foi removido por fricção da superfície luminal do vaso com uma haste de metal e após um novo

66 TENSÃO (g) 66 período de estabilização, a integridade do endotélio era novamente verificada por meio da técnica descrita anteriormente. A) ACh 10 µm (E+) 60 0,75g FEN 10 µm B ACh 10 µm L TEMPO (min) (E-) 60 0,75g FEN 10 µm Esquema 1 Representação esquemática para verificação da viabilidade do tecido vascular e avaliação da integridade do endotélio vascular. (A) Anéis com endotélio funcional. (B) Anéis sem o endotélio funcional. L = Lavagem

67 Avaliação da atividade da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica contraídos com FEN (1 μm e 10 μm) A realização deste protocolo teve como objetivo investigar o efeito vasorrelaxante da pirona-198 mediante diferentes concentrações de FEN. Após a verificação da presença ou ausência do endotélio funcional como descrito no item 4.3, os anéis foram submetidos a um novo período de estabilização de 30 minutos. Em seguida, nos anéis com e sem endotélio funcional (maior que 90% de relaxamento), foi induzida uma segunda contração com FEN (10 μm), e após um período de 45 minutos, na fase tônica da contração, a pirona-198 foi adicionada em concentrações cumulativas (0,1 nm, 1 nm, 10 nm, 0,1 μm, 1 μm, 10 μm, 100 μm e 1 mm) (Esquema 2). O grupo controle corresponde a condição cremofor/água. O mesmo protocolo foi realizado utilizando a concentração de FEN 1 μm para anéis com e sem endotélio funcional. ACh 10 µm pirona-198 0,1 nm 1 mm? E+ (E-) 60 0,75g FEN 10 µm L FEN (1 ou 10 μm) Esquema 2 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis pré-contraídos com FEN (1 e 10 μm) na presença e na ausência do endotélio funcional. L= lavagem

68 TENSÃO (g) Protocolos experimentais realizados em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato na presença do endotélio funcional Verificação da participação da via do NO na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Em algumas preparações, após a verificação da integridade do endotélio, como descrito no item 4.3, as preparações eram incubadas com L-NAME (100 M), um inibidor competitivo da sintase do NO (NOS) (JIN et al., 2008b). Em outras preparações, após o período de estabilização era adicionado o L NAME na concentração de 100 M, passado 10 minutos seguia-se a adição de L- arginina (1 mm), esta que é um substrato para a NOS (MONCADA; HIGGS, 1993). No terceiro grupo, após a observação da integridade do endotélio vascular, as preparações foram pré-incubadas com PTIO (300 µm), um seqüestrador exógeno de NO (CHAUHAN et al., 2002; ELLIS; LI; RAND, 2000). Em todos os grupos, após 30 minutos de incubação, foi induzida uma nova contração pela FEN (1 μm) e após 45 minutos, foram adicionadas concentrações crescentes da pirona-198 (0,1 nm 1 mm), de maneira cumulativa, para obtenção de uma curva concentração-resposta (Esquema 3). pirona-198 0,1 nm 1 mm TEMPO (min) 30 L-NAME 100 µm L-NAME 100 µm + L-arginina 1 mm PTIO 300 µm FEN (1 µm) Esquema 3 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nm 1 mm), em anéis com endotélio funcional e pré contraídos com FEN (1 μm), na presença de inibidores incubados individualmente

69 TENSÃO (g) Verificação da participação da via NO / GMPc na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Com o objetivo de investigar a participação da via NOS/CGs na resposta relaxante promovida pela pirona-198, foi utilizado ODQ (10 M), um potente inibidor que previne a ativação da CGs pelo NO (JIANG; WU; WANG, 2007). Após o período de estabilização e verificação da integridade do endotélio funcional (ver 4.3), o ODQ foi adicionado e após um período de 30 minutos, uma nova contração com FEN (1 μm) foi induzida, com período de estabilização de 45 minutos. Posteriormente era feita a adição de concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), para obtenção de uma curva concentração-resposta (Esquema 4). pirona-198 0,1 nm 1 mm TEMPO (min) 30 ODQ 10 µm FEN (1 µm) Esquema 4 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nm 1 mm), em anéis com endotélio funcional e pré contraídos com FEN (1 μm), na presença de ODQ (10 μm).

70 TENSÃO (g) Verificação da participação dos receptores muscarínicos na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Com o intuito de avaliar se haveria uma participação dos receptores muscarínicos no efeito vasorrelaxante da pirona -198, utilizou-se atropina, um antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos na concentração de 1 nm (BASTOS et al., 2009). Após a verificação da integridade do endotélio, como descrito no item 4.3, as preparações eram incubadas com atropina. Passado os 30 minutos, era então induzida uma contração com FEN (1 μm) e passados 45 minutos, concentrações crescentes da pirona-198 (0,1 nm 1 mm) foram adicionadas para obtenção de uma curva concentração-resposta (Esquema 5). pirona-198 0,1 nm 1 mm TEMPO (min) 30 Atropina (1 nm) FEN (1 µm) Esquema 5 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nm 1 mm), em anéis com endotélio funcional e pré contraídos com FEN (1 μm), na presença de atropina (1 nm).

71 TENSÃO (g) Verificação da participação de metabólitos da via do ácido araquidônico, na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato A verificação de uma possível participação dos metabólitos do ácido araquidônico na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 foi realizada a partir da utilização de indometacina (10 M), um inibidor não seletivo da ciclooxigenase (COX) (SASAKI et al., 2010). Após a verificação da integridade do endotélio, como descrito no item 4.3, as preparações eram incubadas com indometacina e após 30 minutos, era induzida uma contração com FEN na concentração de 1 μm. Passados 45 minutos, foram adicionadas concentrações crescentes da pirona-198 (0,1 nm 1 mm), de maneira cumulativa, para obtenção de uma curva concentração-resposta (Esquema 6). TEMPO (min) pirona-198 0,1 nm 1 mm 30 indometacina (10 µm) FEN (1 µm) Esquema 6 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nm 1 mm), em anéis com endotélio funcional e pré contraídos com FEN (1 μm), na presença de indometacina (10 μm). L= lavagem

72 Protocolos experimentais realizados em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato na ausência do endotélio funcional Avaliação da atividade da pirona-198 sobre a indução da contração de FEN em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato A fim de avaliar se o efeito da pirona-198 envolveria a ação sobre os receptores α-adrenérgicos, de forma que verificada a ausência do endotélio, contrações isométricas foram obtidas pela adição cumulativa de FEN nas concentrações de 1 nm a 10 µm (WANG et al., 2008). Na primeira fase do protocolo uma curva inicial foi gerada pela adição cumulativa de FEN. Em um segundo momento, todo o processo foi repetido, porém a geração desta curva cumulativa concentração-resposta de FEN foi obtida na presença de concentrações isoladas de pirona (10 µm, 100 µm ou 1 mm), que foram incubadas por um período de 30 minutos. (Esquema 7). A curva de FEN na presença de pirona-198 foi comparada com a curva concentração-resposta controle, e sua resposta máxima foi caracterizada como 100%. L FEN (1 nm 10 µm) Pirona 30 FEN (1 nm 10 µm) Esquema 7 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante induzido por concentrações isoladas de pirona-198 (10 µm, 100 µm e 1 mm), em anéis sem endotélio funcional frente a concentrações crescentes de FEN (1 nm 10 µm). L= lavagem

73 TENSÃO (g) Avaliação da atividade da pirona-198 frente ao U46619 A fim de avaliar a resposta vasorrelaxante da pirona-198 diante de contrações induzidas por outro agente contracturante, utilizou-se U46619 que ativa receptores prostanóides tromboxânicos (GPCRs) acoplados a proteína Gq estimulando a via PLC/IP 3 /DAG (SNETKOV et al.; 2006). Após a verificação da remoção do endotélio funcional e um período de estabilização de 30 minutos, foi induzida uma contração com 10 µm de U46619 (SHAW et al., 2004) e no componente tônico da contração, após 45 minutos, eram adicionadas concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1 mm), para obtenção de uma curva concentração-resposta. A resposta foi expressa como porcentagem de relaxamento em relação à contração produzida por U46619 (Esquema 8). TEMPO (min) pirona-198 0,1 nm 1 mm L U46619 (10 µm) Esquema 8 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nm 1 mm), em anéis sem endotélio funcional contraídos com U46619 (10 µm).l = lavagem

74 Investigação do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis pré-contraídos com S(-) Bay K8644 ou na presença de um bloqueador de Ca v tipo L Para avaliar o efeito da pirona-198 sobre o influxo de Ca 2+ através dos canais para Ca 2+ sensíveis a diidropiridinas (Ca V tipo L), em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, sem o endotélio funcional, foi utilizado o S(-)- Bay K 8644, um ativador dos canais para Ca 2+ sensíveis a diidropiridinas (ADACHI- AKAHANES et al., 1999). Devido uma despolarização parcial ser necessária para obtenção da resposta ao S(-)-Bay K8644, a resposta contrátil a esse agonista foi obtida em meio contendo 20 mm de KCl (SCHRAMM et al., 1983; DAVIE; KUBO; STANDEN, 1998). Após a verificação da ausência do endotélio, as preparações foram feitas trocas da solução de Tyrode por 15 minutos e substituida por solução de Tyrode KCl 20 mm (Quadro 3). Após 30 minutos, uma contração por S(-) - Bay K8644 (200 nm) foi produzida, e no componente tônico a pirona-198 (0,1 nm 1 mm) foi adicionada cumulativamente (Esquema 9A). Em um segundo grupo de experimentos, foi utilizada nifedipino na concentração de 1 µm, um bloqueador dos canais de Ca v tipo L (SOFOLA; ADEGUNLOYE; KNILL, 2003; MISFELDT et al., 2010). Após a fase de estabilização, os anéis foram incubados com nifedipino durante um período de 30 minutos. No componente tônico da curva de contração induzida por fenilefrina (10 µm) foram adicionadas cumulativamente concentrações crescentes de pirona-198 (0,1 nm 1mM) (Esquema 9B).

