Hemoglobinopatias : contributo da Genética M olecular

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1 Dia do ISA A Referência: Função essencial do ISA Hemoglobinopatias: contributo da Genética Molecular João Gonçalves Genética Molecular Lisboa Departamento de Genética joao.goncalves@insa.min-saude.pt DEPARTAMETO DE GEÉTICA úcleo de Apoio Genética Médica Unidade de Citogenética Genética Molecular Bioquímica Genética Rastreio eonatal Tecnologia e Inovação Investigação e Desenvolvimento Lab. Lisboa João Gonçalves Lab. Porto Rosário Santos 1

2 Departamento de Promoção da Saúde e Doenças Crónicas Cooperação/ partilha de resultados e de conhecimentos > Hemoglobinopatias Unid. Lab. de Referência > Médico Solicita Análise < Hospital Serviço Hematologia Serviço Genética Centro DP Lab. Análises Clínicas Cons. Privado Identif. Molecular HB variante Identif. Molecular Talassémia > Portador < Cooperação/ partilha de resultados e de conhecimentos Contributo > Doente da < Genética > Casal em Risco, DP < >>> Molecular Avaliação Hematol. integra-se e Bioq.<<< no Programa acional Cooperação/ de Controlo das partilha de resultados e de conhecimentos hemoglobinopatias Departamento de Genética Unid de Genética Molecular Lisb. Hemoglobinopatias (Genética Molecular) Cooperação/ partilha de resultados e de conhecimentos Departamento de Genética Investigação e Desenvolv. > Grupo de Investigação em hemoglobinopatias e metab. Ferro Cooperação/ partilha de resultados e de conhecimentos Prevalência de portadores de betatalassémia na pop. Portuguesa Prevalência de portadores de hemoglobina S na pop. Portuguesa Martins MC et al (1993) Hereditary anaemias in Portugal: epidemiology, public health significance, and control. J Med Genet 30: (15208 indivíduos : βtal:0,45%; HbS: 0,32%) Base Científica para o Programa acional de Controlo das Hemoglobinopatias, 1986 (PCH) Cooperação com a OMS Coordenação do ISA DGS: Circ orm º 18/DSMIA de 07/09/2004 Objectivos: - Prevenção > Diagnóstico > Idef. Casais em risco > Aconselhamento Genético > DP molecular - Tratamento - Investigação 2

3 Prevalência de portadores de hemoglobinopatia β em Portugal Bolsas de alta prevalência: 5-10% População (2006): 10,9 x 10 6 ascimentos (2007): 102 x 10 3 Prevalência (global) de portadores: 1-2% HbS β-talassémia Inez et al, Arq ISA 1993, 19:27 Incidência: 5-10 casos/ano SS, Sβ-Tal, β-talβ-tal DP de Hemoglobinopatias de 1990 a Set2009 Doença ormal Portador Afectado Total Drepanocitose (75,4%) Tal-Drepanocitose (8.2%) Talassémia (16.4%) Total

4 Agrupamento génico da β globina (11p15.5) 5 ε Gγ Aγ ϕβ δ β 3 5 pb Cd Gene: HBB CD 6: GAG>GTG (c.20a>t) p.glu6val Hb S Diagnóstico molecular de Drepanocitose - Metodologias Análise Molecular: - Amostras de DA dos pais (SE; casal PCH) - DA fetal analisado em duplicado (LA; VC) - Dois métodos de análise molecular (independentes). - Pesquisa de contaminação materna do DA fetal (VTRs) - Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio 1. PCR e Restrição Enzimática (Bsu 36 I) Mutação: c.20a>t (p.glu6val) 2. BI-PASA (PCR bidireccional específica de alelo) Mutação: c.20a>t (p.glu6val) 390 pb Dig. Bsu 36 I: Mutação : 390 pb Alelo ormal: 213 e 177 pb C 300 pb M 800 pb 500 pb f m f M C M AS SS AS SS AS AA AA AA SS AS AA controlos 4

5 Sequenciação automática de fragmentos de DA obtidos por PCR (c.20a>t) p.glu6val Hb S GAG>GTG DP de Drepanocitose Análise Molecular: - Amostras de DA dos pais (SE; casal PCH) - DA fetal analisado em duplicado (LA; VC) - Dois métodos de análise molecular (independentes). - Pesquisa de contaminação materna do DA fetal (VTRs) - Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio Portador de Hb S Mutação: c. [20A>T] + [=] (p.glu6val) Portadora de Hb S Mutação: c. [20A>T] + [=] (p.glu6val) Mutação: c.20a>t (p.glu6val) c.[20a>t] + [20A>T] Feto não possui alelo c materno a b c Pesquisa de contaminação materna no DA fetal: VTR (DXS52) pai mãe feto feto C. eg MPM 5

