COMPREENDENDO O PROCESSO DE CONTRAÇÃO E RELAXAMENTO DA MUSCULATURA LISA NÃO VASCULAR. Genesson Barreto
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- Miguel Barroso Benevides
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1 COMPREENDENDO O PROCESSO DE CONTRAÇÃO E RELAXAMENTO DA MUSCULATURA LISA NÃO VASCULAR Genesson Barreto
2 COMPREENDENDO O PROCESSO DE CONTRAÇÃO E RELAXAMENTO DA MUSCULATURA LISA NÃO VASCULAR EFEITO DE Desmodium adscendens SOBRE A CONTRAÇÃO DA MUSCULATURA LISA: ESTUDO DO SEU MECANISMO DE AÇÃO Genesson Barreto Primeira Edição São Paulo 2017
3 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Gustavo Ballejo, docente do Depto. de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, pela brilhante capacidade de ensinar, por elevar meu aprimoramento científico, não se esquecendo de ser amigo e manifestar apoio, além da paciente orientação. Ao Prof. Dr. Fernando de Queiroz Cunha, docente do Depto. de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, por ter me mostrado o caminho e permanecido sempre emprestando sua contribuição. Ao Prof. Dr. Alexandre Pinto Corrado, docente do Depto. de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, pelo grande incentivo, apoio constante e grande amizade. Ao Técnico Tadeu, do Depto. de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, pelo companheirismo diário, amizade e valiosa ajuda para o desenvolvimento do trabalho. Ao Prof. Adjunto Waldir Ribeiro Bastos, pelo excepcional apoio, capacidade de dividir, solidariedade e amizade. Ao Prof. Benedito Figueiredo, pela prontidão no fornecimento dos animais, contribuição fundamental para execução deste trabalho. Aos colegas do Laboratório do Depto. de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP, por tornar agradável meu cotidiano e estada nessa cidade. A todos os funcionários do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP, do biotério à secretaria, pela receptividade e colaboração. Ao CNPq e à PROPEP, pelo auxílio financeiro Enfim, a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para o desenvolvimento do meu trabalho.
4 LISTA DE FIGURAS Figura 1- Procedimento geral para a extração do material da planta Figura 2- Efeito do EDA sobre a contração mantida do íleo de cobaio induzida pela ACh Figura 3- Efeito dos diferentes bloqueadores de canais de potássio sobre o relaxamento promovido pelo EDA na contração mantida do íleo de cobaio induzida pela ACh Figura 4- Efeito do EBDA sobre a contração mantida do íleo de cobaia e útero de rata induzida pela ACh Figura 5- Efeito do TEA e BaCl 2 sobre o relaxamento induzido pelo EBDA na contração mantida do íleo de cobaia e útero de rata induzida pela ACh Figura 6- Efeito do EBDA sobre a contração mantida do anococcígeo de rato induzida pela ACh e Fe Figura 7- Efeito do EBDA sobre a contração mantida do íleo de cobaio, útero de rata e anococcígeo de rato induzida pelo K + 80 mm Figura 8- EBDA inibiu de maneira concentração-dependente a curva concentração-resposta ao cálcio no anococcígeo de rato.59 Figura 9- Efeito da nifedipina sobre a contração mantida do útero de rata induzida pela ACh e K + 80 mm... 61
5 Figura 10- Efeito da nifedipina sobre a contração mantida do músculo anococcígeo de rato induzida pela ACh, Fe e pelo K + 80 mm Figura 11- Efeito do forskolin sobre a contração mantida do útero de rata e anococcígeo de rato induzida pela ACh, Fe e pelo K + 80 mm Figura 12- Efeito da cromacalina na contração mantida do útero de rata e anococcígeo de rato induzida pela ACh, Fe, OT e K + 80 mm Figura 13- Efeito do AM, LY e o ODQ sobre o relaxamento induzido pelo NPS de sódio na contração mantida do anococcígeo de rato induzida pelo K + 80 mm Figura 14- Efeito do AM, LY e o ODQ sobre o relaxamento induzido pelo NPS na contração mantida do anococcígeo de rato induzida pela Fe Figura 15- Efeito do AM, LY e o ODQ sobre o relaxamento induzido pela NH 2 OH na contração mantida do anococcígeo de rato induzida pelo K + 80 mm Figura 16- Efeito do AM, LY e o ODQ sobre o relaxamento induzido pela NH 2 OH na contração mantida do anococcígeo de rato induzida pela FE
6 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Valores da Concentração inibitória 50 % (CI 50 ) do EBDA Tabela 2- Valores da Concentração inibitória 50 % (CI 50 ) do NPS na contração mantida do anococcígeo de rato induzida pelo K + 80 mm na ausência e presença do AM, LY e ODQ Tabela 3- Valores da Concentração inibitória 50 % (CI 50 ) da NH 2 OH na contração mantida do anococcígeo de rato induzida pelo K + 80 mm na ausência e presença do AM, LY e ODQ Tabela 4- Valores da Concentração inibitória 50 % (CI 50 ) do NPS na contração mantida do anococcígeo de rato induzida pela Fe na ausência e presença do AM, LY e ODQ Tabela 5- Valores da Concentração inibitória 50 % (CI 50 ) da NH 2 OH na contração mantida do anococcígeo de rato induzida pela Fe na ausência e presença do AM, LY e ODQ... 75