75 TENSÃO (g) 75 A) pirona-198 0,1 nm 1 mm L KCl 20 mm S(-) Bay K nm TEMPO (min) B) pirona-198 0,1 nm 1 mm 30 Nifedipino (1 µm) FEN (1 e 10 µm) Esquema 9 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de Pirona-198 (0,1 nm 1 mm), em anéis sem endotélio funcional contraídos com S(-) Bay K 8644 (A) e incubados com nifedipino (B). L = lavagem

76 Avaliação do efeito vasorrelaxante da pirona-198 sobre as contrações transientes induzidas por concentrações de FEN (1 e 10 µm) O efeito da pirona-198 sobre as contrações transientes promovidas pelo cálcio liberado dos estoques intracelulares sensível a IP 3 via IP 3 R (PATEL; JOSEPH; THOMAS, 1999). As preparações foram expostas à solução despolarizante de KCl 60 mm (tabela 4) até a formação de um platô e em seguida a solução despolarizante era substituída pela solução de Tyrode livre de Ca 2+ (Quadro 2). Decorridos 3 minutos, era adicionada ao meio FEN nas concentrações de 1 ou 10 μm e uma resposta contrátil era então obtida. Este procedimento foi repetido duas vezes com a finalidade de obter a média da contração induzida pela FEN. Em um terceiro momento, após a troca do meio despolarizante por Tyrode sem cálcio, concentrações isoladas de pirona-198 foram adicionadas juntamente durante 3 minutos e posteriormente uma nova contração induzida pela fenilefrina foi obtida (Esquema 10). Essa terceira contração induzida na presença da pirona foi comparada com a média das contrações induzidas por FEN na ausência das concentrações isoladas de pirona-198.

77 77 Ty. s/ Ca 2+ (3 ) L L KCl 60 mm KCl 60 mm FEN 1 ou 10 µm Ty. s/ Ca 2+ (3 ) Ty. s/ Ca 2+ + pirona-198 (3 ) L KCl 60 mm FEN 1 ou 10 µm Esquema 10 - Representação esquemática do protocolo experimental para estudo da avaliação dos efeitos de concentrações isoladas de pirona-198 sobre as contrações transientes induzidas por FEN (1 e 10 µm). (L= Lavagem; Ty = Tyrode).

78 TENSÃO (g) Avaliação da participação dos canais para potássio na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Para investigar a participação de canais para K + na resposta vasorrelaxante da pirona-198 foi utilizado um inibidor de canais para K +, TEA na concentração de 3 mm, que bloqueia de forma não seletiva os canais para K + (WANG et al., 2008) Este protocolo foi realizado tanto na ausência quanto na presença do endotélio funcional. Nos anéis com endotélio funcional, as preparações eram incubadas durante 30 minutos com 3 mm de TEA. Passado esse período uma contração era induzida com FEN (1 µm) e no componente tônico desta eram colocadas concentrações crescentes de pirona-198 (Esquema 11). Nos anéis sem endotélio funcional, promovemos o mesmo protocolo, porém as contrações induzidas por fenilefrina eram providas nas concentrações de 1 e 10 µm desse respectivo agonista. No componente tônico, concentrações crescentes de pirona-198 eram então adicionadas (Esquema 11). pirona-198 0,1 nm 1 mm TEMPO (min) TEA 3 mm FEN (1 ou 10 µm) Esquema 11 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nm 1 mm), em anéis com endotélio pré contraídos com FEN 1 μm e sem endotélio funcional pré contraídos com FEN (10 μm), na presença de TEA (3 mm)

79 Verificação da participação dos canais para potássio de grande condutância sensível ao cálcio BK Ca na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Com o objetivo de visualizar se o efeito da pirona-198 envolvia a participação dos canais para potássio sensíveis ao cálcio utilizamos, TEA 1 mm, que atua como um bloqueador desses canais (MENEZES et al., 2007). Os anéis sem endotélio vascular foram pré-incubados por 30 minutos com TEA e passado 30 minutos deste procedimento foi induzida uma contração com fenilefrina (10 µm) e na fase sustentada desta contração adicionou-se de maneira cumulativa pirona-198 (0,1 nm 1mM), a resposta obtida foi comparada com o controle na ausência do TEA (1 mm) (Esquema 12) Verificação da participação dos canais para potássio sensíveis à voltagem (K v ) na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Para a verificação do envolvimento da pirona-198 com os canais K v, foi utilizada a 4-AP (1 mm), um inibidor desses canais (MENEZES et al., 2007). Os anéis sem endotélio foram pré-incubados por 30 minutos com 4-AP, e após 30 minutos deste procedimento foi induzida uma contração com FEN (10 µm). Na fase sustentada desta contração adicionou-se de maneira cumulativa pirona-198 (0.1 nm 1 mm) (Esquema 12).

80 Verificação da participação dos canais para potássio retificadores de entrada (K IR ) na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Com o intuito de verificar o envolvimento dos canais para potássio retificadores de entrada - K IR no efeito relaxante da pirona-198, utilizou-se BaCl 2 (30 µm), um inibidor desses canais. (KWAN et al., 2005). Os anéis sem endotélio vascular foram pré-incubados por 30 minutos com o inibidor e a pós 30 minutos deste procedimento foi induzida uma contração com fenilefrina (10 µm) na fase sustentada da contração adicionou-se de maneira cumulativa pirona-198 (0,1 nm 1mM) (Esquema 12) Verificação da participação dos canais para potássio sensível a ATP (K ATP ) na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Com o intuito de observar uma possível participação dos canais para potássio sensíveis a ATP na resposta vasorrelaxante da pirona-198, os anéis eram incubados por 30 minutos com glibeclamida (GLIB, 10 µm), um inibidor desses canais (MENEZES et al., 2007). Após 30 minutos deste procedimento foi induzida uma contração com FEN (10 µm), na fase sustentada da contração adicionou-se de maneira cumulativa a pirona-198 (0,1 nm 1 mm), a resposta obtida foi então comparada com o controle na ausência da glibenclamida (Esquema 12).

81 TENSÃO (g) 81 TEMPO (min) pirona-198 0, 1nM 1 mm 30 TEA (1 mm) 4-AP (1 mm) BaCl 2 (30 µm) GLIB (10 µm) FEN (10 µm) Esquema 12 Representação esquemática do protocolo para investigar o efeito vasorrelaxante de concentrações crescentes de pirona-198 (0.1 nm 1 mm), em anéis sem endotélio funcional incubados separadamente com bloqueadores de potássio e pré contraídos com FEN (10 μm) 5.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. (e.p.m). As diferenças entre as médias foram consideradas significantes quando o p<0,05. As comparações estatísticas foram realizadas por meio da utilização do teste t de Student não pareado. As curvas concentração-resposta, os valores de E máx (efeito máximo em porcentagem de relaxamento) e pd 2 [logaritmo negativo da concentração responsável por 50% do E máx (CE 50 )] foram obtidas por regressão não linear. Os dados foram analisados e plotados por meio da utilização do programa estatístico GraphPad Prism 5.0.

82 82 Resultados

83 83 6 RESULTADOS 6.1 RESULTADOS in vivo Efeito da pirona-198 sobre a PAM e FC em ratos Wistar não-anestesiados Em ratos normotensos não anestesiados, os valores basais da pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca foram 117 ± 4,3 mmhg e 310 ± 6,4 bpm, respectivamente. Nesses animais, a administração intravenosa de pirona-198 (10, 20, 30 e 40 mg/kg, i.v) induziu hipotensão ( 8 ± 1,6; 9,5 ± 1,2; 15,3 ± 1,7 e 14 ± 0,6%; n=5) associado com bradicardia (-55 ± 4,9; -27 ± 2,5; -36,7 ± 8,2 e -53 ± 6,6%; n=5) (Gráfico 1).

84 FC (mmhg) PAM (mmhg) Pirona (10 mg/kg) Pirona (20 mg/kg) -10 # Pirona (30 mg/kg) Pirona (40 mg/kg) ** * Dose (mg/kg, i.v.) 0-20 Pirona (10 mg/kg) Pirona (20 mg/kg) -40 * Pirona (30 mg/kg) Pirona (40 mg/kg) -60 # Dose (mg/kg, i.v.) Gráfico 1- Efeitos da pirona-198 (10,20,30 e 40 mg/kg) sobre: PAM e FC em ratos normotensos não anestesiados Valores são média ± sem, n=5. 10 versus 20,30,40 mg/kg (*p<0,05, ** p<0,01); 20 versus 30,40 mg/kg ( # p<0.05; ## p<0,001).

85 ESTUDOS FARMACOLÓGICOS DA PIRONA-198 in vitro Vasorrelaxamento induzido pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos pré-contraídos com fenilefrina (1 µm e 10 µm) na presença e ausência do endotélio funcional O efeito da pirona-198 foi avaliado nos anéis de artéria mesentérica frente às contrações com FEN nas concentrações de 1 μm e 10 μm, tanto na presença como na ausência do endotélio funcional. No primeiro grupo contendo endotélio funcional, com anéis pré-contraídos com 10 µm de FEN, a pirona-198 induziu um vasorrelaxamento na presença do endotélio funcional de maneira concentração dependente (E máx = 96,3 ± 2,1%; pd 2 = 5,5 ± 0,1; n = 7). Após a remoção do endotélio funcional a curva concentraçãoresposta para a pirona-198 foi deslocada para a direita de maneira significante, porém sem alteração no efeito máximo (E máx = 96,4 ± 1,9%; pd 2 = 5,0 ± 0,1; n = 7) (Gráfico 2ª, figura 5). No segundo grupo de experimentos foi utilizada a FEN na concentração de 1 µm, tanto na presença quanto na ausência do endotélio funcional. Nas preparações com endotélio funcional a pirona-198 induziu um vasorrelaxamento de maneira dependente de concentração (E máx = 95,4 ± 2,7%; pd 2 = 5,7 ± 0,1, n = 7). Após a remoção do endotélio, a curva concentração-resposta para a pirona-198 foi deslocada para a direita de maneira significante, porém sem alteração no efeito máximo (E máx = 99,3 ± 1,1%; pd 2 = 4,1 ± 0,06, n = 8) (Gráfico 2B, figura 6). A duração do relaxamento de cada concentração de pirona-198 foi de aproximadamente 10 minutos. Após o término dos experimentos o liquido era trocado por 30 minutos e foi induzida então uma contração com FEN (10 μm) para verificação da reversão do relaxamento induzido pela pirona-198, e em todas as preparações houve uma reversão de 100% da resposta (dados não mostrados).