6 DP de Drepanocitose Análise Molecular: - Amostras de DA dos pais (SE; casal PCH) - DA fetal analisado em duplicado (LA; VC) - Dois métodos de análise molecular (independentes). - Pesquisa de contaminação materna do DA fetal (VTRs) - Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio ão foi possível fazer o estudo do marido desconhecendo-se se tem anemia. Pai inacessível. atural de S. Tomé e Príncipe C/ Anemia (Hb A2:3,6%; Hb S: 35%) Pede-se estudo fetal de hemoglobinopatia Sangue materno (enviado para Lab Hematologia (PCH)) LA; Gestação de 16 semanas ão foi possível fazer o estudo do marido desconhecendo-se se tem anemia. Inacessível atural de S. Tomé e Príncipe (Hemog: 11,3 g/dl; VGM: 86,0 fl; HGM: 28,9 pg) Hb F: 2,0%; Hb C:38,0%) Pede-se estudo fetal de hemoglobinopatia LA; Gestação de 16 semanas: Afectado Hb SC HbC HbS Feto: Heterozigótico composto para as mutações HBB:c.19G>A (HbC); p.glu6lys e HBB:c.20A>T (HbS); p.glu6val 6

7 DP Análise Molecular: - Amostras de DA dos pais. - DA fetal em duplicado. - Dois métodos de análise molecular (independentes). - Pesquisa de contaminação materna do DA fetal (VTRs) - Utilização dos controlos necessários que nos permite a validação interna de cada ensaio Confirmação hematológica e bioquímica Portador de Hb S Confirmação hematológica e bioquímica Portadora de Hb S Mutação: c. [20A>T] + [=] f P M f C MP Despiste de contaminação materna do DA fetal (VTR) p 1 m p 2 STR mãe feto Pai AMGX AMGY D3S1358 Feto: 6/9 alelos não se encontram no (pai) D8S1179 D5S818 vwa12p12 D21S11 D13S317 FGA 4q28 D7S820 D18S51 7

8 DP Análise Molecular: - Amostras de DA dos pais. - DA fetal em duplicado. - Dois métodos de análise molecular (independentes). - Pesquisa de contaminação materna do DA fetal (VTRs) Confirmação hematológica e bioquímica Portador de Hb S Confirmação hematológica e bioquímica Portadora de Hb S Mutação: c. [20A>T] + [=] f P M f C MP Despiste de contaminação materna do DA fetal (VTR) p 1 m p 2 Portador de Hb S Portadora de Hb S Sequenciação completa do gene HBB 8

9 Diagnóstico e prevenção de hemoglobinopatia LAB Portador População Caso-índice LAB Rastrear parceiro LAB Rastreio (doentes e portadores) STOP Portador Aconselhamento S S LAB Doente Portador História familiar STOP Amniocentese ou biópsia do córion DP-LAB S DP STOP STOP Afectado S IVG S IVG STOP Lab./Unidade Genética Molecular - Qualidade/Referência DP de Hemoglobinopatia - Recepção de produtos Biológico (colheitas) > Registos - Extracção de DA (diferentes métodos) > Dif. produtos biológ. (SP; LA; Vil.) - Diferentes métodos de análise > PCR - Dig. enzimática Validação > BI-PASA interna dos > ARMS resultados > Sequenciação Lab. Referência - Leitura e Interpretação dos resultados por TDT e TSS - Registo de resultados - Validação final/global dos resultados - Elaboração de relatórios directivas internacionais - Participa em ensaios de avaliação externa da qualidade 9

10 H em oglobinopatias :Contributo da Genética M olecular - Função Referência - Experiência e o conhecimento acumulado ao longo dos anos necessário à função referência - Frequência regular de cursos/acções de formação específicas patologia no âmbito da AEQ - Acreditação do Laboratório/ensaios rio/ensaios específicos de determinado teste genética molecular - Utilização de métodos/ensaios validados; Validação interna de resultados - Participação em reuniões internacionais de AEQ onde se estabelecem as directivas/recomendações UE - Participação em exercícios de avaliação externa da qualidade (UK EQAS; 2002) - Formação no âmbito das actividades de prestação de serviços a profissionais de saúde e ensino Sec. Sup. - Colaboração próxima com laboratório de nível 2 que permite resolver casos complexos - Actuação como consultor/licenciamento Lab. para a validação de testes genéticos > Lab nível 2 - Colabora em investigação no âmbito do diagnóstico molecular em causa > Lab nível 2 - Organiza cursos/congressos AEQ/acções de formação de boas práticas laboratoriais a nível nacional >Ln2 Prioridade Acreditação do Laboratório/ensaios rio/ensaios específicos de determinado teste genética molecular > Estabilização das equipas; solucionar necessidades de pessoal > Reorganização de espaços/obras (cumprir directivas internacionais) > Reparação de equipamento/substituição equipamento obsoleto > Actualização dos procedimentos; Impressos e Instruções trabalho > Operacionalidade do Programa Informático > Aquisições de consumíveis 10

11 AGRADECIMETOS > Susana Gomes > Todos os elementos do Departamento de Genética > Todos os elementos do Dep. Prom. Saúde e Doenças Crónicas > Médicos > Utentes 11