Variação sazonal em antioxidantes em folhas de plantas jovens de Caesalpinia echinata Lam. (pau-brasil) 1

Transcrição

1 Revist Brsil. Bot., V.28, n.4, p , out.-dez. 25 Vrição szonl em ntioxidntes em folhs de plnts jovens de Ceslpini echint Lm. (pu-brsil) 1 PATRICIA BULBOVAS 2,4, MIRIAN C.S. RINALDI 3, WELINGTON B.C. DELITTI 2 e MARISA DOMINGOS 3 (recebido: 18 de novembro de 24; ceito: 13 de outubro de 25) ABSTRACT (Sesonl vrition in ntioxidnts in leves of young plnts of Ceslpini echint Lm. (brzilwood)). The urbn environmentl fctors generte conditions of oxidtive stress in plnts. Cellulr ntioxidnts, such s scorbic cid (AA), thiols (Ti), peroxidses (POD) nd superoxide dismutse (SOD) re induced to different levels depending on their cpcity to tolerte stressing conditions. In the first prt of this study we determined the profile of these defenses in leves of different ges of young plnts of C. echint. The levels of ntioxidnts were similr in ll leves nlyzed, independently of the ge. Secondly, we evluted the sme ntioxidnts nd glutthione (GSH) in 13 young plnts kept in greenhouse with constnt monitoring of temperture, reltive humidity nd irrdince during 18 months, in order to estblish the sesonl vritions occurring in response to climtic fctors. During this period, lef ntioxidnts were nlyzed every three months. In generl, AA concentrtions nd POD ctivity in C. echint were higher thn the levels reported for other tropicl tree species. Sesonl vritions were observed. GSH concentrtion nd POD ctivity were significntly influenced by temperture nd SOD by temperture nd humidity. Key words - scorbic cid, Ceslpini echint, glutthione, peroxidses, superoxide dismutse, thiols RESUMO (Vrição szonl em ntioxidntes em folhs de plnts jovens de Ceslpini echint Lm. (pu-brsil)). O mbiente urbno pode gerr condições de estresse oxidtivo ns plnts, levndo à estimulção de ntioxidntes como ácido scórbico (AA), tióis (Ti), peroxidses (POD) e superóxido dismutse (SOD), em diferentes níveis, de cordo com su cpcidde de tolerr tis condições. Este estudo, em su primeir fse, buscou conhecer o perfil dests defess em folhs de plnts jovens de C. echint com diferentes grus de desenvolvimento. Os níveis dos ntioxidntes form similres em tods s folhs nlisds. Em um segund fse, tis ntioxidntes e gluttion (GSH) form vlidos em 13 plnts mntids em cs de vegetção com monitormento constnte de tempertur, umidde reltiv e irrdiânci, por um período de 18 meses, pr estbelecer se vrições szonis nesss defess ocorrem em respost ftores climáticos. Nesse período, os ntioxidntes folires form nlisdos cd três meses. Em gerl, concentrção de AA e tividde d POD form lts em C. echint, qundo comprds com s de outrs espécies rbóres tropicis. Houve vrições ns defess o longo do tempo. A concentrção de GSH e tividde d POD mostrrm ser influencids por mudnçs n tempertur e SOD foi estimuld em respost à tempertur e à umidde reltiv. Plvrs-chve - ácido scórbico, Ceslpini echint, gluttion, peroxidses, superóxido dismutse, tióis Introdução A explorção descontrold do pu-brsil (Ceslpini echint Lm., Leguminose - Ceslpiniodee), nos primeiros séculos d colonizção, contribuiu significtivmente pr redução de sus populções nturis. Apesr de seu vlor, tnto histórico qunto econômico, n tulidde ess espécie está em perigo de extinção. Um possível form de conservção 1. Prte d tese de doutordo de P. Bulbovs. 2. Universidde de São Pulo, Instituto de Biociêncis, Deprtmento de Ecologi Gerl, Ru do Mtão, Trvess 14, 321, São Pulo, SP, Brsil. 3. Instituto de Botânic, Seção de Ecologi, Cix Postl 45, São Pulo, SP, Brsil. 4. Autor pr correspondênci: pbulbovs@hotmil.com ex situ d espécie seri expnsão do seu uso em mbientes urbnos pr fins de rborizção e pisgismo, tendo em vist seu potencil ornmentl, por presentr porte elegnte, cop rredondd, folhs cor verde-brilhnte e flores em ccho mrelo-ouro suvemente perfumds (Lim et l. 22, Roch 24). No entnto, tl ção somente será bem sucedid se C. echint for tolernte o estresse oxidtivo imposto pels condições do mbiente urbno, que induz, ns céluls vegetis, formção de espécies retivs de oxigênio, que podem tcr e modificr quse tods s moléculs orgânics, resultndo em sérios dnos às céluls e os tecidos. Por outro ldo, s plnts podem mobilizr enzims e substâncis ntioxidntes pr protegê-ls contr o excesso ou produção inproprid desss espécies. Esses compostos ntioxidntes