86 TENSÃO (g) 86 A B TEMPO (seg) Figura 5 - Registros originais das respostas de pirona-198 (0,1 nm 1 mm) em anéis précontraídos com FEN (10 µm) com o endotélio intacto (A) ou após sua remoção (B)

87 87 A B Figura 6 - Registros originais das respostas de pirona-198 (0,1 nm 1 mm) em anéis précontraídos com FEN (1 µm) com o endotélio intacto (A) ou após sua remoção (B)

88 % Relaxamento % Relaxamento 88 A FEN 10 M (Endotélio intacto) E máx = 96,3 2,1% pd 2 = 5,5 0,1 n = 7 FEN 10 M (Endotélio removido) E máx = 96,4 1,9% pd 2 = 5,0 0,1** n = ** Log [pirona 198] M pd Endotélio intacto Endotélio removido B FEN 1 M (Endotélio intacto) E máx = 95,4 2,7% pd 2 = 5,7 0,1 n = 7 FEN 1 M (Endotélio removido) E máx = 99,3 1,1% pd 2 = 4,1 0,06 *** n = pd 2 4 *** Log [pirona 198] M 2 0 Endotélio intacto Endotélio removido Gráfico 2 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 10 μm (A) e FEN 1 μm (B) na presença e na ausência do endotélio funcional. Os valores foram expressos como média e.p.m. ** p<0,01; *** p<0,001 versus endotélio intacto

89 EFEITOS DA PIRONA-198 EM ANÉIS DE ARTÉRIA MESENTÉRICA SUPERIOR ISOLADA DE RATO NA PRESENÇA DO ENDOTÉLIO FUNCIONAL Envolvimento da enzina sintase de NO na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Após a pré-incubação dos anéis com L-NAME (100 µm), um inibidor da enos, seguida de uma contração induzida por FEN de 1 µm, a curva de vasorrelaxamento da pirona-198 foi deslocada para direita, sem redução do efeito máximo (E máx = 93,5 ± 3,8%), mas com uma significante diminuição do valor de pd 2 (4,2 ± 0,1, n=6), quando comparado ao controle (E máx = 95,4 ± 2,7%; pd 2 = 5,7 ± 0,1, n = 7) (Gráfico 3). Em um segundo grupo de experimentos foi realizada a pré-incubação dos anéis com L-NAME (100 µm) seguido de 1 mm de L-arginina, um substrato para a sintase do NO. Nesse grupo de experimentos, a L-arginina foi capaz de reverter totalmente à inibição do efeito vasorrelaxante da pirona-198, apresentando os seguintes valores de E máx = 98,9 ± 1,1 % e pd 2 = 5,5 ± 0,1(n = 6) (Gráfico 3).

90 % Relaxamento FEN 1 M (Endotélio intacto) E máx = 95,4 2,7% pd 2 = 5,7 0,1 n = 7 FEN + L-NAME (100 M) E máx = 93,5 3,8% pd 2 = 4,2 0,1*** n = 6 FEN + L-NAME + L-ARGININA (1 mm) E máx = 98,9 1,1% pd 2 = 5,5 0,1 n = Log [pirona 198] M E m áx E m áx FEN FEN + L-NAME FEN 6 4 *** 6 4 pd 2 pd 2 FEN + L-NAME + L -ARGININA FEN FEN + L-NAME FEN FEN + L-NAME + L -ARGININA Gráfico 3 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 1 μm na presença de L- NAME (100 µm) e L-NAME + L-arginina (1 mm). Os valores foram expressos como média e.p.m. ***p<0,001 versus endotélio intacto

91 % Relaxamento Envolvimento do NO na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Após a incubação dos anéis com PTIO (300 µm), um seqüestrador de óxido nítrico, uma contração com FEN 1 µm foi promovida. Na presença desta ferramenta, os valores apresentados pela pirona-198 foram: E máx = 82,4 ± 4,3% e pd 2 = 4,8 ± 0,1 (n = 6) comparados aos valores do controle (E máx = 95,4 ± 2,7%; e pd 2 = 5,7 ± 0,1, n = 7) (Gráfico 4). Dessa forma, a curva de vasorrelaxamento da pirona-198 na presença do sequestrador foi deslocada para a direita com alteração no efeito máximo FEN 1 M (Endotélio intacto) E máx : 95,4 2,7% pd 2 : 5,7 0,1 n = FEN + PTIO (300 M) E máx = 82,4 4,3%* pd 2 = 4,8 0,1*** n = Log [pirona 198] M * 6 *** E m áx pd FEN FEN + PTIO FEN FEN + PTIO Gráfico 4 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 1 μm na presença de PTIO (300 µm). Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05, *** p<0,001 versus endotélio intacto.

92 % Relaxamento Envolvimento da via NO / GMPc na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Após a pré-incubação dos anéis com ODQ (10 M), um potente inibidor que previne a ativação da CGs pelo NO, uma contração com FEN 1 µm foi promovida e em seguida ocorreu a adição cumulativa da pirona-198. Na presença do inibidor, os valores de E máx e pd 2 foram: 93,1 ± 3,4% e 4,1 ± 0,09 (n = 6), respectivamente. Quando esses valores foram comparados aos do controle, a curva de relaxamento da pirona foi deslocada para a direita sem apresentar alterações no efeito máximo (Gráfico 5) FEN 1 M (Endotélio intacto) E máx = 95,4 2,7% pd 2 = 5,7 0,1 n = FEN + ODQ (10 M) E máx = 93,1 3,4% pd 2 = 4,1 0,09*** n = Log [pirona 198] M E m áx pd *** FEN FEN + ODQ FEN FEN + ODQ Gráfico 5 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 1 μm na presença e na ausência de ODQ (10 µm). Os valores foram expressos como média e.p.m. *** p<0,001 versus endotélio intacto.

93 % Relaxamento Envolvimento dos receptores muscarínicos na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato Na presença da atropina (1 nm) a curva concentração-resposta para a pirona- 198 não foi alterada quando comparada com a curva concentração resposta da pirona-198 na ausência do bloqueador, como mostrado pelos valores do E máx e pd 2. Os valores de E máx e pd 2 na presença do bloqueador foram: E máx = 94,6 ± 3,5% e de pd 2 = 5,7 ± 0,1 (n = 5), não diferença estatística significativa quando comparada aos valores do controle: E máx = 95,4 ± 2,7%; e pd 2 = 5,7 ± 0,1, n = 7 (Gráfico 6) FEN 1 M (Endotélio intacto) E máx = 95,4 2,7% pd 2 = 5,7 0,1 n = 7 FEN + ATROPINA (1 nm) E máx = 94,6 3,5 % pd 2 = 5,7 0,1 n = Log [pirona 198] M E m áx pd FEN FEN + ATROPINA FEN FEN +ATROPINA Gráfico 6 Curvas concentração-resposta do efeito vasorelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 1 μm na ausência e presença de atropina (1 nm). Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio intacto.

94 % Relaxamento Envolvimento de metabólitos do ácido araquidônico na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato A curva concentração-resposta para a pirona-198 obtida na presença do inibidor não seletivo da ciclooxigenase, indometacina (10 M) não foi alterada quando comparada com a curva controle da pirona-198 na ausência do inibidor, como mostrado pelos valores do E máx e pd 2. Os valores expressos na presença de indometacina foram: E máx = 97,5 ± 2,4% e pd 2 = 5,4 ± 0,06 (n = 5) (Gráfico 7) FEN 1 M (Endotélio intacto) E máx : 95,4 2,7% pd 2 : 5,7 0,1 n = 7 FEN + Indometacina (10 M) E max = 97,5 2,4% pd 2 = n= Log [Pirona 198] M E m ax pd FEN FEN + INDO FEN FEN + INDO Gráfico 7 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 1 μm na ausência e presença de indometacina (10 µm). Os valores foram expressos como média e.p.m.*p<0,05 versus endotélio intacto.

