HEMOGLOBINOPATIAS. Abordagem Laboratorial
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- Nicolas Gil Tomé
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1 HEMOGLOBINOPTI bordagem Laboratorial Hemoglobina hemoglobina é uma metaloproteína globular tetramérica. adeia erro (e 2+ ) Grupo heme heme adeia β duas subunidades tipo e duas tipo não- Glóbulo Vermelho adeia β adeia quatro grupos heme (grupo prostético) Representação da estrutura de uma molécula de hemoglobina.
2 Hemoglobinas humanas nos diferentes períodos do desenvolvimento Estadio de desenvolvimento Hemoglobinas Embriónico etal dulto Hb Gower I ( ζ 2ε 2 ) Hb Gower II ( 2ε 2 ) Hb Portland ( ζ 2γ 2 ) Hb ( 2 G ou γ 2 ) Hb ( 2β 2 ) Hb 2 ( 2δ 2 ) Hemoglobinas humanas na vida adulta Hemoglobina Hb Hb 2 Hb cadeias 2 β 2 2 δ 2 2 γ 2 percentagem 96 a 98 % da Hb total 2 a 3, % da Hb total < % da Hb total Hemoglobinopatias s hemoglobinopatias resultam de mutações que afectam os genes responsáveis pela síntese das cadeias de globina da hemoglobina. Quantitativas: diminuição ou ausência de síntese de uma ou mais cadeias de globinatalassemias Qualitativas: dão origem a variantes estruturais das hemoglobinas (ex: Hb, Hb, Hb D) 2
3 s hemoglobinopatias constituem as alterações monogénicas mais comuns. Em 995, estimativas da OM, indicaram que cerca de 6% da população mundial é portadora de uma hemoglobinopatia. s hemoglobinopatias são transmitidas à descendência segundo um padrão autossómico recessivo Normal em 4 (25%) Portadores 2 em 4 (5%) Doente em 4 (25%) O sector de hemoglobinopatias da ULR: Rastreios - identificação de portadores Detecção de casais em risco onfirmação de diagnóstico Participação em programas externos de avaliação da Qualidade ( NEQ e PNEQ) olaboração em projectos de investigação ormação e ensino 3
4 Metodologias utilizadas na caracterização analítica do fenótipo: Técnicas electroforéticas ticas: ocagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida Técnicas cromatográficas ficas: HPL de troca catiónica HPL de fase reversa das cadeias de globina Estudos funcionais da Hb Teste de solubilidade da Hb Teste de estabilidade - Teste do isopropanol Pesquisa de corpos de inclusão de Hb H Estudos de afinidade para o O 2 ocagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida focagem isoeléctrica é uma técnica de electroforese em gel de poliacrilamida, a potência constante e em gradiente estável de ph, e que permite a separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico. Permite detectar Hb Hb D Punjab Hb Hb E Hb Lepore Método com boa resolução eparação Hb da Hb Detecção variantes de Hb raras 4
5 ocagem isoeléctrica em gel de poliacrilamida Hb D Hb Hb Lepore Hb Hb E HPL de troca catiónica É uma técnica cromatográfica que separa as hemoglobinas com base na sua carga global e no seu comportamento ácido-base. É um método m de escolha para quantificar fracções normais e fracções anómalas: Quantificação relativa dos níveis de Hb 2 Quantificação relativa dos níveis de Hb Hb 2 (%) Quantificação relativa de variantes estruturais da Hb Identificação presuntiva de variantes de Hb intervalos de tempos de retenção previamente estabelecidos: Hb, Hb D, Hb, Hb E. Hb (%) 5
6 romatografia Líquida de lta Eficiência de ase Reversa - RP-HPL Leone et al (985) e Wacjman et al (22) ase estacionária oluna Lihrospher RP-8 (Merck) : partículas de sílica, ligadas através de grupos silanol a cadeias hidrocarbonadas (8) ase móvel Tempo (min) cetonitrilo (ml) Metanol (ml) NaL,55M ph 2,7 (ml) H 2 O desionizada (ml) 3, 3,2 3, 7, ,2 9,6 3, 4,2 eparação em Gradiente:75min., fluxo,7 ml/min Representação do equipamento HPL Detector UV : 25 nm romatografia Líquida de lta Eficiência de ase Reversa Mecanismo de retenção envolve: Interacções hidrofóbicas entre as cadeias hidrocarbonadas fase estacionária com as regiões de baixa polaridade do soluto separação das cadeias de globina é baseada essencialmente na sua diferença de hidrofobicidade. 6