2 688 P. Bulbovs et l.: Antioxidntes folires em C. echint intergem entre si formndo um sistem de respost ntioxidtiv, que pode minimizr s conseqüêncis do estresse e mnter o equilíbrio pró-oxidnte/ntioxidnte (Muggli 1993, Bry et l. 2). Ns céluls vegetis, enzims como superóxido dismutse (SOD) e peroxidses (POD) e moléculs solúveis em águ como ácido scórbico (AA) e compostos orgânicos contendo grupos sulfidril (SH), denomindos tióis (Ti), são importntes ntioxidntes. A gluttion reduzid (GSH), um tripeptídeo formdo por glutmto, cisteín e glicin, é gerlmente o mis bundnte entre os tióis. Tods são substâncis-chve integrntes do ciclo scorbto-gluttion, o mis estuddo sistem ntioxidnte (Kocsy et l. 21). A.- SOD ctlis dismutção do rdicl superóxido (O 2 ), produzindo peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) (Rnk 1997), o qul pode ser elimindo pels POD (Meloni et l. 23). O AA, lém de eliminr o H 2 O 2, tmbém remove - O 2, OH (rdicl hidroxil) e 1 O 2 (oxigênio singleto) e, ind, inibe reções desencdeds por espécies retivs de oxigênio e protege os lipídios d membrn (Muggli 1993). A GSH funcion como substrto pr remoção de H 2 O 2 pel gluttion peroxidse, convertendo-se pr form oxidd, o que previne peroxidção dos lipídios e rege com o OH e 1 O 2, protege os grupos SH ds enzims essenciis o metbolismo d célul, sendo oxidd no lugr dests, e tem o ppel importnte de regenerr o AA (Foyer et l.1994). Muits vezes, plnts exposts à situção estressnte do mbiente urbno não presentm injúris visíveis, ms seu sistem ntioxidnte pode ser bstnte lterdo, de modo que, por meio d quntificção de ntioxidntes, pode-se detectr se s condições de tempertur, umidde reltiv, irrdiânci, poluição tmosféric, entre outros, são cpzes de gir sobre s plnts (Arndt & Schweizer 1991, Fngmeier et l. 1994). Certmente, lguns ftores de vrição devem ser previmente conhecidos pr que se tenh certez d tivção do sistem de resposts ntioxidtivs em plnts que crescem em mbientes urbnos, pois se sbe que tis defess vrim não somente entre espécies, como tmbém entre plnts d mesm espécie em diferentes estádios de desenvolvimento e entre folhs d mesm plnt, em fses distints de desenvolvimento (Klumpp et l. 2). Além disso, s espécies tmbém respondem às vrições mbientis o longo ds estções do no (Chitny et l. 22, Kuk et l. 23, Lee et l. 24, Rivero et l. 24, Zhou & Zho 24). Sendo ssim, este trblho buscou, em um primeir fse, determinr s vrições n tividde de SOD e POD, e ns concentrções de AA e de Ti, em folhs de diferentes estádios de desenvolvimento, de plnts jovens de C. echint e, em um segund fse, determinr vrição szonl intrínsec d espécie no que diz respeito esses ntioxidntes, incluindo gluttion, e verificr se est poderi ser induzid por condições climátics, sem influênci d poluição tmosféric. Pr tnto, um lote de plnts foi mntido em cs de vegetção com r filtrdo, isento de prtículs e gses tóxicos, por um período de 18 meses. Os resultdos deste trblho podem subsidir estudos sobre perturbções mbientis urbns em plnts de C. echint, como por exemplo, s cusds por poluentes tmosféricos, definindo um ponto de comprção pr delimitr mudnçs nos ntioxidntes nestes estudos. Mteril e métodos As plnts de Ceslpini echint Lm. utilizds n primeir fse de experimentos erm provenientes do mesmo lote de produção, tinhm mesm idde (cerc de qutro nos) e, em médi, 23 cm de ltur e pelo menos qutro folhs no cule principl. Form cultivds em scos de muds, com terr vegetl disponível comercilmente, irrigds dirimente e mntids em viveiro com sombremento de 5%, n Reserv Biológic e Estção Experimentl de Mogi-Guçu, São Pulo, e trzids o Instituto de Botânic, n cidde São Pulo, SP, dus semns ntes do início ds nálises. N fse inicil, mostrgem ds folhs com diferentes grus de desenvolvimento foi feit de cordo com su posição no cule principl, tomndo por bse seus diferentes nós de crescimento. Estbeleceu-se que folh mis jovem, no ápice d plnt, pertenci o primeiro nó do cule principl e s demis, com grus de desenvolvimento crescentes, o segundo nó em dinte. Pr determinção de cd ntioxidnte, cinco plnts de C. echint form nlisds. Esse ensio foi relizdo em duplict (ensios 1 e 2). Pr segund fse do estudo, determinrm-se os mesmos ntioxidntes, com o créscimo d gluttion entre os Ti, em plnts jovens de C. echint mntids em cs de vegetção com r filtrdo, isento de prtículs grosss e fins e de gses, construíd n sede do Instituto de Botânic, São Pulo, SP. Pr est fse, cento e trint muds de C. echint, produzids em tubetes com substrto Plntmx do tipo hortliç d Euctex, n Reserv Biológic e Estção Experimentl de Mogi-Guçu, form trnsplntds pr vsos plásticos com o mesmo substrto, crescido de dubção dequd (dubo encpsuldo misturdo o substrto e plicção semnl de solução preprd com dubos folir e de enrizmento). Em bril de 22, form

