Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2009/2010. Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano
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1 Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2009/2010 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO 5ª AULA PRÁTICA Doseamento da concentração plasmática de ácido úrico
2 ÁCIDO ÚRICO O homem é um animal ureotélico, uma vez que o ácido úrico é o produto final do catabolismo das bases púricas: adenina (6-aminopurina), guanina (2-amino-6-oxipurina), hipoxantina (6-oxipurina) e xantina (2,6-dioxipurina). Outras xantinas de origem exógena, como a cafeína, a teofilina e a teobromina (presentes, respectivamente, no café, no chá e no chocolate) dão origem ao ácido úrico. Tanto os nucleótidos púricos como os pirimídicos têm outras funções para além de serem precursores dos ácidos nucleicos, DNA e RNA. Assim, os nucleótidos de purina são fonte de energia (ex: ATP), participam na sinalização intra e extracelular (ex: camp e cgmp, que actuam como segundos mensageiros) ou funcionam como dadores de grupo metilo (Sadenosilmetionina). Os nucleótidos de pirimidina podem ser usados como intermediários de alta energia (ex: UDP-glucose, UDP-galactose, CDP-acilglicerol -síntese dos lípidos). Os nucleótidos são ésteres fosforilados dos nucleósidos em um ou mais grupos do açúcar. O nucleósido é uma base ligada a um açúcar (D-ribose ou 2-desoxirribose). O único açucar que se liga ao uracilo é a ribose e o único açucar que se liga à timina é o 2- desoxirribose. Os nucleósidos púricos são: - Adenosina (adenina + D-ribose) e desoxiadenosina (2-desoxirribose em vez da ribose); - Guanosina (guanina + D-ribose) e desoxiguanosina (idem). Os nucleósidos pirimídicos são: - Citidina (citosina + D-ribose) - Uridina (uracilo + D-ribose) - Timidina (timina + 2-desoxirribose) As bases mais importantes: Pirimidinas: - Citosina (C): 2-oxi-4-aminopirimidina - Timina (T): 2,4-dioxi-5-metilpirimidina - Uracilo (U): 2,4-dioxipirimidina Purinas: - Adenina (A): 6-aminopurina - Guanina (G): 2-amino-6-oxipurina, e - Hipoxantina: 6-oxipurina - Xantina: 2,6-dioxipurina Outras xantinas: Cafeína, Teofilina, Teobromina 1
3 O produto final da biossíntese das bases púricas é o IMP, que é convertido em AMP e GMP. Os derivados das bases púricas não são incorporados directamente nos ácidos nucleicos ou coenzimas, mas através de intermediários. As purinas do nosso organismo têm fundamentalmente duas origens: i) catabolismo das nucleoproteínas endógenas e alimentares (reciclagem); ii) síntese de novo das purinas (purinossíntese de novo). iii) Na nossa alimentação existem alimentos ricos em purinas, nomeadamente as vísceras dos animais, a carne de animais jovens e os mariscos. Noutros alimentos, a concentração das purinas é baixa, como acontece nos ovos, leite e queijo. No organismo humano, a maioria das purinas ingeridas são convertidas em ácidos nucleicos. As nucleoproteínas ingeridas sofrem a acção de enzimas proteolíticas do intestino e ribonucleases e desoxirribonucleases do suco pancreático. As cadeias polinucleotídicas libertadas são o substrato de polinucleotidases e fosfoesterases, dando origem aos nucleótidos. Estes sofrem a acção de nucleotidases e fosfatases. As bases púricas podem, assim, ser absorvidas sob a forma de nucleósidos ou oxidadas a ácido úrico (Fig. 1). Da hipoxantina derivam a adenina, por aminação em C 6, e a xantina, por oxidação em C 2. A partir da xantina forma-se o ácido úrico, por oxidação em C 2 e C 