95 95 Os valores de E máx e pd 2 nos protocolos realizados na presença do endotélio funcional estão listados na tabela 1. Tabela 1 - Valores de pd2 e Emáx para pirona-198 em diferentes condições experimentais em anéis de artéria mesentérica Condições experimentais n E máx (%) pd 2 FEN 10 µm (Endotélio intacto) 7 96,3 ± 2,1% 5,5 ± 0,1 FEN 10 µm (Endotélio removido) 7 96,4 ± 1,9% 5,0 ± 0,1 ## FEN 1 µm (Endotélio intacto) 7 95,4 ± 2,7% 5,7 ± 0,1 FEN 1 µm (Endotélio removido) 8 99,3 ± 1,1% 4,1 ± 0,06 *** L-NAME 100 µm 6 93,5 ± 3,8% 4,2 ± 0,1 *** L-NAME (100 µm) ,9 ± 1,1% 5,5 ± 0,1 L-ARGININA (1 mm) PTIO 300 µm 6 82,4 ± 4,3%* 4,8 ± 0,1 *** ODQ 10 µm 6 93,1 ± 3,4% 4,1± 0,09** * Atropina (1 nm) 5 94,6 ± 3,5% 5,7 ± 0,1 Indometacina (10 µm) 5 97,5 ± 2,4% 5,4 ± 0,06 *p<0.05 vs FEN 1 µm (Endotélio intacto) **p<0.01 vs FEN 1 µm (Endotélio intacto) ***p<0.001 vs FEN 1 µm (Endotélio intacto) # # p<0.05 vs FEN 10 µm (Endotélio intacto)

96 Contração (%) EFEITOS DA PIRONA-198 EM ANÉIS DE ARTÉRIA MESENTÉRICA SUPERIOR ISOLADA DE RATO NA AUSÊNCIA DO ENDOTÉLIO FUNCIONAL Atividade da pirona-198 sobre a contração induzida por FEN em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato A presença de pirona-198, tanto na concentração de 100 µm como de 1 mm, promoveram uma diminuição significativa do efeito máximo contracturante induzido por FEN (1 nm 1 mm). O E máx da curva controle (100 ± 18,5%) foi reduzido para 77,6 ± 13,8% na concentração isolada de 100 µm da pirona-198 (n = 6) e 30,0 ± 7,9% na presença da concentração de 1 mm (n = 6) (Gráfico 8) Log [FEN] M Controle E máx = 100,0 8,3% pd 2 = 7,2 0,02 n = 20 pirona 10 M E máx = 102,7 18,5% pd 2 = 7,2 0,07 n = 7 pirona 100 M E máx = 77,6 13,8% *** pd 2 = 6,6 0,08 *** n = 7 pirona 1 mm E máx = 30,0 7,9% *** pd 2 = 6,3 0,07 *** n = 6 Gráfico 8 Efeito inibitório de pirona-198 sobre a vasoconstricção induzida por FEN (1 nm 1 mm) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato sem o endotélio funcional na presença da FEN (controle) ou na presença da pirona-198. Os valores foram expressos como média e.p.m. ***p<0,001 versus controle

97 % Relaxamento Efeito da pirona-198 frente a U46619 Na contração induzida pelo agonista tromboxânico, U46619 (10 µm), a pirona- 198 apresentou um relaxamento dependente de concentração. Não houve alteração quanto a indução do vasorrelaxamento, como observado pelos valores do efeito máximo (E máx = 89,5 ± 4,2%), comparando com os valores da contração induzida por FEN 10 µm (E máx = 96,4 ± 1,9%). Quanto a potência, nas contrações induzidas por U46619, a pirona-198 teve a sua potência reduzida com deslocamento da curva para a direita, apresentando o seguinte valor de pd 2 = 2,91 ± 0,11, n = 6, comparando com os valores de pd 2 da contração induzida pela FEN: pd 2 = 5,0 ± 0,1, n = 7 (Gráfico 9) FEN 10 M (Endotélio removido) E máx = 96,4 1,9% pd 2 = 5,0 0,1 n = U46619 (10 M) E máx = 89,5 4,2% pd 2 = 2,9 0,1*** n = Log [pirona 198] M E m ax pd *** FEN U46619 FEN U46619 Gráfico 9 Curva concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com U Os valores foram expressos como média e.p.m. ***p<0,001 versus endotélio removido

98 % Relaxamento Atividade vasorrelaxante da pirona-198 em anéis contraídos com S(-) BayK 8644 e na presença de um bloqueador de Ca v tipo L O gráfico 10 mostra a resposta relaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos sem endotélio funcional e contraídos com Bay K 8644 (200 nm), adicionado à cuba, 20 minutos após o meio nutritivo de Tyrode (Quadro 1) ser trocado por uma solução despolarizante de Tyrode com 20 mm de KCl (Quadro 3). Observa-se que a administração cumulativa de pirona-198 promoveu um efeito vasorelaxante dependente de concentração, em anéis contraídos com S (- )- Bay K8644, apresentando os seguintes valores: pd 2 = 3,9 ± 0,08; E máx = 93,9 ± 3,1%, n = 6. (Gráfico 10) BayK 8644 (200 nm) E máx = 93,9 3,1% pd 2 = 3,9 0,08 n = Log [Pirona 198] M Gráfico 10 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato contraídos com S(-) BayK Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido.

99 % Relaxamento % Relaxamento 99 Para investigar se o relaxamento induzido pela pirona-198 envolve o bloqueio da entrada de Ca 2+, foram construídas curvas concentração-resposta para pirona- 198 em anéis de artéria mesentérica pré-contraídos com FEN nas concentrações de 1 e 10 µm na presença de nifedipino (1 µm). Nos anéis pré-contraídos com FEN 1 µm, o acréscimo de pirona-198, no tônus dessa contração, induziu um relaxamento (E máx = 95,8 ± 1,7%), que não foi diferentemente significante da situação controle (endotélio removido) (Gráfico 11A). Semelhantemente, na concentração de 10 µm de FEN, a curva concentração resposta (Gráfico 11B), não apresentou diferença significativa entre as concentrações quando comparadas com as mesmas na condição controle.. A 0 25 FEN 1 M (Endotélio removido) E máx : 99,3 1,1% pd 2 : 4,1 0,06 n = 8 FEN + NIF (1 M) 50 E máx = 95,8 1,7% pd 2 = 4,3 0,09 n = Log [Pirona 198] M FEN 10 M (Endotélio removido) E máx : 96,4 1,9 % pd 2 : 5,0 0,1 n = 7 FEN + NIF (1 M) E máx = 92,8 3,2% pd 2 = 5,1 0,1 n = Log [pirona 198] M Gráfico 11 Curvas concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato na presença de nifedipino pré-contraidos com FEN 1 µm (A) e FEN 10 µm (B). Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido.

100 % contração Envolvimento da pirona-198 sobre as contrações transientes induzidas por FEN (1 e 10 µm) Em meio livre de cálcio, a incubação de concentrações isoladas de pirona- 198 promoveu efeitos diferentes sobre as contrações induzidas pelas duas concentrações de FEN. Nas contrações transientes induzidas pela FEN 10 µm, a pirona-198 nas concentrações de 10 nm a 1mM foram capazes de promover redução nas contrações transientes induzidas pela FEN (Gráfico 12A). Em contraste, nas contrações transientes induzidas pela FEN 1 µm, as concentrações de pirona-198 capazes de promover uma diminuição na contração transiente induzida pelo agonista foram apenas as de 100 µm e 1 mm. Como pode ser visualizado no Gráfico 12B e na Tabela 2. A * *** *** *** *** *** 25 0 Controle Pir 0,1 nm Pir 1 nm Pir 10 nm Pir 0,1 M Pir 1 M Pir 10 M Pir 100 M Pir 1 mm

101 % contração 101 B *** 25 *** 0 Controle 10 M 100 M 1 mm Gráfico 12 Barras representativas das contrações transientes induzidas por FEN na ausência e na presença de pirona-198. Contrações transientes induzidas com FEN na concentração de 10 µm (A) e 1 µm (B). Os valores foram normalizados tomando as contrações de FEN na ausência da pirona-198 como sendo 100%. Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05; ***p<0,001 versus controle Tabela 2 - Valores de E máx para pirona-198 frente às contrações transientes induzidas pela FEN 10 µm e 1 µm Condições experimentais FEN 10 µm FEN 1 µm % contração % contração Controle 100 ± 0,4% (n = 48) 100 ± 0,2% (n = 23) pirona 0,1 nm 100 ± 4,3% (n = 6) - pirona 1 nm 100 ± 5,3% (n = 6) - pirona 10 nm 78,8 ± 7,0%* (n = 6) - pirona 0,1 µm 59,2 ± 7,1%*** (n = 6) - pirona 1 µm 44,5 ± 7,2%*** (n = 6) - pirona 10 µm 42,3 ± 2,7%*** (n = 6) 100 ± 0,5%* (n = 6) pirona 100 µm 36,8 ± 9,1%*** (n = 6) 48,3 ± 5,1%* (n = 7) pirona 1mM 36,5 ± 8,1%*** (n = 6) 12,3 ± 6,2%* (n = 10) *p<0,05; ***p<0,001 versus controle

102 % Relaxamento Envolvimento dos canais para potássio no efeito vasorrelaxante da pirona-198 A realização deste protocolo foi dividida em duas partes: no primeiro grupo o efeito da pirona-198 foi observado em anéis sem endotélio funcional incubados com TEA 3 mm e pré contraídos com FEN 10 µm. Nessa condição experimental, a pirona-198 foi capaz de produzir um efeito vasorrelaxante dependente de concentração (E máx = 92,3 ± 3,9%, pd 2 = 3,9 ± 0,06; n = 7) significativamente diferente da situação controle (E máx = 96,4 ± 1,9%, pd 2 = 5,0 ± 0,1; n = 7) (Gráfico 13) FEN 10 M (Endotélio removido) E máx = 96,4 1.9% pd 2 = 5,0 0,1 n = 7 FEN + TEA 3 mm E máx = 92,3 3,9% pd 2 = 3,9 0,06*** n = Log [pirona 198] M E m áx pd *** 0 0 FEN FEN + TEA 3 mm FEN FEN + TEA 3 mm Gráfico 13 Curva concentração-resposta do efeito vasorelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato sem endotélio funcional pré contraídos com FEN 10 μm na presença e na ausência de TEA (3 mm). Os valores foram expressos como média e.p.m. ***p<0,001 versus endotélio removido

103 % Relaxamento 103 No segundo grupo, os anéis desprovidos do endotélio funcional eram incubados com TEA 3mM e pré-contraídos com 1 µm de FEN. Nesta condição experimental, a pirona-198 (E máx = 100 ± 0,7%, pd 2 = 4,1 ± 0,05, n = 7) não foi capaz de produzir um efeito diferente do apresentado na condição controle (E máx = 99,2 ± 1,1%, pd 2 = 4,1 ± 0,06, n = 8) (Gráfico 14) FEN 1 M (Endotélio removido) E máx : 99,3 1,1 % pd 2 : 4,1 0,06 n = 8 FEN + TEA 3 mm E máx = 100 0,7% pd 2 = 4, n = Log [Pirona 198] M E m áx pd FEN FEN + TEA 3 mm FEN FEN + TEA 3 mm Gráfico 14 Curva concentração-resposta do efeito vasorelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato sem endotélio funcional pré contraídos com FEN 1 μm na presença de TEA (3 mm). Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido.