3 Revist Brsil. Bot., V.28, n.4, p , out.-dez levds pr cs de vegetção e tinhm, em médi, dois nos de idde, 24 cm de ltur e seis folhs no cule principl. As plnts form irrigds por cpilridde, segundo modelo proposto por Arndt & Schweizer (1991), trvés de brbntes de náilon inseridos n bse dos vsos, sendo que um de sus extremiddes ficv em contto com s rízes e outr metde mergulhd em cixs que servim como reservtórios de águ. Sobre ests cixs form colocds tels de rme glvnizdo que permitirm poir os vsos e mergulhr os brbntes n águ. Durnte o experimento, s plnts de C. echint form dubds menslmente. A prtir de três meses d trnsferênci pr cs de vegetção, quinze plnts form retirds trimestrlmente: os 3 meses de experimento: julho/2; 6 meses: outubro/2; 9 meses: jneiro/3; 12 meses: bril/3; 15 meses: julho/3; 18 meses: outubro/3. Desse modo, grupos distintos de plnts permnecerm n cs de vegetção por períodos crescentes de tempo. Ness fse, form usds s folhs que mostrrm resposts mis evidentes n etp inicil cim. Assim, form usds folhs do segundo nó pr nálise de Ti e GSH, do terceiro nó pr AA e SOD, e do qurto nó pr POD. Ao longo de todo o período de experimentção, form tomds, com um termohigrógrfo, medids contínus de tempertur e umidde reltiv. O perfil d rdição fotossinteticmente tiv foi estbelecido por meio de medids descontínus relizds em um di por semn, o redor ds 12: h, com rdiômetro portátil Li-Cor Li-185B. Esses ddos do mbiente encontrm-se sumrizdos n tbel 1. Em todos os ensios, s colets form relizds no período mtutino. Primeirmente form determinds s concentrções de AA, de Ti e de GSH. Pr nálise dos ntioxidntes enzimáticos (SOD e POD), s folhs form coletds e congelds -4 ºC. Após colet do mteril pr nálise, o restnte ds folhs foi retirdo, imeditmente pesdo e levdo pr estuf à 6 ºC pr obtenção do peso seco. A rzão entre peso fresco e peso seco foi utilizd pr expressr concentrção ou tividde dos ntioxidntes por unidde de mss sec. Os ntioxidntes de folhs de C. echint form nlisdos, conforme descrição bixo, empregndo-se métodos previmente definidos pr plnts jovens de árvores ntivs d Florest Atlântic (Domingos et l. 1998, Klumpp et l. 2) ou mplmente cultivds no Brsil (Klumpp et l. 1997, Mores et l. 22). Ácido scórbico (AA) Folhs frescs (,2 g) form homogeneizds com 12 ml de solução quos de etileno dimin ácido tetrcético - sl de sódio (EDTA-N 2 ) (,7%) e ácido oxálico (,5%). O extrto resultnte foi centrifugdo (4. g, 3 min, 2 ºC). Leiturs form relizds em espectrofotômetro (λ = 52 nm), pós o créscimo 2,5 ml de solução 2,6 diclorofenol-indofenol sl de sódio dihidrtdo (DCPiP) (,2%) (primeir leitur) e,5 ml de ácido scórbico 1% o sobrendnte (segund leitur). O conteúdo de ácido scórbico foi estimdo prtir d diferenç entre o brnco e o resultdo d diferenç desss leiturs (Keller & Schwger 1977). Tióis (Ti) e gluttion (GSH) Folhs frescs form homogeneizds (,7 g) com ácido scórbico,15% e centrifugds (44. g, 3 min, 2 ºC), sendo diciondos,2 ml de 3 crboxi-4-nitrofenil disulfeto (DTNB),4% em tmpão fosfto (,2 M ph 7,),,2 ml de tmpão fosfto (,2 M ph 7,) e 1,3 ml de tmpão tris-hcl (ph 8,) o extrto resultnte. A leitur d bsorbânci foi relizd em espectrofotômetro em 415 nm. Pr determinção d GSH, n segund fse deste estudo, os tióis não protéicos form obtidos prtir destes mesmos extrtos, que form quecidos em bnho-mri 1 ºC por 5 min e depois centrifugdos (44. g, 1 min, 2 ºC), visndo à desnturção e seprção ds proteíns. Nesses extrtos desproteinizdos, foi relizd um leitur como descrit cim e, em seguid, eles form diciondos Tbel 1. Médis e vlores máximos e mínimos de tempertur (T), de umidde reltiv (UR) e de rdição fotossinteticmente tiv (RFA), n cs de vegetção o longo de 18 meses. Médis clculds pr o intervlo de três meses entre dus mostrgens consecutivs. Tble 1. Averge nd mximum nd minimum vlues of temperture (T), reltive humidity (UR) nd photosynthetic ctive rdition (RFA), in the greenhouse during 18 months. Averge vlues were clculted for three month intervls between two consecutive smplings. Tempo de exposição Meses de exposição T UR RFA (meses) (mx.-min.) (mx.-min.) (mx.-min.) (ºC) (%) (µmol m -2 s -1 ) -3 Abr.-Jul./2 21 (35-13) 67 (95-45) 443 (816-74) 3-6 Jul.-Out./2 2 (32-9) 6 (9-39) 663 (126-91) 6-9 Out./2-Jn./3 21 (35-14) 65 (91-42) 513 (936-9) 9-12 Jn.-Abr./3 22 (35-15) 64 (96-43) 814 ( ) Abr.-Jul./3 2 (35-11) 72 (96-34) 533 (15-151) Jul.-Out./3 18 (33-12) 76 (92-42) 45 (414-17)