7 romatografia Líquida de lta Eficiência de ase Reversa Identificação presuntiva de variantes estruturais da hemoglobina - tempos de retenção relativos -TRR Quantificação das variantes estruturais Identificação do tipo de cadeia globínica variante ( ou não-) Detectar variantes de hemoglobina neutras mu 4 VWD, Wavelength=25 nm (GLOBIN\7GO92.D) β valiar, na presença de níveis de Hb aumentados, as cadeias G γ, γ I, γ T da Hb heme HPL fase reversa das cadeias de globina δ γ Ι min Estudos de afinidade da hemoglobina para o O2 istema automático que permite determinar a curva de dissociação do O 2 da oxihemoglobina. Hemox nalyzer curva de dissociação da oxihemoglobina relaciona a % de hemoglobina saturada com oxigénio com a pressão parcial de O 2 em contacto com o sangue. 7
8 Eritrograma com índices eritrocitários VGM < 8 fl HGM < 27 pg (e/te) x >6% luxograma do diagnóstico laboratorial Banda IE zona Hb ocagem isoeléctrica Banda IE Quantificação da Hb 2 HPL troca catiónica + Quantificação da Hb HPL troca catiónica Hb 2 Hb N ou Portador β talassémia (estudos familiares e estudo do cônjuge ) Hb 2 N ou Hb N uspeita portador talassémia e HGM<25pg uspeita portador talassémia Hb 2 Hb uspeita δβ talassémia (estudos familiares e estudo do cônjuge ) Teste solubilidade-hb + HPL troca catiónica T = positivo + TRR de acordo com Hb Identificação presuntiva Hb (estudos familiares e estudo do cônjuge ) T = negativo Identificação presuntiva HbD Identificação presuntiva Hb Lepore HPL troca catiónica + Estudo cadeias e globina RP-HPL Identificação presuntiva, Hb, HbE cadeia ou β Biologia molecular DG Portador de β-talassemia exo masculino adulto caucasiano Hemograma Hb=2,6 g/dl G.V.=6,2x 2 /L Ht=,386 L/L VGM=62,2 fl HGM=2,3 pg HGM=32,6 g/dl RDW=6,4% controlo romatografia de troca catiónica ocagem Isoeléctrica % Hb 2 =4,3 %Hb 2 =5, %Hb 2 = 5,4 8
9 exo feminino 33 anos Portador de Hb Hemograma Hb=2,4 g/dl G.V.=4,52x 2 /L Hct=,379 L/L VGM=83,9 fl HGM=27,5 pg HGM=32,7g/dL RDW=3,7% ocagem Isoeléctrica ocagem Isoeléctrica Hb controlo romatografia de troca catiónica Teste de solubilidade: Positivo % Hb = 33,8 Hb janela / 37,5% exo feminino adulto Portador de Hb D Hemograma ocagem Isoeléctrica Teste de solubilidade: Hb=3,2g/dL G.V.=4,7x 2 /L Hb D Hct=,399 L/L VGM=98, fl HGM=32,5pg HGM=33, g/dl RDW=2,3% controlo Negativo romatografia Hb D= 37,% β D-Punjab β Área = 37,25 Área não = 378,854 Variante Hb cadeia β TRR= tr β x / tr β Heme δ Hb D -Punjab = 4,9% HPL troca catiónica da hemoglobina HPL fase reversa das cadeias de globina 9
10 exo masculino 44 anos Hemograma Hb=4,5 g/dl G.V.=5,6x 2 /L Hct=,48 L/L VGM=74,5 fl HGM=25,2 pg HGM=33,8 g/dl RDW=3,3% Portador de Hb E controlo ocagem Isoeléctrica romatografia % Hb E=29,8 Hb E elui na janela Hb 2 Hb E Heme β E β Área = 399,354 Área não = 396,737 Variante Hb cadeia β TRR= tr β x / tr β δ Hb E = 23,% HPL troca catiónica da hemoglobina HPL fase reversa das cadeias de globina Variantes de hemoglobina raras e neutras Métodos usados para a detecção de variantes de Hb: ocagem isoeléctrica ou electroforese HPL de troca catiónica Estas técnicas não detectam variantes neutras. cromatografia liquida de alta eficiência de fase reversa pode ser usada para detectar e quantificar, este tipo de variantes, que diferem apenas na sua hidrofobicidade.