8. A forma predominante do ácido úrico é determinada pelo ph do meio. O pk do protão do N 9 é 5,75 e o do N 1 é de 10,3. Assim: se ph< 5,75 predomina a forma não ionizada: ácido úrico; se ph = 5,75 [ácido úrico] = [urato de sódio]; se ph > 5,75 predomina a forma ionizada (urato em solução). No sangue (ph=7 e sendo o Na + o catião mais abundante), o ácido úrico existe na forma de sal monossódico: urato de sódio. Como o sal de ácido úrico é muito pouco solúvel; quando a concentração de ácido úrico aumenta (concentração plasmática de ácido úrico > 7 mg/dl), este sal pode precipitar. Síntese de novo Purinas Dieta Ácidos nucleicos alimentares Degradação endógena Catabolismo das nucleoproteínas Nucleótidos Purina 2
4 Degradação 1/3 Intestino Uricólise Ácido úrico Excreção renal 2/3 Ácido úrico CO 2 + NH 3 (Bactérias) Filtração glomerular: 100% Excreção Reabsorção tubular proximal: 99% Secreção tubular distal: 50% Reabsorção tubular distal: 40% Excreção: 10% Figura 1- Origem e vias de eliminação do ácido úrico. Vias de eliminação do ácido úrico: - eliminação renal (2/3) - uricólise intestinal (1/3). A excreção renal de ácido úrico aumenta com o aumento da taxa de filtração glomerular e diminui (aumento da uricémia) na insuficiência renal crónica, com taxas de filtração glomerular < 20 ml/min/1,73m 2 (N=120). Normalmente, só 30% do urato excretado é proveniente da dieta. 3
5 HIPERURICÉMIA O ácido úrico é o produto final do metabolismo das purinas, as quais podem ter duas origens: catabolismo das nucleoproteínas (endógenas ou alimentares), ou a síntese de novo, das purinas (Fig. 1). O excesso de ácido úrico pode originar doença, devido à sua deposição tecidular (ex. Gota) que corresponde à inflamação e consequente lesão, nos locais de acumulação. As fontes alimentares de purinas são várias: carnes de animais jovens, mariscos, anchovas, mioleiras, fígado, sardinhas, conservas, etc. As bebidas alcoólicas têm também papel importante na fisiopatologia da doença, por condicionarem aumento de produção e diminuição da excreção (bebidas alcoólicas em geral). A cerveja em particular, além deste mecanismo, tem um elevado teor de purinas. Após a sua produção, cerca de 2/3 do ácido úrico é eliminado pelo rim (250 a 750 mg/dia), sendo o restante, cerca de 1/3, eliminado pelo intestino. O ácido úrico serve também como uma forma de eliminação de azoto. No rim, após a filtração glomerular, 99% são reabsorvidos no túbulo proximal, sendo depois secretados 55% no túbulo contornado distal, ocorrendo aqui nova reabsorção de 40 %. No final, são excretados cerca de 10 % de todo o filtrado glomerular. De todos os uratos excretados, só 30 % pertencem à dieta, sendo os restantes de origem endógena. Normalmente a mulher pré-menopáusica tem taxas de excreção de ácido úrico superiores às do homem, sendo semelhantes nos dois sexos, após a menopausa. A hiperuricémia define-se pelo nível plasmático de ácido úrico acima de 7,0 mg/dl, e pode resultar de: (1) aumento na produção; (2) diminuição na eliminação (renal) ou (3) conjugação de ambas. Quimicamente, fala-se de hiperuricémia quando a concentração plasmática de urato excede os limites de solubilidade do urato monossódico. Sendo um produto final do metabolismo das purinas, o ph do meio influencia a solubilidade do ácido úrico, tal como referimos anteriormente. Sendo o sal de ácido úrico pouco solúvel, quando aumenta a sua concentração pode haver precipitação, o que ocorre habitualmente para valores plasmáticos superiores a 7,0 mg/dl. A hiperuricémia é mais frequente nos indivíduos de sexo masculino. A hiperuricémia pode ser classificada de acordo com a etiologia ou com o mecanismo fisiopatológico. 4