4 69 P. Bulbovs et l.: Antioxidntes folires em C. echint,2 ml de DTNB,4% em tmpão fosfto (,2 M ph 7,),,2 ml de tmpão fosfto (,2 M ph 7,) e 1,1 ml de tmpão tris- HCl (ph 8,),,3 ml de lbumin (1%),,1 ml de glioxilse I e,9 ml de metil-glioxl (,1 M), e form mntidos por 15 min em tempertur mbiente, visndo conversão d gluttion em S-lctonil gluttion. O conteúdo de GSH foi, então, clculdo pel diferenç entre s concentrções obtids nos extrtos desproteinizdos e nqueles incubdos com glioxlse I e metil-glioxil (De Kok et l. 1985). Atividde ds peroxidses (POD) As folhs congelds (,3 g) form homogeneizds com tmpão fosfto (,1 M, ph 7,) e polivinilpolipirrolidon (PVPP) 2% e centrifugds (4. g, 3 min, 2 ºC). Após dição o sobrendnte de 2 ml de outro tmpão fosfto (,1 M, ph 5,5),,3 ml de fenilendimin (1%) e,5 ml de peróxido de hidrogênio (,3%), conforme descrito por Klumpp et l. (1989), relizou-se leitur d bsorbânci em espectrofotômetro (λ = 485 nm). A bsorbânci do complexo H 2 O 2 -POD formdo foi medido em dois tempos, dentro de um fix liner d curv de reção. O delt d bsorbânci ( E) foi dividido pelo tempo em que mbs s medids form tomds (os 2, e 3,5 min), indicndo tividde d POD durnte redução do peróxido de hidrogênio. Atividde d superóxido dismutse (SOD) As folhs congelds (,4 g) form homogeneizds com PVPP e solução contendo tmpão fosfto (5 mm, ph 7,5), EDTA-N 2 1 mm, NCl 5 mm e ácido scórbico 1 mm e centrifugds (22. g, 25 min, 2 ºC). Ao sobrendnte form diciondos,5 ml de EDTA-N 2,54 mm,,8 ml de tmpão fosfto de potássio (,1 M, ph 7,),,5 ml de metionin,13 m M,,5 ml de zul p-nitrotetrzólio (NBT),44 mm e,2 ml de riboflvin 1 mm, e solução resultnte foi expost luz fluorescente (8 W) por 2 min. Extrtos preprdos seguindo o mesmo procedimento form mntidos no escuro. A bsorbânci d solução foi medid em espectrofotômetro (λ = 56 nm) em mbos os tipos de extrto (ilumindo e não ilumindo) e diferenç entre s dus bsorbâncis foi considerd pr determinção d tividde d SOD, que consistiu n inibição d redução do NBT, pel dismutção enzimátic do superóxido (Osswld et l. 1992). Os resultdos d primeir fse deste estudo form nlisdos esttisticmente trvés de nálise de vriânci com dois ftores (ensios e folhs de diferentes nós), pr verificr se houve interção entre os ftores e diferençs entre os resultdos de cd indicdor de estresse obtidos ns folhs provenientes dos diferentes nós. Os resultdos d segund fse deste estudo form nlisdos esttisticmente trvés de nálise de vriânci não prmétric (Kruskl-Wllis), seguid por testes de comprções múltipls (teste Dunn ou Student-Newmn- Keuls). Tmbém foi relizd nálise de componentes principis (ACP), objetivndo verificr se o sistem de defess ntioxidntes vriou o longo dos dezoito meses de estudo e indicr os ntioxidntes mis importntes pr explicr qulittivmente tl vrição. Análises de correlção de Person form relizds pr determinr se s vrições nos ntioxidntes estrim relcionds às mudnçs szonis n tempertur e umidde reltiv do r. Resultdos A nálise esttístic ftoril plicd os resultdos d primeir fse mostrou que não houve interção entre os ftores ensio e idde ds folhs (p >,5), ssim como não houve diferenç significtiv entre os resultdos dos indicdores bioquímicos obtidos ns plnts dos dois ensios utilizdos e ns folhs dos diferentes nós, observndo-se tendêncis, que pens norterm escolh ds folhs pr nálises o longo do experimento relizdo n cs de vegetção (figur 1). Os níveis de AA ns plnts mntids n cs de vegetção form significtivmente miores os 3 meses de experimento e menores os 9 e 12 meses (figur 2A). A concentrção de Ti foi mior os 12 meses e mis bixo os 6 e 9 meses (figur 2B). Ao longo dos 18 meses de estudo, houve grnde vrição n concentrção e porcentgem de GSH (figurs 2C, D). Apesr d lt concentrção de Ti os 12 meses, neste mesmo período foi observd mis bix concentrção de GSH e, consequentemente menor porcentgem de GSH em relção