7 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS... 4 LISTA DE TABELAS... 6 RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO OBJETIVO REVISÃO DA LITERATURA Processo de acoplamento excitação-contração no músculo liso Processo de acoplamento fármaco-mecânico no músculo liso Mecanismos de relaxamento Mecanismos de remoção do cálcio intracelular Nucleotídeos cíclicos MATERIAL E MÉTODOS Coleta e identificação do material botânico Obtenção do extrato bruto aquoso de D. adscendens Obtenção da fração butanólica do extrato aquoso de Desmodium adscendens Ensaios biológicos... 37
8 Animais Preparações Preparação de íleo isolado de cobaia e do anococcígeo isolado de rato Preparação do útero isolado de rata Verificação das atividades farmacológicas do EDA e EBDA Efeito dos diferentes bloqueadores de canais de potássio sobre o relaxamento promovido pelo EDA na contração mantida do íleo isolado de cobaio induzida pela ACh Efeito do TEA e BaCl 2 sobre o relaxamento induzido pelo EBDA na contração mantida do íleo de cobaia e útero de rata induzida pela ACh Efeito do EBDA sobre a curva concentração-resposta ao cálcio no útero de rata e no anococcígeo de rato induzido pelo K + 80mM Efeito da nifedipina, forskolin e cromacalina sobre a contração mantida do útero de rata e anococcígeo de rato induzida por diferentes agonista Efeito do AM, LY e o ODQ sobre o relaxamento promovido pelo NPS ou NH 2 OH na contração mantida do anococcígeo isolado de rato induzida pela Fe e K + 80 mm Soluções Análise das informações RESULTADOS... 44
9 1.1- Efeito do EDA sobre a contração mantida do íleo de cobaia induzida pela ACh Efeito dos diferentes bloqueadores de canais de potássio sobre o relaxamento promovido pelo EDA na contração mantida do íleo de cobaia induzida pela ACh Efeito do EBDA sobre a contração mantida do íleo de cobaia e o útero de rata induzida pela ACh Efeito do TEA e BaCl 2 sobre o relaxamento promovido pelo EBDA na contração mantida do íleo de cobaia e útero de rata induzida pela ACh Efeito do EBDA sobre a contração mantida do anococcígeo de rato induzida pela ACh e Fe Efeito do EBDA sobre a contração mantida do íleo de cobaia, útero de rata e anococcígeo de rato induzida pelo K + 80 mm Efeito do EBDA sobre a curva concentração-resposta ao Ca +2 no útero de rata e no anococcígeo de rato Efeito da nifedipina sobre a contração mantida do útero de rata e anococcígeo de rato induzida pôr diferentes agonistas Efeito do forskolin sobre a contração mantida do útero de rata induzida pelo K + 80 mm e ACh Efeito da cromacalina sobre a contração mantida do útero de rata e anococcígeo de rato induzida por diferentes agonistas... 66
10 2.1- Efeito do AM, LY e o ODQ sobre os relaxamentos promovidos pelo NPS ou NH 2 OH a na contração mantida do anococcígeo de rato induzida pelo K + 80 mm Efeito do AM, LY e o ODQ sobre os relaxamentos induzidos pelo NPS ou NH 2 OH na contração mantida do anococcígeo de rato induzida pela Fe DISCUSSÃO CONCLUSÃO PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 90
11 RESUMO A composição química das plantas pode variar em função de fatores tais como solo e época da coleta. Desmodium adscendens é uma planta empregada no tratamento da asma em Gana, Africa. Em Mato Grosso esta planta é utilizada somente no tratamento de inflamação ovariana. O mecanismo de ação do efeito relaxante da planta não está esclarecido. Tem sido sugerido que este se deve a depleção dos estoques de histamina (Addy & Awumey, 1984), a inibição das enzimas ciclooxigenase e lipoxigenase (ADDY & BURKA, 1988; ADDY, 1989), aumento da sintese de prostaglandina, PGE 2 e PGF 2a (ADDY, 1992; ), abertura dos canais BK Ca (Macmanus et al., 1993) ou inibição do metabolismo do ácido araquidônio dependente da via citocromo P450-NADPH (ADDY & SCHWARTZMAN, 1992). O objetivo do trabalho foi verificar se a planta encontrada em Mato grosso também relaxa o músculo liso e compreender melhor seu mecanismo de ação. O EDA relaxou (84,14±5,17%) de forma concentraçãodependente a contração mantida do íleo isolado de cobaia induzida pela aplicação de ACh, que foi revertida pelo TEA (1-10 mm), mas não pela 4-ap (1 mm) ou glibenclamida (10 M). A aplicação acumulativa da EBDA relaxou a contração mantida do íleo de cobaia (99±1%) e útero de rata (98,75±0,75%)