104 % Relaxamento Participação dos canais para potássio sensível ao cálcio (K Ca ) na resposta relaxante induzida pela pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, sem endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (10 µm), a pré-incubação por 30 minutos com TEA (1 mm), a curva concentração-resposta produzida pela pirona-198 apresentou um deslocamento para a direita com atenuação da potência, sem alterar o efeito máximo. Os valores obtidos nessa condição experimental foram: E máx = 91,9 ± 2,9%; pd 2 = 4,2 ± 0,1, n = 6, comparados com os valores obtidos na situação controle (E máx = 96,4 ± 1,9%; pd 2 = 5,0 ± 0,1, n = 7) (Gráfico 15) FEN 10 M (Endotélio removido) E máx = 96,4 1,9% pd 2 = 5,0 0,1 n = 7 FEN + TEA (1 mm) E máx = 91,9 2,9% pd 2 = 4,2 0,1*** n = Log [pirona 198] M E m áx pd *** FEN FEN + TEA 1 mm FEN FEN + TEA 1 mm Gráfico 15 Curva concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 10 μm na presença de TEA 1 mm. Os valores foram expressos como média e.p.m. ***p<0,001 versus endotélio removido.

105 % Relaxamento Participação dos canais para potássio sensíveis à voltagem (K v ) na resposta relaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de rato Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos sem endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (10 µm) a pré-incubação com 4-AP (1 mm) um bloqueador seletivo dos canais K v, não alterou a curva concentração-resposta para pirona-198, nem promoveu alteração significante no efeito máximo (Controle: E máx = 96,4 ± 1,9%; pd 2 = 5,0 ± 0,1, n = 7; 4-AP: E máx = 97, 3 ± 3,6%; pd 2 = 4,9 ± 0,2, n = 6) (Gráfico 16) FEN 10 M (Endotélio removido) E máx = 96,4 1,9% pd 2 = 5,0 0,1 n = FEN + 4-AP (1 mm) E máx = 97,3 3,6% pd 2 = 4,9 0,2 n = Log [pirona 198] M E m áx pd FEN FEN + 4-AP FEN FEN + 4-AP Gráfico 16 - Curva concentração-resposta do efeito vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 10 μm na presença de 4-AP. Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido.

106 % Relaxamento Participação dos canais para potássio retificadores de entrada - K IR na resposta relaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos sem endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (10 µm) a pré-incubação com BaCl 2 (30 µm) um inibidor dos canais K IR, não alterou a curva concentração-resposta para pirona-198, nem promoveu alteração no efeito máximo (Controle: E máx = 96,4 ± 1,9%; pd 2 = 5,0 ± 0,1, n = 7; BaCl 2 : E máx = 89,8 ± 4,6%; pd 2 = 4,7 ± 0,1, n = 6) (Gráfico 17) FEN 10 M (Endotélio removido) E máx = 96,4 ± 1,9% pd 2 = 5,0 0,1 n = 7 FEN + BaCl 2 (30 M) E máx = 89,8 4,6% pd 2 = 4,7 0,1 n = Log [pirona 198] M E m áx pd FEN FEN + BaCl 2 FEN FEN + BaCl 2 Gráfico 17- Curva concentração-resposta do efeito vasorelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 10 μm na presença de BaCl 2. Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido.

107 % Relaxamento Participação dos canais para potássio sensível ao ATP na resposta relaxante induzida por pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, sem endotélio funcional e pré-contraídos com fenilefrina (10 µm), a pré-incubação por 30 minutos com glibenclamida (10 µm) um inibidor seletivo dos canais K ATP, não alterou resposta vasorrelaxante promovida pela pirona-198 (Controle: E máx = 96,4 ± 1,90%; pd 2 = 5,0 ± 0,1, n = 7; glibenclamida: E máx = 90,5 ± 3,3%; pd 2 = 4,8 ± 0,1, n = 6) (Gráfico 18) FEN 10 M (Endotélio removido) E máx = 96,4 ± 1,9% pd 2 = 5,0 0,1 n = FEN + GLIB (10 M) E máx = 90,5 3,3% pd 2 = 4,8 0,1 n = Log [pirona 198] M E m áx pd FEN FEN + GLIB 0 FEN FEN + GLIB Gráfico 18 - Curva concentração-resposta do efeito vasorelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato pré contraídos com FEN 10 μm na presença glibenclamida. Os valores foram expressos como média e.p.m. *p<0,05 versus endotélio removido.

108 108 Os valores de E máx e pd 2 nos protocolos realizados na ausência do endotélio funcional estão listados na tabela 3. Tabela 3 - Valores de pd2 e E máx para pirona-198 sob diferentes condições experimentais em anéis de artéria mesentérica na ausência do endotélio funcional Condições experimentais n E max (%) pd 2 FEN 1 µm (Endotélio removido) 8 99,3 ± 1,1% 4,1 ± 0,06 FEN 10 µm (Endotélio removido) 7 96,4 ± 1,9% 5,0 ± 0,1 U46619 (10 µm) 7 89,5 ± 4,2% 2,9 ± 0,1 *** BayK ,9 ± 3,1 3,9 ± 0,08 TEA (3 mm) + FEN 10 µm 7 92,3 ± 3,9% 3,9 ± 0,06 *** (Endotélio removido) TEA 3 mm + FEN 1 µm ± 0,7% 4,1 ± 0,05 (Endotélio removido) TEA (1 mm) 6 91,9 ± 2,9% 4,2 ± 0,1 *** 4 AP (1 mm) 6 97,3 ± 3,6% 4,9 ± 0,2 BaCl 2 (30 µm) 6 89,9 ± 4,6% 4,7 ± 0,1 Glibenclamida (10 µm) 6 90,5 ± 3,3% 4,8 ± 0,1 *** p<0,001 versus FEN 10 µm (Endotélio removido)

109 109 Discussão

110 110 7 DISCUSSÃO O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar os efeitos da 6 [(E) estiril] 2 - pirona (pirona-198) proveniente da Aniba panurensis sobre o sistema cardiovascular de ratos, tentando elucidar os possíveis mecanismos de ação envolvidos em suas respostas. No desenvolvimento deste estudo foram empregados dois modelos de abordagens metodológicas. Na primeira abordagem foram utilizadas técnicas experimentais de estudo in vivo para avaliar o efeito da pirona-198 sobre a PAM e FC em ratos normotensos não anestesiados. Na segunda, foram utilizados ensaios in vitro para avaliação funcional da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos. Devido aos poucos trabalhos relatados na literatura que elucidam efeitos biológicos da Aniba panurensis, tal como os efeitos produzidos pela 6 [(E) estiril] 2 pirona no sistema cardiovascular, um objetivo de suma importância foi cumprido neste trabalho, o de aumentar a quantidade de informações relevantes a respeito desta espécie e de seus constituintes, contribuindo consideravelmente para a pesquisa na área de plantas medicinais. Uma vez que as primeiras evidências farmacológicas do efeito vasorrelaxante da pirona-198 foram mostradas por esse mesmo grupo de pesquisa. Na avaliação dos parâmetros hemodinâmicos de PAM e FC, a pirona-198 promoveu hipotensão e bradicardia. Nos expeirmentos in vitro o efeito vasorrelaxante causado pela pirona-198 parece estar relacionado com a diminuição da resistência vascular periférica em artéria mesentérica de rato. A diminuição na RVP envolve a participação de fatores relaxantes derivados do endotélio, possível envolvimento no influxo de Ca 2+ por meio da inibição dos canais para cálcio sensíveis a voltagem tipo-l (Ca v -L) e diminuição da mobilização de cálcio através dos estoques intracelulares, com possível envolvimento dos canais para potássio sensiveis ao cálcio. Com o objetivo de avaliar o efeito da pirona-198 sobre PAM e FC, utilizou-se a metodologia de aferição dos parâmetros hemodinâmicos em animais não anestesiados e com livre movimentação. Pelo fato de ser conhecido que a anestesia

111 111 modifica os níveis de PA e FC, além do funcionamento dos principais sistemas envolvidos na regulação da PA. Em experimentos realizados in vivo, a administração aguda da pirona-198 induziu uma hipotensão seguida de bradicardia intensa de maneira independente de dose. Todas as doses foram capazes de promover alterações na PAM e FC, de forma que se observou que a pirona reduziu de maneira significante os níveis de PA arterial seguida de uma redução máxima de FC, que ficou próxima de 50% (Gráfico 1). O padrão do efeito da pirona-198 de promover bradicardia e hipotensão foi semelhante ao efeito de constituintes de outra espécie do gênero Aniba, a A. canelilla, descrito na literatura por LAHLOU e colaboradores (2005), que verificaram que o óleo essencial de A. canelilla promoveu em ratos normotensos não anestesiados uma diminuição da pressão arterial média e da frequência cardíaca desses animais. Esse efeito foi parcialmente reduzido quando utilizado um inibidor da sintase do óxido nítrico, L-NAME e um bloqueador de receptor muscarinico. Essa hipotensão produzida envolvia um relaxamento vascular, com dependência do endotélio funcional envolvendo a via NO/L-arginina, tal como a inibição da corrente de cálcio através dos canais de cálcio voltagem-dependentes (LAHLOU et al., 2005). Quando foi realizada a verificação isolada de um dos principais componentes do óleo essencial de A. canelilla, o 1-nitro-2-feniletano, em animais normotensos e espontaneamente hipertensos, este foi capaz de induzir uma resposta cardiovascular caracterizada por uma bradicardia vago-vagal e reflexor depressor, e a segunda resposta hipotensora ocorre em parte por um efeito direto sobre o músculo liso vascular (INTERAMINENSE et al., 2011; SIQUEIRA et al., 2010). Outro constituinte do óleo essencial de A. canelilla, o metileugenol, em estudos com ratos normotensos não anestesiados, foi capaz de promover uma queda na pressão sanguínea, provavelmente através de um vasorrelaxamento vascular, acreditandose envolver a via oxido nítrico/l-arginina (LAHLOU et al., 2004). Drogas, com efeito, bradicárdico, como os beta bloqueadores e bloqueadores dos canais de cálcio, tem sido recomendadas para uso na terapia no combate da elevação da pressão arterial (CAI et al., 2011), pois mudanças na FC têm sido comumente observadas em vários tipos de drogas antihipertensivas, nas quais a