o totl de Ti. Vlores significtivmente menores de GSH e de porcentgem de GSH tmbém form encontrdos os 15 meses. As miores proporções dest substânci em relção os tióis form verificds nos primeiros 6 meses de experimento. A tividde ds POD tmbém vriou bstnte durnte o experimento (figur 2E). A mior tividde foi verificd os 3 e 12 meses e s menores os 6, 15 e 18 meses de estudo. Finlmente, tividde d SOD oscilou menos o longo do tempo, tendo sido mior os 12 meses e menor os 18 meses (figur 2F). A nálise de componentes principis resumiu 67% d vribilidde totl dos ddos nos dois primeiros eixos, sendo que o eixo 1 responde por 42% dos resultdos e o eixo 2 por 25% (figur 3). GSH e porcentgem de GSH presentrm forte relção com o eixo 1 (r =,76 e r =,9, respectivmente) e POD e Ti com o eixo 2 (r = -,67 e r = -,66, respectivmente). O gráfico tmbém mostr que os períodos de colets se seprm, indicndo que concentrção ou tividde dos ntioxidntes form diferentes o longo dos 18 meses de mostrgem e que, dependendo d époc de mostrgem, cd ntioxidnte contribuiu mis ou menos pr explicr vrição totl no sistem ntioxidtivo.

5 Revist Brsil. Bot., V.28, n.4, p , out.-dez Por exemplo, os 3, 6, 9 e 18 meses (uniddes mostris situds do ldo positivo do eixo 1), GSH, tnto em concentrção qunto em porcentgem do totl de Ti, foi o ntioxidnte mis importnte entre os nlisdos, e os 12 e 15 (uniddes mostris situds do ldo negtivo do eixo 1), s tividdes de POD e de SOD prevlecerm. A nálise de correlção mostrou que concentrção de GSH e porcentgem de GSH form relcionds negtivmente com tempertur. A tividde ds enzims POD e SOD, por outro ldo, presentou relção positiv com tempertur, e SOD, dicionlmente, esteve relciond negtivmente com umidde reltiv. As vrições nos teores de AA e de Ti, por su vez, não form relcionds significtivmente com szonlidde em mbos os ftores climáticos (tbel 2). Discussão Os resultdos obtidos n primeir fse mostrrm que os níveis de ntioxidntes form semelhntes em C. echint, independentemente d idde d folh. Desse modo, s vrições szonis observds o longo d exposição ds plnts em cs de vegetção, n segund fse deste estudo (figur 3), não poderim ser tribuíds o estádio de desenvolvimento ds folhs, 12 A 6 B mg g µmol g Ensio 1 Ensio 2 Ensio 1 Ensio 2 1 C 6 D 8 E.mim g Unidde SOD g Ensio 1 Ensio 2 Ensio 1 Ensio 2 Figur 1. Vlores médios pr ácido scórbico (A), tióis (B), peroxidses (C) e superóxido dismutse (D) e respectivos erros pdrões (brrs), em folhs do primeiro ( ), segundo ( ), terceiro ( ) e qurto ( ) nós de plnts jovens de Ceslpini echint utilizds nos ensios 1 e 2 d primeir fse do estudo (n = 5). As diferençs entre os resultdos obtidos nos ensios, pr folhs de cd nó, e entre os resultdos obtidos pr s folhs dos diferentes nós, em cd ensio, não form significtivs (p >,5). Figure 1. Men vlues for scorbic cid (A), totl thiols (B), peroxidses (C) nd superoxide dismutse (D) nd respective stndrd errors (brs) in leves of the first ( ), second ( ), third ( ) nd fourth ( ) nodes of two distinct sets of Ceslpini echint splings included in the ssys 1 nd 2 of the first step of the study. No significnt differences were observed mong the results obtined in both ssys, for the leves inserted in ech node, nd mong the results obtined in the leves inserted in the different nodes, in ech ssy (p >.5).

6 692 P. Bulbovs et l.: Antioxidntes folires em C. echint E.min g -1 µmol g -1 mg g A b b b b b C b b b b 6 4 b b b b b b 4 bc 2 c * * 1 E b 2 c c c Meses Unidde SOD g -1 % µmol g b b 2 b b c Meses B D F Figur 2. Vlores médios pr ácido scórbico (A), tióis (B), gluttion (C), porcentgem de gluttion (D), peroxidses (E) e superóxido dismutse (F) e respectivos erros pdrões (brrs), em folhs de indivíduos jovens de Ceslpini echint mntidos em cs de vegetção por 18 meses. 3 meses: Jul./2; 6: Out./2; 9: Jn./3; 12: Abr./3; 15: Jul./3; 18: Out./3. As letrs indicm diferençs esttístics entre os resultdos de cd período (n = 15, p <,5). *Não determindo. Figure 2. Men vlues for scorbic cid (A), thiols (B) glutthione (C), percent of glutthione (D), peroxidses (E) nd superoxide dismutse (F) in leves of Ceslpini echint splings grown in greenhouse for 18 months. 3 months: Jul./2; 6: Oct./2; 9: Jn./3; 12: Apr./3; 15: Jul./3; 18: Oct./3. A. For ech ntioxidnt, men vlues indicted with distinct letters re significntly different (n = 15, p <.5). *Not determined.