12 induzida pela ACh. Esse efeito foi revertido pelo Ba +2 (1 mm) e TEA (1 mm) no íleo e somente pelo Ba +2 (1 mm) no útero. Estes resultados sugerem que o efeito do extrato se deve à presença de substância capaz de abrir canais de potássio e permite descartar a participação dos canais de potássio ATP dependente ou voltagem dependente. O EBDA também relaxou (94,66±3,52%) a contração mantida do anococcígeo de rato induzida pela ACh, mas não a induzida pela Fe. Além disso, foi capaz de relaxar a contração mantida do íleo de cobaio (100%), útero de rata (98±1%) e anococcígeo de rato (94,33±2,73) induzida pelo K + 80 mm. A diferença entre a CI 50 para relaxar as contrações do íleo (0,086 IC 95% 0,06-0,11) e útero (0,057 IC 95% 0,047-0,086) induzidas pela ACh, a CI 50 para relaxar as contrações do anococcígeo (0,35 IC 95% 0,24-0,51) induzidas pela ACh e as contrações do íleo (0,15 IC 95% 0,13-0,17), útero (0,306 IC 95% 0,201-0,466) e anococcígeo (0,37 IC 95% 0,297-0,461) induzidas pelo K + 80 mm sugerem que o EBDA parece atuar por mecanismos diferentes. O EBDA além de desviar para a direita a curva concentração-resposta ao cálcio, reduz a resposta máxima no útero e no anococcígeo. A contração mantida do útero e do anococcígeo induzida pela ACh e K + 80 mm foi relaxada de forma concentração dependente pelo forskolin e nifedipina.
13 Com exceção da nifedipina, forskolin, nitroprussiato de sódio e hidroxilamina também relaxaram a contração mantida do anococcígeo induzida pela fenilefrina. Na contração mantida do anococcígeo induzida pela fenilefrina, o relaxamento provocado pelo nitroprussiato de sódio parece envolver a ativação da guanilato ciclase, o que não foi observado com o anococcígeo pré-contraído pelo K + 80 mm, que parece ser independente dessa ativação Ao comparar o perfil destas substâncias com a fração butanólica, os resultados permitem descartar a possibilidade de que o efeito da fração seja devido ao aumento dos nucleotídeos cíclicos (AMPc e GMPc) e permite sugerir que provavelmente as substâncias presentes no EBDA atuam por pelo menos dois mecanismos distintos: um deles que age através do fluxo de potássio, provavelmente através dos canais de potássio dependente de Ca de alta condutância e outro que parece ser através do bloqueio de canais de Ca voltagem dependente. Palavras-chave: músculo liso, anococcígeo, íleo, útero Desmodium adscendens, relaxamento
14 ABSTRACT The chemical composition of the plants can vary in function of such factors as soil and time of the collection. Desmodium adscendens is an employed plant in the treatment of the asthma in Ghana, Africa. In Mato Grosso this plant is only used in the treatment of ovarian inflammation. The mechanism of action of the relaxing effect of the plant is not cleared. It has been suggested that this it is due the depletion of the histamin stocks (Addy & Awumey, 1984), the inhibition of the enzymes cicloxigenase and lipoxigenase (ADDY & BURKA, 1988; ADDY, 1989), increase of the prostaglandin synthesis, PGE 2 and PGF 2 (ADDY, 1992), opening of the channels BK Ca (Macmanus et al., 1993) or inhibition of the metabolism of the acid dependent araquidonic of the pathway citocromo P450- NADPH (ADDY & SCHWARTZMAN, 1992). The objective of the work was to verify the plant found in Mato Grosso it also relaxes the smooth muscle and to understand your action mechanism better. The aqueous extract from the leaves of the D. adscendens relaxed in a concentration-dependent way the contraction maintained of the isolated ileum of guinea pig induced by the aplication of Ach that was reverted by the TEA but not by the 4-AP or the glibenclamide.
15 The cumulative application of the butanolic fraction relaxed the contraction maintained in the isolated ileum of the guinea pig and in the isolated rat uterus, induced by ACh. This effect was reverted by the Ba +2 and only by TEA in the ileum. These suggest that the effect of the extract is due to the presence of a substance that is able to open K + channels, but they allow us to discard the participation of the either K ATP or on K V channel. The butanolic fraction also relaxed the maintained contraction of the isolated anococcygeus of a rat, induced by the ACh, but not that induced by phenyleprine. It was able to relax the maintained contraction of the isolated ileum of a guinea pig and isolated anococcygeus of a rat, induced by high K +. The difference between the IC 50 to relax the contraction of the ileum and uterus induced by the ACh, the IC 50 to relax the contractions of the anococcygeus induced by ACh and the contractions of the ileum, uterus and anococcygeus induced by high K +, suggest that the butanolic fraction acts through different mechanisms. The butanolic fraction, besides turning to the right the concentration-response curve to calcium, reduces the maximum response in the uterus and anococcygeus. The maintained contraction of the uterus and anococcygeus induced by ACh and high K + was relaxed in a concentration-
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