11 Variantes de hemoglobina raras e neutras Hb Malmö /Hb Palmela exo masculino 4 anos Eritrocitose Hemograma Hb= 7.2 g/dl G.V.= 5,36x 2 /L Hct=,53 L/L VGM= 93.9 fl HGM= 32. pg HGM= 34.2 g/dl RDW= 2.4% controlo ocagem Isoeléctrica Hb Malmö β β X adeia beta variante 47.5% Hb Malmö heme δ x adeia alfa variante 2.6% Biologia molecular DG HPL fase reversa das cadeias de globina Hb Malmö /Hb Palmela mutação no codão 5 (G>GT) do gene alfa causa a substituição da alanina por valina na posição correspondente na cadeia alfa globina Variante de hemoglobina assintomática: tica: Hb Palmela: substituição da alanina por valina minoácidos com cadeias laterais alifáticas de tamanho similar que não parecem alterar a geometria da região lanina Eritrocitose: Hb Malmö (afinidade para o O 2 aumentada) Valina Estudos familiares: pai e irmão,heterozig, heterozigóticosticos para Hb Palmela- fenótipos hematológicos normais
12 Variantes de hemoglobina raras e neutras Hb Loves Park anemia microcítica, hipocrómica exo/ idade RB ( 2 /L) Hb (g/dl) Hct (L/L) MV (fl) M/2 anos heme β β X Área = 32,22 Área não = 3,98 Variante Hb cadeia β 48.4% MH (pg) MH (g/dl) RDW (%) δ Biologia molecular DG HPL fase reversa das cadeias de globina Variantes de hemoglobina raras e neutras Hb Loves Park Leucina fenilalanina - posição 68 da cadeia β globínica ão ambos aminoácidos hidrofóbicos (substituição de um aa por outro com uma cadeia lateral igualmente neutra) difícil detecção enilalanina adeia lateral maior dimensão Posição interna- bolsa heme Diminuição da afinidade para O 2 2
13 PNH - Janeiro Julho 29 asuística stica de portadores de hemoglobinopatias -PNH- Janeiro - Julho 29 R Nº de rastreios Total rastreios positivos % rastreios positivos Nº casais em risco Lisboa ,5 3 lgarve , lentejo ,9 Leiria 3 7,7 Total , Nº total rastreios Nº rastreios positivos asais em risco Nº amostras Lisboa lgarve lentejo Leiria R asuística stica de portadores de hemoglobinopatias -PNH- Janeiro - Julho 29 PNH - Janeiro Julho 29 asuística stica de portadores de hemoglobinopatias PNH Janeiro - Julho 29 R Nº de rastreios Total rastreios positivos % rastreios positivos Port β tal % Port β tal Port Hb % Port Hb Outras var Hb % Outras var Hb Lisboa ,5 3,3 24 5,8 lgarve , 39 7,3 2 9,3,4 lentejo ,9 8 4,7 5 3, 2,2 Leiria 3 7,7, 7,7 Total ,7 5 6, 5 6, 4,5 Nº de casos Total rastreios positivos Port b tal 39 Port Hb Outras var Hb Lisboa lgarve lentejo Leiria R % de casos 3, 25, 2, 5,, 5,,,4 % Outras var Hb 9,3 % Port Hb % Port b tal,2 7,3 3, 7,7 5,8 4,7,3 Lisboa lgarve lentejo Leiria R asuística stica de portadores de hemoglobinopatias -PNH- Janeiro - Julho 29 asuística stica de portadores de hemoglobinopatias -PNH- Janeiro - Julho 29 3
14 Hemoglobinopatias - Janeiro Julho 29 asuística stica de portadores de hemoglobinopatias PNH Janeiro - Julho 29 Nº Total de rastreios Nº rastreios positivo % Positivos Port b tal % Port b tal Port Hb % Port Hb total outras var Hb %outras var Hb lfa tal Utentes- IN ,2 4 7,5 6 8,6 4 2, 39 IN (DG; IJM) ,4 2 9,7 7,5 2 3,3 Hospitais ,3 2 3,8 2,8 2 3,8 28 Lab Privados , 9,3 5 8,8 8 4, Total ,3 39,9 39,9 6 4, Nº Total de rastreios Nº rastreios positivos 45, 4, % Port b tal % Port Hb %outras var Hb Nº de amostras Utentes- IN IN (DG, GMJM) Hospitais Lab Privados % de casos 35, 3, 25, 2, 5,, 5,, 4, 3,3,5 3,8 8,8 2, 2,8 8,6 9,7 9,3 7,5 3,8 Utentes- IN IN (DG; IJM) Hospitais Lab Privados asuística stica de portadores de hemoglobinopatias -PNH- Janeiro - Julho 29 asuística stica de portadores de hemoglobinopatias -PNH- Janeiro - Julho 29 Variantes de hemoglobina: Hb,Hb D, Hb Lepore, Hb Lisbon, Hb N-Baltimore, Hb Malmö, Hb Porto legre Perspectivas futuras: referência creditação de ensaios NP EN IO589 / 595 Utilização de materiais de referência, doseamento Hb 2 Utilização da espectrometria de massa (LMM): Método de referência doseamento da Hb 2 4
15 gradecimentos: Departamento de Promoção da aúde e Doenças rónicas Departamento de Genética 5
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