6 Etiologicamente, as hiperuricémias podem ser: 1. Primárias: Idiopáticas (causa desconhecida); Défice de hipoxantina-guanina fosfo-ribosiltransferase (HGPRT); Aumento da actividade de fosfo-ribosilfosfatase. 2. Secundárias: Insuficiência renal; Doenças com elevado turnover celular (neoplasias, doenças; mieloproliferativas, crises blásticas, anemias hemolíticas, etc); Sarcoidose; Obesidade; Intoxicação por chumbo; Drogas (citotóxicos usados na quimioterapia para tratamento de neoplasias, diuréticos, pirazinamida, etambutol, etanol, etc). Quando ocorre uma subida dos valores séricos da uricémia, e ultrapassados os limites de solubilidade do urato plasmático, ocorre precipitação do mesmo. Os orgãos mais atingidos são habitualmente as articulações e o rim, podendo ser afectados outros locais como os lóbulos das orelhas. Nas articulações ocorre depósito de cristais de ácido úrico quando há hiperuricémia de longa duração. Após a sua fragmentação, são fagocitados pelos lisosomas, com lesão subsequente das membranas destes organelos e libertação para o espaço articular de mediadores de inflamação. Este facto origina um processo inflamatório, normalmente de tipo agudo. Classicamente, a primeira articulação a mostrar sinais de doença é a MTF (metatarso-falângica) do 1º dedo do pé (dor conhecida como podagra e muitas vezes acompanhada de febre, mas de origem química e não infecciosa). Posteriormente, outras articulações podem ser afectadas, como o joelho, os cotovelos, etc. Os tofos gotosos são sinais visíveis da doença e consistem em depósitos de ácido úrico no tecido celular sub-cutâneo. São encontrados nos lóbulos das orelhas, mas surgem frequentemente nas extremidades (mãos e pés). No rim, simultaneamente com a deposição de cristais de ácido úrico e consequente nefropatia úrica, há tendência para a formação de cálculos, o que pode originar crises de cólica renal. Acompanhando a deposição progressiva no rim, surge perda progressiva da função renal, a qual por seu lado, pode também ser causa de hiperuricémia. 5
7 Tratamento: O tratamento da hiperuricémia assenta em duas vertentes, a farmacológica e a dietética, podendo considerar-se o tratamento de fundo e o da crise. 1. Tratamento de fundo: MEDIDAS DIETÉTICAS: Diminuição da ingestão de alimentos ricos em purinas Reforço da hidratação oral Ingestão de águas bicarbonatadas, ou mesmo toma de bicarbonatos, com controlo rigoroso do ph urinário, (úteis na medida em que favorecem a solubilização do ácido úrico, facilitando a sua eliminação). MEDIDAS FARMACOLÓGICAS: Diminuição da síntese do ácido úrico: alopurinol (inibidor da xantina-oxidase; Fig. 2); Aumento da excreção renal, com recurso a medicamentos que aumentem a excreção. Nos doentes que já apresentem uma taxa de excreção aumentada, são de pouca utilidade e naqueles que sofram de litíase (cálculos) renal úrica, a estratégia mais correcta é a inibição da síntese. Nos casos em que existem tofos gotosos muito exuberantes, pode haver necessidade de cirurgia para a sua extracção. 2. TRATAMENTO DA CRISE: Colchicina Anti-inflamatórios (não esteroides) Analgésicos Repouso 6
8 GMP AMP Guanosina IMP Adenosina deaminase 5 -Nucleotidase Guanina Guanase Inosina Hipoxantina Purina nucleósido fosforilase Xantina Xantina oxidase Xantina oxidase Ácido Úrico Urina Figura 2- Degradação das purinas. O alopurinol inibe a síntese de ácido úrico, pois inibe a enzima xantina oxidase. 7