7 Revist Brsil. Bot., V.28, n.4, p , out.-dez Eixo 2 (25%) 1-4 SOD Eixo 1 (42%) %Glut %GS 3 AA Glut SH -1 GSH Ti POD H -2-3 Figur 3. Análise de componentes principis (ACP) dos ntioxidntes determindos em folhs de indivíduos jovens de Ceslpini echint mntidos em cs de vegetção, por 18 meses. 3 meses: Jul./2 ( ); 6: Out./2 ( ); 9: Jn./3 ( ); 12: Abr./3 ( ); 15: Jul./3 ( ); 18: Out./3 ( ). AA = ácido scórbico, Ti = tióis, GSH = gluttion, % GSH = porcentgem de gluttion em relção o totl de tióis, POD = peroxidses, SOD = superóxido dismutse. Figure 3. Principl component nlysis (PCA) of ntioxidnts determined in leves of Ceslpini echint splings grown in greenhouse for 18 months. 3 months: Jul./2 ( ); 6: Oct./2 ( ); 9: Jn./3 ( ); 12: Apr./3 ( ); 15:Jul./3 ( ); 18: Oct./3 ( ). AA = scorbic cid, Ti = totl thiols, GSH = glutthione, % GSH = percentge of glutthione in reltion to totl thiols, POD = peroxidses, SOD = superoxide dismutse. podendo-se excluir est possível interferênci n interpretção dos resultdos posteriormente obtidos. As quntiddes médis de AA em C. echint, ns diferentes mostrgens (médis entre 4,-8, mg g -1 ; figurs 1, 2), lém de muito conservtivs, form muito lts qundo comprds com s encontrds, utilizndo os mesmos métodos nlíticos, em outrs espécies ntivs d Florest Atlântic ou cultivds no Brsil (Tibouchin pulchr Cogn., Psidium gujv L. e Psidium cttleynum Weinw.), exposts em locis poluídos ou não (médis entre,3-1,1 mg g -1 ). Por outro ldo, esss espécies presentrm quntiddes folires de Ti (,8-4,5 µmol g -1 ) semelhntes à de C. echint (,7-4,4 µmol g -1 ). A tividde d POD, por su vez, foi gerlmente mis lt em C. echint ( E.min g -1 ) do que ns referids espécies (médis entre E.min g -1 ) (Klumpp et l. 1997, Domingos et l. 1998, Klumpp et l. 2, Mores et l. 22). No entnto, não se pode inferir sobre o gru de tolerânci de C. echint o estresse oxidtivo com bse no conteúdo ou n tividde bsl dos ntioxidntes, como preconizm Bry et l. (2), devido restrições metodológics. O método empregdo pr nálise de AA, por exemplo, não permite diferencir o composto com função ntioxidtiv dquele sem tl função (ácido isoscórbico) (Speek et l. 1984). Do mesmo modo, determinou-se tividde ds peroxidses em gerl, entre s quis se incluem não somente scorbto peroxidse e guicol peroxidse, com reconhecid função ntioxidtiv, como tmbém outrs que não têm est cpcidde. Assim, no presente estudo,

8 694 P. Bulbovs et l.: Antioxidntes folires em C. echint Tbel 2. Correlção de Person entre s vriáveis tempertur e umidde reltiv (médis pr os intervlos de três meses entre mostrgens), e os níveis de ntioxidntes estuddos ns plnts mntids n cs de vegetção o longo de 18 meses (n = 6). Tble 2. Person correltion between temperture or reltive humidity (verge for three month intervls between smplings), nd levels of ntioxidnts in the plnts mintined t the greenhouse during 18 months (n = 6). Antioxidntes Tempertur Umidde reltiv Coeficiente de p Coeficiente de p correlção correlção Ácido scórbico (AA) -,14,18,1,918 Tióis (Ti),5,611,16,126 Gluttion (GSH) -,24,2 -,3,791 % Gluttion (% GSH) -,27,11 -,15,149 Peroxidses (POD),48 <,1 -,16,137 Superóxido dismutse (SOD),54 <,1 -,48 <,1 o perfil dos compostos nlisdos o longo do tempo foi considerdo um indicdor mis dequdo d cpcidde de C. echint tolerr o estresse oxidtivo do que seus níveis bsis. Nesse cso, prtiu-se do princípio de que intensificção ds defess em respost o umento d formção de espécies retivs de oxigênio induzido por ftores mbientis poderi ser percebid por intermédio de mudnçs nesse perfil. As figurs 2 e 3 indicm que s vrições nos ntioxidntes ds plnts de C. echint não precerm estr relcionds o tempo crescente de exposição ou à idde ds plnts. Cso isso fosse evidente, tis figurs presentrim grdientes de concentrção ou tividde dos ntioxidntes o longo do período de exposição. O perfil dos ntioxidntes não pont, igulmente, indícios de climtção ds plnts às condições de exposição d cs de vegetção, o que seri verificdo cso os níveis dos mesmos vrissem pouco