112 112 taquicardia tem se mostrado ser um fator de risco para eventos pós-isquêmicos e doenças cardiovasculares (CAI et al., 2011). A manutenção da pressão arterial é a principal função biológica das células vasculares, essencial para o transporte de várias substâncias para os tecidos periféricos. Um dos principais fatores na regulação da pressão arterial é o tónus do músculo liso vascular. Embora muitos fatores contribuam para a manutenção do tônus vascular, todos eles, em última análise afetam a concentração intracelular de cálcio ([Ca 2+ ] i ) na célula do músculo liso vascular. Dessa forma para uma melhor compreensão dos efeitos desta substância observados nos estudos in vivo, passou-se a investigar a atividade da pirona-198 sobre anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato. Justificando-se pelo fato de que um importante papel na manutenção da PA é desempenhado por alterações do tônus da musculatura lisa vascular, e que os canais iônicos atuam como importantes reguladores da condição contrátil do músculo liso dos vasos (THORNELOE; NELSON, 2005). Somado aos dados em que, como referido anteriormente, o efeito deste gênero Aniba sobre os padrões hemodinâmicos envolve a ação sobre a musculatura vascular. Sabendo-se, através de estudos anteriores, que o efeito da pirona-198 poderia envolver mecanismos relacionados com as vias de sinalização ativadas por agonistas alfa adrenérgicos, questionou-se se o efeito vasorrelaxante da pirona poderia ser modificado na presença de diferentes concentrações de um agonista alfa adrenérgico, como a fenilefrina. Esse questionamento baseia-se nos dados da literatura que relatam que diferentes concentrações de FEN promovem efeitos dependentes dessas concentrações (MAUBAN et al., 2001). Em artérias mesentéricas de rato a FEN tem sido reportada por aumentar de forma dosedependente a frequência de oscilações do cálcio intracelular (MAUBAN et al., 2001), tal como em veia cava inferior de coelho, correlacionando as contrações isométricas com concentrações dependentes de FEN (RUEHLMANN et al, 2000), de forma que essas oscilações não são influenciadas pela presença ou ausência do endotélio funcional (KOENIGSBERGER et al., 2010). Assim, foram utilizadas as concentrações submáxima (1 µm) e máxima (10 µm) de FEN para verificar o efeito da pirona-198 mediante as concentrações diferentes do agonista. Observou-se que na concentração de 10 µm a pirona-198 produziu um efeito vasorrelaxante dependente de concentração que, após a

113 113 remoção do endotélio funcional, teve uma atenuação da potência desse efeito (Gráfico 2A). Na concentração submáxima de FEN, a pirona-198 também promoveu um efeito vasorrelaxante dependente de concentração em anéis com endotélio funcional e após a remoção deste, o efeito máximo foi mantido com diminuição da potência da pirona-198 (Gráfico 2B). De acordo com esses resultados, sugere-se que o efeito vasorrelaxante da pirona-198 é mediado parcialmente por mecanismos dependentes do endotélio e que esse efeito não se altera quando as concentrações de FEN foram modificadas; além disso, o efeito da pirona-198 também envolve mecanismos independentes da presença do endotélio vascular e essa capacidade de promover relaxamento no músculo liso vascular foi diferente diante das concentrações de FEN. Diante desses resultados, sugere-se que em maiores concentrações do agonista as vias de sinalização envolvidas na sua resposta podem estar mais ativadas e que possivelmente a ação da pirona-198 atue mais sobre elas, podendo ser dessa forma melhor visualizada. Desta forma, a partir destas observações, todos os experimentos subsequentes realizados na presença do endotélio funcional foi utilizado 1 µm de FEN, enquanto na ausência do endotélio funcional para algumas condições experimentais foram utilizadas as concentrações submáxima e máxima com o intuito de comparar os efeitos mediante as concentrações diferentes do agonista alfa adrenérgico. Ao observar que parte então do efeito relaxante produzido pela pirona-198 envolvia o endotélio funcional, objetivou-se identificar qual (is) fator (es) derivados do endotélio vascular poderia estar sendo responsável pela ação vasodilatadora da pirona-198. Para tanto foram realizados experimentos utilizando diversas ferramentas farmacológicas. O endotélio, a superfície luminal dos vasos sanguíneos, é um importante regulador do tônus vascular via liberação de várias substâncias endógenas. A remoção e disfunção do endotélio vascular aumentam a vasoconstricção induzida por vários estímulos e por agonistas vasoativos (JIN et al.; 2008b). As células endoteliais liberam fatores derivados do endotélio como os fatores relaxantes (FRDE) e fatores contracturantes (FCDE). Dentre os FCDE contracturantes inclui endotelina, prostaglandina F 2α e tromboxano A 2 e nos relaxantes está o NO, prostaglandina I 2 e fatores hiperpolarizantes derivados do endotélio (EDHF) (LEDOUX et al.; 2005).

114 114 Considerando-se os principais agentes vasoativos, a síntese do NO envolve inicialmente a hidroxilação de um dos nitrogênios guanidinos da L-arginina para gerar NHA. Esta reação utiliza NADPH e oxigênio (O 2 ) e envolve o complexo heme da NOS. Na segunda etapa, ocorre a conversão da NHA em NO e citrulina. O NO produzido pelas células endoteliais acarreta relaxamento do músculo liso vascular (GIRARDI et al.; 2006). A síntese enzimática de citrulina pode ser inibida por análogos da L-arginina tais como N g -monometil- L - arginina (L-NMMA), N g nitro L - arginina (L-NNA) e L- NAME. Uma vez que a substituição do substrato habitual (L arginina) pelos análogos irá inibir a produção de NO e seus efeitos subsequentes, estes inibidores têm grande importância na pesquisa dos prováveis efeitos do NO nos tecidos (FLORA FILHO; ZILBERSTEIN, 2000). Sabendo-se que a utilização do L- NAME promoveria uma inibição da produção de NO, como visualizado na figura 7, objetivou-se verificar se na ausência do NO a resposta vasorrelaxante da pirona-198 seria diferente da apresentada na ausência deste inibidor. Figura 7- Mecanismo de ação do L-NAME

115 115 Nesta condição experimental, a pirona-198 apresentou um efeito vasorrelaxante dependente de concentração, porém houve um deslocamento da curva para a direita com atenuação da potência, como observado no gráfico 3. Sugerindo assim que a capacidade de promover relaxamento da pirona-198 na presença do endotélio funcional envolve possivelmente a ativação da NOS. O L-NAME atua por competição com o aminoácido L-arginina na via de produção do NO, o que leva a inibição da síntese deste último com conseqüente vasoconstricção (PEREIRA; VIANNA; MANDARIM-de-LACERDA, 1998). De forma que a adição exógena de L-arginina (1 mm) em uma concentração superior ao do L- NAME, atuará competindo pelo sitio de ligação da enos. Observa-se que em experimentos realizados na presença simultânea de L-NAME mais L-arginina, a inibição da NOS pelo L-NAME foi revertida (Gráfico 3). É relatado que a reversão do efeito inibitório do L-NAME na presença desse substrato é um forte indício da participação desta enzima em uma resposta relaxante. Desta forma, sugere-se que há a participação da NOS na resposta vasorrelaxante induzida pela pirona-198. Semelhantemente como encontrado por Lahlou e colaboradores (2004, 2005) na A. canelilla, a pirona-198 apresentou envolvimento com a via oxido nítrico/l-arginina. A difusão rápida e a facilidade com que o NO penetra em outras células devemse ao seu pequeno tamanho e a sua característica lipofílica, que são cruciais para o entendimento das suas atividades biológicas (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003). Os análogos da L-arginina, como o L- NAME, que inibem a NOS bloqueando a geração de NO, não interfere diretamente no NO radicalar (YOSHIDA et al.; 1993). A reação do PTIO com NO radicalar forma inicialmente dióxido de nitrogênio (NO 2 ) e 2-fenill-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil (PTI) (GOLDESTEIN; RUSSO; SAMUNI, 2003). Para reforçar o envolvimento do NO no efeito vasorrelavante da pirona-198, utilizou-se um seqüestrador do NO radicalar, o PTIO (300 µm) (CHAUHAN et al., 2002; ELLIS; LI; RAND, 2000), como ilustrado na figura 8.