9 MÉTODOS DE DOSEAMENTO DO ÁCIDO ÚRICO: - Reagente de Folin e Denis é um método baseado na coloração que o ácido produz após redução daquele reagente. Apesar de ser um método rápido, cómodo e aplicável ao sangue e urina, não é um método específico, uma vez que os derivados purínicos e os cromogéneos não uráticos falseiam o resultado, reagindo eles também com o reagente de Folin e Denis. - Método Enzimático o ácido úrico é convertido em alantoína e peróxido de hidrogénio por acção da enzima uricase. Por acção da peroxidase, o H 2 O 2 oxida o ácido 3,5- dicloro-2- hidroxibenzenosulfónico e a 4-aminofenazona para formar a quinoneimina, um composto corado e detectado por espectrofotometria do visível: uricase 1) Ácido úrico + O H 2 O Alantoína + CO 2 + H 2 O 2 peroxidase 2) H 2 O 2 + Ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibenzenosulfónico + 4-aminofenazona N-(4- antipiril)-3-cloro-5-sulfonato-p-benzo-quinoneimina. A determinação quantitativa da eliminação do ácido úrico na urina tem pouco valor clínico e só tem interesse se se conhece o valor das bases púricas da dieta ou se se estabelece uma dieta pobre em purinas (caso interesse quantificar a fracção endógena). 8
10 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II, Mestrado Integrado em MEDICINA, 2009/2010 PROTOCOLO DE BANCADA - 5ª AULA PRÁTICA Doseamento da concentração plasmática de ácido úrico (Uricémia) GRUPOS 1 a 4 Amostra: Soro ou plasma isolado de sangue colhido em heparina ou EDTA. Padrão: Ácido úrico 595 µm (10 mg/dl) Tampão: Hepes (50 mm), ph 7,0 + ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibenzenosulfónico (4 mm) Reagente enzimático: 4-Aminofenazona (0,25 mm) + Peroxidase (1000 U/l) + Uricase (200 U/l) Solução de Trabalho (proteger da luz): Reconstituição do Reagente enzimático com a solução Tampão. Estabilidade: 5 dias a 15-25ºC ou 21 dias a 2-8ºC. Preparação dos tubos: Tubos Amostra Padrão Solução de trabalho 1 Padrão - 20 µl 1 ml 2 Amostra 20 µl - 1 ml 3 Branco ml Misturar e incubar durante 5 minutos a 37ºC ou 15 minutos à temperatura ambiente. Ler a absorvância da amostra e do padrão, contra o branco (zero), a 520 nm. A intensidade de cor é estável durante 30 minutos. Linearidade: O método é linear até uma concentração de 20 mg% ou 1189 µm. Acima deste valor, as amostras deverão ser diluídas (1:2) com NaCl 0,9%. Cálculos: DO (amostra) [Ácido úrico] = DO (padrão) Valores referência: Mulheres: 2,4 5,7 mg% ou µm. Homens: 3,4 7,0 mg% ou µm. X Concentração do Padrão 1
11 NOTA: Concentrações de hemoglobina e bilirrubina até 100 mg% e 20 mg%, respectivamente, não afectam a determinação da concentração de ácido úrico. ATENÇÃO! Algumas soluções (ex. tampão para determinação da uricémia) contêm o conservante azida de sódio, que é tóxico. NOTAS IMPORTANTES SOBRE A AZIDA DE SÓDIO: - Evite ingerir ou o contacto com a pele ou mucosas. - No caso de contacto com a pele, lave imediatamente com bastante água. - No caso de contacto com os olhos e se ingerido, dirija-se ao Centro de Saúde ou Hospital mais próximo. - A azida de sódio reage facilmente com o chumbo ou cobre dos lavatórios/superfície de metal e forma compostos de azida altamente explosivos. - Os tubos contendo azida de sódio devem ser colocados em contentor próprio para resíduos perigosos. - Em caso de derrame, as superfícies de metal deverão ser lavadas com uma solução de 10% de hidróxido de sódio (NaOH) para descontaminação. 2
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