o longo ds mostrgens (Brnes et l. 1999). Assim, s mudnçs nos ntioxidntes desss plnts possivelmente contecerm em função de mudnçs szonis de ftores do mbiente. Conforme indicdo pels nálises de correlção (tbel 2), tempertur foi o ftor mis importnte, entre os monitordos, comndr os níveis dos ntioxidntes. Nos períodos mis quentes, como o que corresponde o intervlo entre o 9 o e 12 o mês, enqunto o nível de GSH, tnto em termos de concentrção qunto em termos de proporção do totl de Ti, foi bixo, tividde ds enzims foi lt. O inverso ocorreu nos períodos mis frios, como os correspondentes os intervlos de tempo entre 3 o e 6 o mês e entre o 15 o e 18 o mês (tbel 1; figurs 2, 3). Estudos relizdos por outros utores tmbém já mostrrm que tempertur do mbiente pode cusr mudnçs n concentrção de GSH e n tividde dos ntioxidntes enzimáticos em plnts como Morus lb L., sob lts temperturs, e Ze mys L. e Cucumis stivus L., sob bixs temperturs (Chitny et l. 22, Lee et l. 24, Tkc 24). A SOD, ns plnts de C. echint, preceu ser mis influencid por vrições nos ftores mbientis do que os demis ntioxidntes estuddos, pois presentou relção significtiv com tempertur e com umidde reltiv (tbel 2). Assim, est enzim, primeir tur no ciclo scorbto-gluttion (Bry et l. 2), pode exercer um ppel importnte n defes ds plnts jovens de C. echint contr o estresse oxidtivo induzido por ftores mbientis. Respost semelhnte foi observd por Rivero et l. (24), que verificrm que ess enzim foi únic ser estimuld em plnts de Lycopersicon esculentum L. cv. Tmknvf (2) exposts à lt tempertur, enqunto POD, ctlse e gluttion redutse form inibids. N verdde, em mbiente nturl, s resposts ntioxidtivs de plnts às vrições biótics são induzids por mecnismos similres, que resultm em dptções épocs mis secs ou mis úmids, dis de mior ou menor incidênci luminos, como tmbém bixs e lts temperturs. Isso porque todos esses ftores mbientis extremos levm o umento ds concentrções ds espécies retivs de oxigênio, e, consequentemente, estimulm do mesmo modo os ntioxidntes (Bry et l. 2, Kuk et l. 23). Por exemplo, Zhou & Zho (24) verificrm que grmínes forrgeirs que crescem em regiões montnhoss e fris podem produzir grnde quntidde de ntioxidntes e ssim tolerrem um período de condições climátics extrems. Por outro ldo, os

9 Revist Brsil. Bot., V.28, n.4, p , out.-dez ntioxidntes podem, tmbém, ser estimuldos nesss grmínes, em períodos fvoráveis o crescimento, qundo há umento n produção de espécies retivs de oxigênio n cdei de trnsporte de elétrons dos cloroplstos. Os resultdos obtidos neste estudo permitirm pdronizr metodologi de mostrgem e de nálises de ntioxidntes em plnts jovens de C. echint e crcterizr o perfil dos mesmos pr espécie. A concentrção de AA e tividde d POD form lts, qundo comprds com s de outrs espécies rbóres tropicis. Verificou-se, ind, que s vrições nos ntioxidntes nesss plnts ocorrerm em respost vrições szonis nos ftores do mbiente monitordos. A concentrção de GSH e tividde d POD vrirm significtivmente em repost às mudnçs n tempertur. A SOD foi mis sensível às mudnçs mbientis. Agrdecimentos À Fundção de Ampro à Pesquis do Estdo de São Pulo pel bols de doutordo concedid à primeir utor (Processo /1151-5) e pelo uxílio finnceiro (Processo /6422-4). Referêncis bibliográfics ARNDT, U. & SCHWEIZER, B The use of bioindictors for environmentl monitoring in tropicl nd subtropicl countries. In Biologicl monitoring. Signls from the environment (H. Ellenberg, ed.). Vieweg, Eschborn, p BARNES, J., BENDER, J.B., LYONS, T. & BORLAND, A Nturl nd mn-mde selection for ir pollution resistnce. Journl of Experimentl Botny 5: BRAY, E.A., BAILEY-SERRES, J. & WERETILNYK, E. 2. Responses to biotic stresses. In Biochemistry & Moleculr Biology of Plnts (B.B. Buchnn, W. Gruissen, & R.L. Jones, eds.). Americn Society of Plnt Physiologists, New York, p CHAITANYA, K.V., SUNDAR, D., MASILAMANI, S. & REDDY, A.R. 22. Vrition in het stress-induced ntioxidnt enzyme ctivities mong three mulberry cultivrs. Plnt Growth Regultion 36: DE