116 116 Figura 8 - Mecanismo de ação do PTIO Na presença do PTIO, a pirona-198 promoveu um efeito vasorrelaxante dependente de concentração, entretanto apresentando uma diferença significativa quando comparado o relaxamento e a potência da pirona-198 com a condição controle. Sugerindo que a resposta vasorrelaxante da pirona-198, provavelmente, envolve a formação do NO, corroborando com os resultados anteriores descritos em que indicam a participação deste mensageiro secundário no efeito da pirona-198 (Gráfico 4). Após a difusão deste gás, no interior da célula muscular, o NO interage com o ferro do grupo heme da CGs, acarretando uma alteração da conformação desta enzima, tornado-a ativa (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003). Esta enzima catalisa a conversão GTP em GMPc, que atua ativando diversas proteínas cinases. A inativação do GMPc ocorre através de sua hidrólise, catalisada por enzimas da família das fosfodiesterases (BARRETO; CORREIA; MUSCARÁ, 2005). A potente ação vasodilatadora da via GMPc /PKG tem sido descrita por diminuir o cálcio citosólico por meio de múltiplos mecanismos redutores de cálcio e desensibilização ao cálcio pela estimulação da atividade da fosfatase da cadeia leve de miosina. A PKG promove fosforilação da RhoA no resíduo Ser 188 que causa subsequente translocação da RhoA ligada à membrana para o citosol. A inibição da

117 117 sensibilização ao cálcio do aparato contrátil induzida pela RhoA por meio da via GMPc/PKG é identificado como uma via de sinalização que contribui para a ação vasodilatadora do NO (SAUZEAU et al.; 2000). A ativação desta cinase também resulta em ativação da bomba de Ca 2+ no retículo sarcoplasmático (SERCA), aceleração da recaptação de Ca 2+ para os estoques intracelulares, ativação dos canais de K +, fechamento dos Ca v, culminando em um vasorrelaxamento (FURCHGOTT, 1983). Além desta via dependente de GMPc, estudos têm demonstrado que ocorre ativação direta de BK Ca pela PKG (CARVALHO et al.; 2001; IRVINE; FAVALORO; KEMP-HARPER, 2003). Sabendo-se que existe envolvimento da via NO/eNOS com o efeito vasorrelaxante da pirona-198 e que o NO produz uma resposta vasorelaxante no músculo liso vascular através de um mecanismo dependente de GMPc, experimentos foram realizados na presença de ODQ (10 µm), um inibidor seletivo da PKG (JIANG; WU; WANG, 2007), como visualizado na figura 9, com o intuito de verificar a participação desta enzima nos efeitos apresentados pela pirona-198 na presença do endotélio funcional. Figura 9 - Mecanismo de ação do ODQ

118 118 Nestas condições, o vasorrelaxamento induzido pela pirona-198 foi atenuado de maneira significante, sugerindo o envolvimento desta enzima na resposta vasorrelaxante da pirona-198 em anéis de artéria mesentérica de ratos (Gráfico 5). Baseando-se na literatura em que a ativação da CGs culmina na ativação da PKG e que esta ativada atuará em diversos mecanismos de promoção do relaxamento da musculatura lisa vascular, sugere-se então a participação da via enos/cgs/pkg no vasorrelaxamento induzido pela pirona-198. Vasodilatadores dependentes do endotélio, como a ACh, atuam em parte, por meio, da elevação de cálcio intracelular acompanhado da liberação de fatores relaxantes derivados do endotélio por ativação de receptores muscarínicos M 3 (LEDOUX et al.; 2006). O envolvimento dos receptores muscarínicos neste estudo foi avaliado por meio de experimentos realizados na presença de um antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos, a atropina (1 µm) (BASTOS et al.; 2009), mecanismo esse visualizado na figura 10. Figura 10 - Mecanismo de ação da Atropina

119 119 Nestas condições experimentais, a resposta vasorrelaxante da pirona-198, foi semelhante a curva concentração-resposta promovida pela pirona-198 na ausência do bloqueador (Gráfico 6), percebendo-se assim que os receptores muscarínicos provavelmente, não participam da resposta vasorrelaxante da pirona Além do NO, outras substâncias sintetizadas no endotélio, como as prostaciclinas têm sido implicadas nos relaxamentos dependentes do endotélio. A prostaciclina (PGI 2 ), substância derivada do endotélio com características vasodilatadoras, é produto do metabolismo do ácido araquidônico por ação da ciclooxigenase. O ácido araquidônico é um constituinte do fosfolipídeos de membrana e, por isso, a síntese dos eicosanóides inicia-se com a liberação desse ácido graxo, por meio da hidrólise catalisada por fosfolipases específicas (PLA 2 e C). A estimulação dos receptores de prostaciclina nas células musculares lisas provoca ativação da AC, induzindo aumento AMPc e estimulação da proteína PKA na musculatura lisa vascular. A PKA exerce efeito similar à PKG, causando a saída de Ca 2+ do citosol e inibindo a maquinaria contrátil (BATLOUNI, 2001), como visualizado na figura 11. Figura 11 - Mecanismo de ação da indometacina

120 120 De forma semelhante aos experimentos realizados com atropina, a resposta relaxante induzida por pirona-198 não foi atenuada de maneira significante nos experimentos realizados na presença de indometacina, um inibidor não seletivo da COX (SASAKI et al.; 2010). Nestas condições, sugere-se que não há o envolvimento dos metabólitos da via do ácido araquidônico nesta resposta (Gráfico 7). Desta forma, os resultados obtidos na presença do endotélio funcional permitem concluir que o efeito da pirona-198 na presença da camada luminal dos vasos, envolve a ativação da enzima enos com subsequente ativação da via CGs/PKG com envolvimento dos seus respectivos alvos biológicos na produção do relaxamento muscular. Como parte do efeito da pirona-198 se dá sobre o músculo liso, de forma independente do endotélio, investigou-se em quais pontos a substância em estudo poderia estar atuando para promover vasorrelaxamento. O tônus muscular liso é regulado pela concentração de cálcio intracelular ([Ca 2+ ] i ), sendo o aumento desta o evento chave no processo de ativação do aparato contrátil das células musculares lisas (KATOUE et al.; 2006), por meio da utilização do ciclo de pontes cruzadas entre a actina e a miosina (WEBB, 2003). A contração muscular estimulada por agonistas ocorre por ligação deste com receptores de sete alças transmembranares, acoplados a uma proteína G heterotrimérica, estimulando assim a atividade da PLC. Esta enzima é específica para o lipídio de membrana PIP 2, que cataliza a formação de dois potentes segundos mensageiros: IP 3 e DAG (HALL et al.; 2006). Agonista alfa adrenérgico, como a FEN, promove o aumento do tônus vascular pela estimulação do receptor α 1 -adrenérgico e pela elevação do influxo de cálcio (KARAKI; WEISS, 1988), o aumento na [Ca 2+ ] i e ativação de cascata de fosforilação, podem aumentar a força sensível ao cálcio, como envolver mecanismos independentes deste íon (ZANG; BALKE; WIER, 2001). Em estudos anteriores foi observado que a pirona-198 apresenta maior potência do seu efeito vasorrelaxante quando o mecanismo contrátil se deu pelo acoplamento fármacomecânico, com a utilização de FEN, do que pelo mecanismo eletromecânico, através da despolarização produzida por altas concentrações externas de potássio (ASSIS, 2007). Sugerindo assim que o efeito vasorrelaxante da estirilpirona envolveria vias de sinalização ativadas na resposta do agonista adrenérgico.

121 121 A partir de então, o primeiro questionamento foi saber se a pirona-198 poderia atuar diretamente sobre o receptor α 1 - adrenérgico. Os resultados obtidos no protocolo em questão mostrou que a pirona-198 inibiu a contração induzida pelo adicionamento cumulativo de FEN (Gráfico 8), sugerindo que a ação da substância em estudo não é aparentemente sobre os receptores adrenérgicos existentes na artéria mesentérica superior e sim sobre mecanismos posteriores à ativação do receptor, podendo ser a respeito da ação sobre a via de sinalização ativada por esse agonista ou da ativação de mecanismos relaxantes na musculatura lisa vascular, de algum modo influenciando na resposta contrátil induzida pela ativação de receptores α 1 -adrenérgicos. E outro resultado que reforça essa idéia, foi obtido mediante as contrações induzidas pelo U O U46619 ativa receptores prostanóides tromboxânicos, que são GPCRs (HALL et al.; 2006) acoplados a proteína Gq estimulando a via PLC/IP 3 /DAG (SNETKOV et al.; 2006). Os Ca v estão envolvidos nessa resposta, tal como ação sobre os SOCCs, mobilização de cálcio intracelular e bloqueio dos K v (KAYE et al.; 1997) e BK Ca (SCORNIK; TORO, 1992). A curva concentração resposta induzida pela pirona-198 apresentou diferenças significativas entre as contrações induzidas pela FEN e U46619 (Gráfico 8). A diferença estatística existe na comparação entre os valores de pd 2, observando que houve uma diminuição da potência da pirona-198 na contração induzida por U46619 com deslocamento da curva para a direita. Sugerindo-se que essa resposta ocorre pelo fato de existirem vias em comum na promoção da contração da FEN e U46619, e que a diminuição da potência se deu pelo fato de que existem mecanismos incomuns entre o agonista tromboxânico e o agonista adrenérgico. O fato que assemelha a contração induzida por FEN e pelo U46619 é que a contração promovida envolve a abertura de Ca v. Uma condição experimental que permite observar um possível efeito sobre esses canais é o aumento de potássio extracelular (KCl 80 mm), que promove uma despolarização de membrana, levando à abertura dos Ca V, o que culmina no aumento do influxo de Ca 2+ na célula, gerando a contração. Em estudos anteriores, nessas condições experimentais, observou-se o envolvimento dos Ca V no vasorrelaxamento produzido pela pirona-198, envolvimento este também visualizado por meio de experimentos com adição cumulativa de CaCl 2 em meio despolarizante nominalmente sem cálcio, antes e após a incubação com concentrações isoladas de pirona-198 (ASSIS, 2007).

122 122 A partir disso, passou-se a avaliar se a ação desta pirona seria de forma direta sobre os canais Ca v tipo L. Essa observação foi possível pela utilização de uma ferramenta farmacológica, agonista destes canais, o Bay K8644 (200 nm). A pirona-198 inibiu as contrações tônicas induzidas por Bay K8644 de maneira concentração dependente, entretanto, com potência menor do que a obtida quando a contração foi induzida por FEN 10 µm (Gráfico 10), sugerindo o envolvimento dos Ca v tipo L na resposta vasorrelaxante induzida por pirona-198. Esses canais também podem ser observados através de experimentos na presença de nifedipino, pois é conhecido que na presença deste bloqueador, a tensão gerada é altamente dependente dos estoques internos de cálcio, bem como de mecanismos independentes de Ca 2+, por exemplo, ativação da CPI-17, uma proteína inibidora da MLCP (DIMOPOULOS et al.; 2007). Nessa condição experimental, os anéis de artéria mesentérica foram pré-contraídos com as concentrações submáxima e máxima de FEN, pois como referido na literatura a concentração de cálcio varia de acordo com as concentrações desse agonista alfa adrenérgico. Em anéis pré-contraidos com 1 µm de FEN na presença de nifedipino, a pirona promoveu uma resposta vasorrelaxante que não foi diferente do seu efeito na ausência do bloqueador (gráfico 11). Resultado semelhante nas contrações induzidas por 10 µm de FEN, quando comparada com a condição controle. Esses resultados justificam que parte do efeito da pirona-198 se dá por ação em outros mecanismos adicionais que não envolvam significativamente a participação dos Ca v. Pois o bloqueio dos canais de Ca 2+ tipo L reduz a concentração de cálcio intracelular e a força isométrica das artérias quando expostas a um agonista alfa adrenérgico, mas não afeta a amplitude ou frequência das oscilações do cálcio intracelular induzidas por FEN (MIRIEL et al., 1999), porém essas oscilações de cálcio são dependentes da concentração de FEN (ZANG; BALKE; WIER, 2001). Esses resultados são corroborados com os resultados obtidos nos protocolos com estoques intracelulares, como descritos a seguir. Nos vasos sangüíneos, as respostas contráteis do músculo liso podem ser mediadas por influxo do cálcio extracelular através de Ca v, pela liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR) pelos RyR ou liberação de cálcio pelos IP 3 R, estoques localizados no RS (GRAYSON et al., 2004).

123 123 Vários sinais de cálcio subcelulares têm sido descritos, incluindo: Ca 2+ -sparks (faíscas de cálcio) e Ca 2+ - puffs, eventos que ocorrem no RS. As sparks de Ca 2+ são eventos que ocorrem quando este íon é liberado pelos RyR no RS e os puffs de Ca 2+ ocorre quando os IP 3 R são abertos (WRAY et al.; 2005). As ondas de cálcio (cálcio waves) são oscilações que ocorrem como um resultado da liberação de cálcio intracelular por ativação de IP 3 R e /ou RyR. As propriedades das ondas de cálcio e a contribuição destes receptores podem diferir dependendo da natureza do estímulo (WELLMAN; NELSON, 2003). Na ausência de cálcio extracelular são observadas apenas as contrações transientes, provenientes dos estoques intracelulares, visto que o influxo de cálcio é requerido para a manutenção da fase tônica da contração do músculo liso (WANG et al., 2002). Em estudos anteriores foi visualizado que nas suas duas maiores concentrações, a pirona-198 foi capaz de diminuir a mobilização de cálcio através dos receptores de rianodina presentes no reticulo sarcoplasmático (ASSIS, 2007). Sobre a mobilização de cálcio proveniente da abertura dos IP 3 R no músculo liso promovida por 10 µm de FEN, a pirona-198 foi capaz de diminuir de forma significativa a mobilização de cálcio através desses receptores, de forma que apenas as duas menores concentrações não inibiram essa mobilização (Gráfico 12A). Quando a concentração de FEN foi diminuída para 1 µm, a inibição da mobilização de cálcio através dos estoques intracelulares foi reduzida significativamente (gráfico 12B), sendo apenas as duas maiores concentrações de pirona-198 inibidoras dessa mobilização. Assim, como o efeito independente do endotélio foi mais potente quando a concentração do agonista utilizada foi a máxima, esses resultados justificam a diferença dos efeitos da pirona-198 quando comparadas as duas concentrações de FEN. Ou seja, quanto maior a mobilização de cálcio, melhor o efeito da pirona-198, pelo fato de que esta atua fortemente sobre essa mobilização. Esses resultados estão de acordo com estudos referidos na literatura, onde concentrações de FEN aumenta de forma dependente de concentração a fração de células produzindo ondas de Ca 2+, tal como o número de ondas de Ca 2+ produzidas em cada célula (ZANG; BALKE; WIER, 2001). Mediante o fato do envolvimento dos íons cálcio na resposta vasorrelaxante da pirona-198 e sabendo-se que esses íons são capazes também de atuar na manutenção do tônus vascular por promover ativação de canais sensíveis a sua presença, como alguns canais para potássio, objetivou-se então avaliar uma

124 124 possível participação dos canais para potássio nos efeitos induzidos pela pirona O tônus vascular de pequenas artérias e arteríolas é o maior determinante da resistência periférica, afetando o controle da pressão sanguínea. Nas células do músculo liso vascular, a abertura dos canais de potássio gera o aumento do efluxo destes íons causando uma hiperpolarização de membrana (JIANG; WU; WANG, 2007), que resulta no fechamento dos Ca V, diminuindo a entrada de Ca 2+ na célula causando uma vasodilatação (SOBEY et al., 2001). O envolvimento de canais de K + no efeito vasorrelaxante da pirona-198 foi verificado por meio da utilização de vários bloqueadores de canais para potássio, como ilustrado na figura 12. Figura 12 - ilustração dos bloqueadores de canais para potássio Foi utilizado um bloqueador não seletivo destes canais, TEA 3 mm (WANG et al.; 2008). Esses experimentos foram realizados com as duas concentrações do agonista, com o intuito de verificar se a possivel participação desses canais teria envolvimento com o cálcio mobilizado.

125 125 Na condição experimental em que os anéis sem endotélio funcional foram incubados com TEA 3mM seguido de uma contração induzida por 10 µm de FEN, a resposta vasorrelaxante da pirona-198 foi significativamente diferente da situação controle (Gráfico 13). Esses resultados permitem observar que existe uma participação dos canais para potássio no efeito induzido pela pirona-198 e que essa ação pode ser direta sobre os canais presentes no músculo liso vascular. Esse efeito não foi reproduzido em anéis sem endotélio funcional incubados com TEA 3 mm e pré-contraídos com FEN 1 µm. De forma interessante, esses resultados permitem fazer as seguintes observações: o efeito da pirona-198 só foi possível de ser visualizado quando a concentração de FEN foi maior; a correlação existente entre esses efeitos passam pelo fato de que o influxo de cálcio, logo o aumento da concentração intracelular de cálcio, que ocorrem em maiores concentrações do agonista como descrito na literatura, é essencial para promover a ativação de um determinado subtipo de canal para potássio, o canal de potássio sensível ao cálcio (K Ca ). O fato do efeito vasorrelaxante da pirona-198 não ter sido visualizado com a menor concentração de FEN é justificado pelo fato de que em baixas concentrações de cálcio intracelular, estes canais de potássio sensíveis ao cálcio se tornam um puro canal de potássio voltagem dependente (LEDOUX et al., 2006). Com todas essas considerações já fundamentadas na literatura, resolveu-se então avaliar o efeito da pirona-198 sobre os canais de potássio sensíveis ao cálcio. Para isso foi utilizado TEA na concentração de 1mM e pré-contraidos com FEN 10 µm, e nesta condição experimental, a pirona-198 promoveu um efeito relaxante dependente de concentração significativamente diferente da condição controle, sugerindo o envolvimento da pirona-198 com os canais para potássio sensíveis ao cálcio (gráfico 15). Para avaliar se a pirona-198 poderia ter um efeito sobre os canais K v, utilizouse 4-AP (1 mm) um bloqueador seletivo desses canais. Em anéis incubados com 4- AP, a pirona-198 não foi capaz de promover um efeito relaxante diferente da situação controle, fundamentando assim que a ação da pirona-198 não se dá sobre esses canais (gráfico 16). Esse resultado contribui para justificar que a ação da pirona-198 ocorre sobre os K Ca, pois como referido na literatura, os canais de potássio sensíveis ao cálcio quando em baixas concentrações desse íon atuam como um K v (LEDOUX et al., 2006), o que justifica o fato de que não foi possível

126 126 visualizar o efeito da pirona-198 sobre esses canais quando em baixas concentrações do agonista, já que a pirona-198 não possui ação sobre os K v. Sabendo-se da existência de outros canais para potássio expressos no músculo liso vascular, resolvemos então investigar se existiria uma possível participação destes canais na resposta relaxante produzida pela pirona-198. Com o intuito de verificar se os K IR estariam envolvidos nesta resposta, utilizamos BaCl 2 (30 µm), um inibidor desses canais. E nessa condição experimental, a resposta relaxante produzida ela pirona-198 não foi alterada significativamente quando comparada a situação em que o inibidor estava ausente (Gráfico 17). O mesmo ocorreu quando utilizamos glibenclamida, com o intuito de avaliar um possível envolvimento dos K ATP, de forma que a resposta vasorrelaxante da pirona-198 não sofreu nenhuma alteração comparada à situação controle (gráfico 18). A verificação do envolvimento dos canais para potássio na resposta produzida pela pirona-198 através da utilização de bloqueadores específicos, permite sugerir que há envolvimento dos K Ca nessa resposta, de forma que esse envolvimento só foi possível de ser visualizado em anéis sem endotélio funcional e quando a concentração de [Ca 2+ ] i encontrava-se elevada, sugerindo que a ação da pirona-198 ocorre sobre esses canais, sem o intermédio dos fatores derivados do endotélio. A utilização dos outros bloqueadores permite sugerir que não há o envolvimento dos subtipos K ATP, K IR e K v na resposta vasorrelaxante da pirona-198. Com estes resultados, pode-se sugerir que o efeito vasorrelaxante induzido pela pirona-198, envolve fatores dependentes do endotélio, com a participação da via da enos/gmpc/pkg. Como também o envolvimento dos fatores independentes do endotélio, sendo o ponto chava da ação da pirona-198 o seu papel sobre a mobilização de cálcio através dos receptores sensíveis ao IP 3 presentes no reticulo sarcoplasmático, além do envolvimento dos canais para potássio sensíveis ao cálcio. A figura que segue abaixo corresponde às representações hipotéticas dos mecansimos de ação da pirona-198 sobre a musculatura lisa vascular, cujos circulos pretos indicam os possíveis alvos de ação da pirona-198.

127 Figura 13 - Representação hipotética do mecanismo de ação da pirona