KOK, L.J., BOSMA, W., MAAS, F.M. & KUIPER, P.J.C The effect of short-term H 2 O fumigtion on wtersoluble sulphydryl nd glutthione levels in spinch. Plnt, Cell nd Environment 8: DOMINGOS, M., KLUMPP, A. & KLUMPP, G Air pollution impct on the Atlntic forest in the Cubtão region, SP, Brzil. Ciênci e Cultur 5: FANGMEIER, A., BRUNSCHÖN, S. & JÄGER, H.J Time course of oxidnt biomrkers in flg leves of whet exposed to ozone nd drought stress. New Phytologist 126: FOYER, C.H., DESCOURVIÈRES, P. & KUNERT, K.J Protection ginst oxygen rdicls: n importnt defense mechnism studied in trnsgenic plnts. Plnt, Cell nd Environment 17: KELLER, T. & SCHWAGER, H Air pollution nd scorbte. Europen Journl of Forest Pthology 7: KLUMPP, G., GUDERIAN, R. & KÜPERS, K Peroxidseund Superoxiddismutse- Aktivität sowie Prolingehlte von Fichtenndeln nch Belstung mit O 3, SO 2 und NO 2. Europen Journl of Forest Pthology 19: KLUMPP, A., KLUMPP, G. & DOMINGOS, M. (resp.) Vegettion module. In Air pollution nd vegettion dmge in the tropics - the Serr do Mr s n exmple - Finl report (D. Klockow, H.T. Trg & W. Vutz, eds). GKSS - Forschungszentrum Geesthcht GmbH, Geesthcht, p.v.1-v.47. KLUMPP, G., FURLAN, C.M., DOMINGOS, M. & KLUMPP, A. 2. Response of stress indictors nd growth prmeters of Tibouchin pulchr Cogn. exposed to ir nd soil pollution ner the industril complex of Cubtão, Brzil. The Science of the Totl Environment 246: KOCSY, G., GALIBA, G. & BRUNOLD, C. 21. Role of glutthione in dpttion nd signling during chilling cold cclimtion in plnts. Physilogi Plntrum 113: KUK, Y.I., SHIN, J.S., BURGOS, N.R., HWANG, T.E., HAN, O., CHO, B.H., JUNG, S.Y. & GUH, J.O. 23. Antioxidtive enzymes offer protection from chilling dmge in rice plnts. Crop Science 43: LEE, M.A., CHUN, H.S., KIM, J.W., LEE, H., LEE, D.H. & LEE, C.B. 24. Chnges in ntioxidnt enzyme ctivities in detched leves of cucumber exposed to chilling. Journl of Plnt Biology 47: LIMA, H.C., LEWIS, G.P. & BUENO E. 22. Pu-brsil: um biogrfi. In Pu-Brsil (E. Bueno, ed.). Axis Mundi Editor, São Pulo, p MELONI, D.A., OLIVA, M.A., MARTINEZ, C.A. & CAMBRAIA, J. 23. Photosynthesis nd ctivity of superoxide dismutse, peroxidse nd glutthione reductse in cotton under slt stress. Environmentl nd Experimentl Botny 49: MORAES, R.M., KLUMPP, A., FURLAN, C.M., KLUMPP, G., DOMINGOS, M., RINALDI, M.C.S. & MODESTO, I.F. 22. Tropicl fruit trees s bioindictors of industril ir pollution in southest Brzil. Environment Interntionl 28: MUGGLI, R Free rdicls tissue dmge: the protective role of ntioxidnt nutrients. In Free rdicls nd ntioxidnts in nutrition (F. Corongiu, S. Bnni, M.A. Dessi & C. Rice-Evns, eds.). Richelieu Press, London, p OSSWALD, W.F., KRAUS, R., HIPPELI, S., BENZ, B., VOLPERT, R. & ELSTNER, E.F Comprison of the enzymtic ctives of dehydroscorbic cid redutse, glutthione redutse, ctlse, peroxidse nd superoxide dismutse of helthy nd dmged spruce needles (Pice bies (L.) Krst). Plnt Physiology 139:

10 696 P. Bulbovs et l.: Antioxidntes folires em C. echint RANK, B Oxidtive stress response nd photossystem efficiency in trees of urbn res. Photosynthetic 33: RIVERO, R.M., RUIZ, J.M. & ROMERO, L. 24. Oxidtive metbolism in tomto plnts subjected to het stress. Journl of Horticulturl Science & Biotechnology 79: ROCHA, Y.T. 24. Ibirpitng: históri, distribuição geográfic e conservção do pu-brsil (Ceslpini echint Lm. Leguminose) do descobrimento à tulidde. Tese de doutordo. Universidde de São Pulo, São Pulo. SPEEK, A., SCHRIJVER, J. & SCHREURS, W.H.P Fluorometric determintion of totl vitmin C nd totl isovitmin C in foodstuffs nd beverges by highperformnce liquid chromtogrphy with precolumn derivtiztion. Journl of Agriculturl Food Chemistry 32: TAKAC, T. 24. The reltionship of ntioxidnt enzymes nd some physiologicl prmeters in mize during chilling. Plnt Soil nd Environment 5: ZHOU, R. & ZHAO, H. 24. Sesonl pttern of ntioxidnt enzyme system in the roots of perennil forge grsses grown in lpine hbitt, relted to freezing tolernce. Physiologi Plntrum 121: